Ứng dụng của HPLC ghép đầu dò điện hóa (HPLC/ECD) để định lượng và xác định hệ số hấp thu phân tử của ANTHOCYANIN trong dịch trích là lobelia

Tạp chí Đại học Công nghiệp ỨNG DỤNG CỦA HPLC GHÉP ĐẦU DÒ ĐIỆN HÓA (HPLC/ECD) ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG VÀ XÁC ĐỊNH HỆ SỐ HẤP THU PHÂN TỬ  CỦA ANTHOCYANIN TRONG DỊCH TRÍCH LÁ LOBELIA Hoàng Thị Kim Khuyên*, Torben Lund** TÓM TẮT Anthocyanin là hợp chất mang màu có nhiều trong hoa quả. Phần lớn chúng có màu đỏ và xanh, ngoài ra cũng có màu cam, tím rất thích hợp cho việc thay thế màu tổng hợp. Ngoài ra, các anthocyanin có khả năng kháng oxy hóa rất mạnh. Đề tài đã dùng phương pháp HPLC/UV/MS để xác định cấu trúc anthocyanin, phương pháp HPLC/UV/ECD để xác định hệ số hấp thu phân tử của anthocyanin từ đó tính được nồng độ của chúng trong dịch trích lá cây Lobelia (Đan Mạch) Từ khóa: Cây bã thuốc Lobelia, anthocyanin, hệ số hấp thu phân tử , sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò điện hóa, đầu dò tử ngoại, đầu dò khối phổ APPLICATIONOFHPLC-UV/VisCOUPLEDWITHECDTOQUANTIFYANDDETERMINE EXTINCTIONCOEFFICIENTOFANTHOCYANINSINLOBELIAEXTRACT SUMMARY Anthocyanins which are much in plants are colorful substances. Almost anthocyanins are red, blue, orange, violet that are suitable to replace artificial colour. Besides, anthocyanins are strong antioxidants. In this thesis we used HPLC/UV/MS to determine the structures of anthocyanin, HPLC/UV/ECD to determine . From then we can quantify their concentration inLobelia extract (from Denmark). Key word: Lobelia, anthocyanin, extinction coefficient , HPLC, ECD, UVD, MSD 1. Giới thiệu Cây Lobelia còn gọi là cây bã thuốc mọc hoang nhiều ở Sapa, Cù Măng Chải (Lào Cai). Dịch chiết lá Lobelia chứa thành phần anthocyanin khá cao. Việt Nam với lợi thế phong phú về hoa quả, việc áp dụng quy trình để xác định hàm lượng anthocyanin trong dịch chiết hoa quả nhằm nâng cao hiểu biết về dinh dưỡng cho người tiêu dùng là điều cần thiết. Chính vì thế, đề tài “Ứng dụng của HPLC ghép Chúng tôi đề nghị phương pháp xác định  của từng anthocyanin trực tiếp khi qua cột sắc ký bằng cách kết hợp phương pháp HPLC-UV/Vis với đầu dò ECD. Diện tích peak UV =     l  C (1) Diện tích peak ECD = F    Vtiêm  C  n (2) Trong đó ,  là hệ số của máy có thể tìm thấy từ nhà sản xuất hoặc tính toán dựa trên chất chuẩn; F là hằng số Faraday = 96500. đầu dò điện hóa ECD để định lượng và xác định hệ số hấp thu phân tử trong dịch chiết lá Lobelia” là hết sức cần thiết. Chia (1) cho (2): DientichUV F  n tiem DientichECD   (3) 2. Mục đích nghiên cứu Do tính chất phức tạp của nhóm anthocyanin và hạn chế về chất chuẩn nên khó khăn để định lượng trực tiếp. Mục đích của đề tài là xác định trực tiếp các anthocyanin từ dịch trích, muốn vậy phải biết chính xác giá trị . Thế vào (1) →C = dientichpeakUV  Muốn tính  từ phương trình (3) thì phải xác định được , , n * Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM ** Trường Đại học Roskidle, Đan Mạch 49 Ứng dụng của HPLC ghép đầu dò điện hóa… 2.1. Xác định các hệ số ,  Diện tích peak ECD = ∫U×dt = R×∫Idt = R × Q =  × n × Vtiêm × F × [C] Hệ số góc =  × n × Vtiêm × F  Diện tích peak UV =     l  [C] Hệ số góc =     l  2.2. Xác định số điện tử trao đổi n Dùng phương pháp kết hợp giữa hai diện tích UV với diện tích ECD để nghiên cứu hoạt tính điện hóa của các anthocyanin 3. Đối tượng, nội dung nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu - Lá cây Lobelia: lá tươi được đông cô chân không, nghiền mịn và chiết anthocyanin bằng cách đánh siêu âm. Máy LC-UV/MS LCQ Deca Cột Phenomenex 502mm kích thước hạt 3micron. Autosample thể tích tiêm 4L cho Lobelia Cardinalis. Nhiệt độ cột bằng với nhiệt độ phòng18oC. Bước sóng đầu dò UV được quét từ 190- 800nm. Các thông số ESI: khí trơ N2 (12 L/phút), bộ khuếch đại tứ cực và bát cực. Bẫy ion phổ khối ở dạng ion dương, m/z quét từ 200-1200. Chương trình gradient cho hệ LC/MS/MS - Hóa chất: Acetonitrile tinh khiết HPLC- grade, Merck (Germany, Darmstadt), Formic acid, MeOH. Nước cất được chuẩn bị trong hệ thống nước tinh khiết (Millipore, Bedford, MA, USA), anthocyanin chuẩn gốc dạng bột. Milli- Q các loại 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.2.1. Chuẩn bị dịch chiết lá Lobelia - Thiết bị: máy siêu âm, Máy HPLC đầu dò UV/Vis kết hợp ECD (hãng Dionex), máy đo quang. Hệ dung môi của sắc ký lỏng Dionex đầu dò UV/Vis kết hợp ECD: Dung môi A: H2O + 178mg/L KCl (2mM) + HCOOH 2.5% Dung môi B: ACN + 2.5% HCOOH Dung môi D: MeOH loại HPLC Thời gian Tốc độ dòng lưu (phút) (mL/phút) -5 78 12 10 1.0 0 78 12 10 1.0 20 78 12 10 1.0 25 68 12 20 1.0 30 48 12 40 0.9 35 8 12 80 1.0 Lá cây được đông cô chân không ở áp suất 0.01mbar, sau hai ngày nghiền mịn bằng cối đá. Cân 10 – 20 mg mẫu trong ống nghiệm, thêm 2 mL MeOH, đậy ống với para-film. Tiếp theo, trộn mẫu bằng máy khuấy để trộn đều với MeOH, sau đó đánh siêu âm 2 giờ (luôn đảm bảo nước lạnh trong bồn siêu âm). Sau khi siêu âm, lấy 1mL cho vào ống để lọc bằng ống PTFE (Whatman polypropylen kích thước lỗ 0.45L). Bảo quản trong tủ lạnh ở -70oC trước khi phân tích. Cô quay đuổi MeOH ở < 30oC, phần cao hòa với nước đã loại ion (de–ionzed MilliQ), sau đó mẫu trích cho qua cột SCX. Dùng dung dịch B (10% HCl, 40% Methanol, 50% H20 ) để rửa giải anthocyanin ra khỏi cột, sau đó định mức tới một thể tích xác định với nước cất. 36 78 12 10 0.8 40 78 12 10 1.0 50 Tạp chí Đại học Công nghiệp Mẫu cây (bột) 3.2.2. Quy trình nghiên cứu Nghiên cứu hoạt tính điện hóa của hai chất chuẩn là catechol (1,2-dihydroxybenzen) MeOH (0.5 %HCl) và cyanidin-3-glu để xác định hệ số ,  của Dịch trích Cô quay máy, số điện tử trao đổi n và hệ số hấp thu . Từ đó xác định nồng độ anthocyanin trong mẫu cao trên máy LC/UV/ECD và cấu trúc mẫu cao trên máy LC/MS/MS. Cột SCX Định mức đến thể tích xác định 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 4.1. Xác định hệ số  và  của máy Nghiên cứu hoạt tính điện hóa của 2 chất chuẩn là catechol (1,2-dihydroxybenzen) và HP LC-UV-ECD và LC-UV-MS cyanidin-3-glu. Sơ đồ 1: Quy trình phân tích hàm lượng anthocyanin trong lá Lobelia OH OH HO O B A C e, H HO O OH Glu O O O B A C O Glu OH Cyanidin-3-glu OH O OH _e, H O O- _e, H O catechol quinone Dạng oxy hóa của cyanidin-3-glu Hình 1. Phản ứng oxy hóa các nhóm OH trên catechol và cyanidin-3-glu. Cyanidin-3-glu với vòng B giống tử của catechol sẽ là cơ sở để tiến hành nghiên catechol, vì vậy việc khảo sát tính chất cho điện cứu trên cyanidin-3-glu. 4.1.1 Xác định hệ số  và  theo chất chuẩn catechol ∗ Xác định hệ số  Diện tích00 ECD (mV.mi0 n)100 50 y = 31.891x + 32.895 R² = 0.9933 0 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 [cat] x104 (M) Bảng 1. Đồ thị biểu diễn nồng độ catechol theo diện tích ECD 51 Ứng dụng của HPLC ghép đầu dò điện hóa…  hệ số góc ECD =  × n × Vtiêm × F= 3,19 105 = 0.165 Với n = 2; Vtiêm = 10uL; F = 96500. ∗ Xác định hệ số  ∗ Xác định : Area UV 10 8 y = 1.3344x 6 4 2 [catechol]= 0.483mM hòa tan trong hệ dung môi HCOOH 5%:MeOH 80:20, A = 0 2 4 6 8 [cya-3-glu]x10^5(m/L) 1.2347  = 2556,4 (L/mol.cm) Bảng 8. Đồ thị nồng độ cyanidin-3-glu theo diện tích UV. Diện tích 6 UV 50 40 30 20 10 y = 0.3074x + 1.044 R² = 0.9997 Hệ số góc =     l=133440  = 10.0 Trong đó [cyanidin-3-glu]=2.1210-5 M đo ở  = 520nm trong cuvet bề dày 1cm với A = 0 0 50 100 150 200 0.28296 =13400 (L/mol.cm). Bảng 2: Đồ thị biểu catechol theo diện tích UV [Cat] x 105 (M) diễn nồng độ 4.1.3. So sánh các giá trị ,  được xác định từ 2 chất chuẩn catechol và cyanidin-3-glu Hệ số góc =     l = 30740   = 12,02 Giá trị 4.1.2 Xác định  và  theo chất chuẩn là  cyanidin-3-glu  ∗ Xác định : Catechol 12.12 0.165 Cyanidin-3-glu 10.00 0.15 Area ECD 20 14 10 6 2 2 4 y = 2.8059x 6 8 Nhận xét:   xác định theo 2 chất chuẩn hầu như không sai khác nhau; chúng tôi chọn giá trị  = 0.165 để tính toán về sau.   tính theo thực nghiệm giữa 2 chất chuẩn khá khác nhau, chúng tôi dùng phương pháp vi phân toán học để tính: [cya-3-glu] x 10^5(m/L) Bảng 7. Đồ thị nồng độ of cyanidin-3-glu theo diện tích ECD. →= 0.15  = tfm = 1mL / phut =10  chọn  = 10 cho các tính toán về sau. 4.2. Khảo sát thế áp tối ưu của các polyphenol Quét thế trên đầu dò ECD từ 150mV tới 1000mV 52 Tạp chí Đại học Công nghiệp catechol 4.64x10-4 (M) Area ECD 1(mV.min) 1000 800 Area ECcyanidin-3-glu 6.816x10-5 (M) (mV.min) 40 30 600 400 200 0 0 200 400 600 800 1000 1200 E(mV) 20 10 0 0 200 400 600 800 1000 E (mV) ... - tailieumienphi.vn