Xem mẫu
- Tách chi t và tinh s ch protein
Các phương pháp chi t rút tinh s ch và xác đ nh protein
I. Khái ni m
Trong các t ch c c a cơ th s ng, protein có th dư i d ng t do trong các d ch
sinh v t ho c dư i d ng k t h p, ho c b c m trong các t bào. Hơn n a, trong t
bào có ch a hàng nghìn lo i protein khác nhau, n u ta c n nghiên c u t ng lo i
protein, trư c h t ph i chi t rút và tinh s ch chúng. Chính vì v y, các k thu t chi t
rút, tinh s ch và nghiên c u protein luôn v trí trung tâm c a các nghiên c u hóa
sinh và luôn ư c c p nh t và hi n i hóa.
II. Các bi n pháp c n thi t nh n protein nguyên th
Các phương pháp chi t rút và tinh s ch protein u d a trên nh ng tính ch t hóa lý
c a protein như tích i n, kích thư c phân t , hòa tan... c a protein c n chi t
rút. Nhi u protein còn liên k t v i các phân t sinh h c khác nên vi c chi t rút các
protein này còn ph thu c vào b n ch t c a các liên k t.
Mu n thu nh n ư c các protein nguyên th t c là protein có t t c tính ch t t
nhiên c trưng c a nó, c n s d ng các bi n pháp khác nhau.
2.1. Nhi t
tách các protein khác nhau d a trên k t t a c a chúng, ngư i ta có th s d ng
phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c a nhi t. M t i u c n lưu ý là ch
nên dùng i v i trư ng h p các protein enzyme b n v i nhi t. D ch protein
enzyme ư c gi 50 - 700C trong th i gian xác nh, sau ó
protein t p ã b bi n tính ư c lo i b b ng cách l c ho c ly tâm. Như v y, d ch
chi t protein thô b n v i nhi t có th ư c thu nh n b ng cách cho k t t a không
thu n ngh ch ph n l n các protein t p.
thu nh n ch ph m protein theo phương pháp k t t a thu n ngh ch b ng các
mu i trung tính, c n ti n hành nhi t th p, i v i dung môi h u cơ c n ti n
hành nhi t dư i 00C tránh bi n tính c bi t là protein
enzyme.
2.2. N ng proton (pH)
Protein là các ch t lư ng tính, vì v y, trong các dung d ch acid và ki m chúng s b
phân ly như sau:
- pixelLineWidth 0">
Do các acid amin trong chu i polypeptide còn t n t i nhi u nhóm ch c t do dư i
d ng các ion hóa là nguyên nhân t o ra tính a i n c a protein. Phân t protein r t
dài nên nhóm ion t do t n cùng c a chu i polypeptide không áng k , ch y u các
nhóm ch c t do khác c a chu i bên (R) quy t nh tính ch t tích i n c a phân t
protein (nhóm cacboxyl c a amino acid, OH c a Tyrosine, ε - NH2
c a lysine, guamidin c a Arginine, inidazol c a histidine)
M c ion hóa c a các nhóm này ph thu c vào giá tr pH. Các nhóm acid d ng
anion trong môi trư ng ki m, các nhóm ki m t n t i d ng cation trong môi
trư ng acid.
Như v y, m t giá tr pH xác nh, m i phân t protein có m t i n tích t ng s
nào y mà l n c a nó ph thu c vào s lư ng các nhóm tích i n dương và
tích i n âm. K t qu là giá tr n ng ion hydro c nh, các protein khác nhau
trong h n h p s có t ng i n tích khác nhau. Nhi u phương pháp dùng tách các
h n h p protein u d a vào c tính này. Các phân t protein mang i n tích t ng
s (dương ho c âm) cùng d u y nhau ra xa nên d tan vào dung d ch. M i m t
protein có m t giá tr pH nh t nh mà ó t ng s i n tích âm và i n tích
dương trong phân t b ng không. Giá tr ó g i là i m ng i n c a protein.
i m ng i n c a các acid amin trung tính có giá tr pH t 5,6 - 7,0; i v i các
acid amin có tính acid (dicarboxylic) là t 3,0 - 3,2; i v i các acid amin có tính
ki m (diamino) là t 9,7 - 10,8. i m ng i n, hòa tan c a protein là th p
nh t, protein d b k t t a. D a vào tính ch t này, ngư i ta có th tách t ng ph n
các protein enzyme trong h n h p.
Cũng gi ng như trư ng h p tác d ng c a nhi t trong vi c tách chi t protein, có
th dùng phương pháp bi n tính ch n l c nh tác d ng c a pH c a môi trư ng.
D ch protein enzyme ư c gi pH ≤ 5 trong th i gian xác nh. Protein t p b
bi n tính cũng ư c lo i b b ng cách l c ho c ly tâm. Ví d citochrom C cũng tan
- trong acid trichloracetic trong khi ó acid này làm k t t a ph n l n protein. Như
v y các protein b n v i acid có th ư c tách chi t b ng cách này.
2.3. Tác nhân hóa h c
Có th dùng mu i trung tính ho c các dung môi h u cơ tách chi t các protein
enzyme. Phương pháp này ư c ti n hành d a tr n cơ s : hòa tan c a protein
ph thu c vào s tương tác c a các nhóm tích i n trong phân t protein v i các
phân t nư c. S tương tác ó (còn g i là s hydrate hóa) s b gi m xu ng khi
thêm vào dung d ch protein enzyme các dung môi h u cơ ho c các mu i trung
tính. Dung môi h u cơ thư ng dùng là etanol, isopropanol, acetone ho c h n h p
các lo i rư u.
Khi s d ng các dung môi h u cơ, c n chú ý ti n hành nhi t th p (t
50C tr xu ng). Dùng dung môi h u cơ có th ti n hành tách phân
o n dư i 00C và có th n -200C, như v y có tác
d ng t t n n nh c a protein enzyme.
Khi ã có k t t a, chú ý l y nhanh k t t a ra kh i dung môi b ng cách dùng máy ly
tâm l nh.
Các mu i trung tính có th dùng là
(NH4)2SO4,
Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên,
ngư i ta ã nh n th y mu i
(NH4)2SO4 là t t nh t vì nó
không làm h i mà làm n nh (làm b n) h u h t các lo i protein enzyme. Lo i
mu i này l i r ti n và ph bi n. hòa tan c a nó l i r t l n (b o hòa 767g/l
250C)
Ngoài ra n ng (NH4)2SO4 c n
thi t k t t a protein enzyme khác nhau thì khác nhau nhi u.
Ví d : Protease c a n m m c d b k t t a 70% c a
(NH4)2SO4 b o hòa hoàn toàn,
còn amilase c a m m lúa b k t t a 50% b o hòa c a dung d ch mu i này.
i u ó nói lên tính k t t a l a ch n c a
(NH4)2SO4 cao hơn các mu i
khác.
Có th dùng (NH4)2SO4 c 2
d ng: d ng b t và d ng dung d ch b o hòa. Khi dùng b t, ngư i ta cho t ng ít m t
vào d ch chi t protein enzyme. Cách cho cũng nh hư ng l n n lư ng k t t a
ban u c a protein enzyme. Khi cho mu i vào d ch chi t c n ph i có máy khu y
t m b o s hòa tan c a mu i. Khi dùng dung d ch b o hòa, trong nhi u sách
v phương pháp nghiên c u, ngư i ta ưa ra b ng tính s lư ng mu i c n thi t
pha các dung d ch có bão hòa khác nhau nh ng nhi t nh t nh.
Khái ni m v s ph n trăm c a b o hòa hoàn toàn ã ư c c p n. Như ví
- d trên thì protein enzyme có th b k t t a 50% (0,5) ho c 70% (0,7) c a bão
hòa hoàn toàn c a (NH4)2SO4.
Khi cho dung d ch (NH4)2SO4
bão hòa vào d ch chi t protein enzyme thì n ng
(NH4)2SO4 không tăng t ng t.
Sau khi k t t a xong ngư i ta thư ng l ng kho ng 2 gi ho c qua êm, m c
ích là t o k t t a hoàn toàn ( phương pháp dùng dung môi h u cơ thì không c n
lâu). K t t a ư c l y ra b ng cách ly tâm ho c l c qua ph u Buchner. Khi hòa
tan k t t a l i ngư i ta thư ng thêm ion Ca++ làm b n protein
enzyme (dùng CaCl2 ho c Ca(CH3
COO)2
ti n l i, ngư i ta ưa ra công th c cách tính lư ng
(NH4)2SO4 cho vào d ch có
bão hòa cho trư c (S1) t nm t bão hòa c n thi t
(S2)
Tùy theo tr ng thái (NH4)2SO4
cho thêm vào d ch chi t protein enzyme mà có công th c tính toán khác nhau.
- i v i (NH4)2SO4 d ng b t
x(g) =
Trong ó V là th tích dung d ch, S1, S2 là bão
hòa cho trư c và bão hòa c n t (ví d : S1 = 0,5;
S2 = 0,7 ch ng h n).
Ngư i ta cũng có th dùng b n toán (nomogram) chi u và xác nh ư c
lư ng (NH4)2SO4 thêm vào
d ch chi t protein enzyme t ư c m t bão hòa nh t nh. Ho c có th i
chi u b ng có s n. Lư ng
(NH4)2SO4 ưa vào dung d ch
có bão hòa nh t nh có khác nhau tùy theo nhi t thí nghi m.
- i v i (NH4)2SO4 d ng dung
d ch bão hòa.
Th tích (tính theo ml) c a dung d ch bão hòa c n cho vào 100ml dung d ch có
bão hòa ban u S1 t nm t bão hòa S2
c n thi t ư c tính theo công th c sau:
- V(ml) =
Như v y, n u thêm t ng ph n các dung môi h u cơ ho c t ng ph n mu i
(NH4)2SO4 (có n ng bão hòa
khác nhau) thì ta có th tách t ng ph n h n h p protein enzyme. Tuy nhiên,
phân chia hoàn toàn nh ng h n h p ph c t p, phương pháp này không cho k t qu
t t vì hòa tan c a m t s protein b tăng lên. M c d u v y, cách k t t a t ng
ph n này cũng r t có l i, c bi t là i v i giai o n u c a vi c tách chi t và
làm s ch protein emzyme, vì phương pháp khá ơn gi n.
Ngoài ra, các tác ng khác như cơ h c, sóng siêu âm... có nh hư ng n quá
trình tách chi t protein emzyme.
III. Phá v t bào và chi t rút protein
3.1. Phá v t bào
Protein enzyme có trong t t c các cơ th ng v t, th c v t và vi sinh v t. Sau khi
ư c t ng h p nó có th ư c ti t ra ngoài t bào t n t i trong các d ch cơ th , d ch
môi trư ng (g i là protein enzyme ngo i bào) ho c ư c gi l i bên trong t bào
(protein enzyme n i bào). Các protein enzyme n i bào có th t n t i d ng hòa tan
trong t bào ch t và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v...) c a t
bào. T bào ư c bao b c b ng m t l p màng.L p màng này vi khu n ôi khi r t
b n và dày. Ngư i ta còn th y nhi u protein enzyme liên k t r t ch t ch v i các
bào quan c a t bào. Các phân t protein enzyme không có kh năng i qua màng
c a t bào và màng c a các bào quan c a t bào. Do ó có th chi t rút các
protein enzyme n i bào, bư c u tiên là ph i phá v c u trúc c a các t bào có
ch a protein enzyme và chuy n chúng vào dung d ch.
Có th phá v c u trúc c a t bào b ng các bi n pháp cơ h c như nghi n v i b t
th y tinh ho c cát th ch anh, làm ng hóa b ng thi t b nghiên ng th
(homogenizator). Thi t b này có chày th y tinh g n v i m t môtơ quay và có th
i u ch nh ư c t c quay theo yêu c u. Các t bào gi a chày thùy tinh và thành
c i s b phá h y.
vi c phá v có hi u qu , mô th c v t, trư c khi nghi n, ngư i ta thư ng thái
nh m u vào ngăn á ho c cho trương nư c. (ví d như i v i m u h t khô).
Còn các mô c a ng v t như gan ho c th n, khi chi t protein enzyme ngư i ta
c n c t b các mô liên k t.
Mu n tách ư c các protein trong các c u t c a t bào, ngư i ta còn ph i dùng
- các y u t v t lý và hóa h c khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi h u cơ
như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat... và ch t t y (detergent). Các hóa ch t
t t cho vi c phá v các bào quan c a t bào vì trong các cơ quan này thư ng ch a
m.
3.2. Chi t rút protein
Sau khi ã phá v c u trúc c a các t bào ti n hành chi t xu t các protein enzyme
b ng các d ng d ch m thích h p, dung d ch mu i trung tính ho c b ng nư c i
v i protein enzyme n i bào ho c b ng ly tâm tách t bào i v i các protein
enzyme ngo i bào: vi c ch n phương pháp tách chi t protein enzyme tùy thu c vào
tính ch t c a protein enzyme c n nghiên c u.
IV. Tinh s ch protein
4.1. Lo i các t p ch t
Trong d ch chi t thô thu ư c ngoài protein enzyme còn có các protein t p, các
ch t cao phân t khác như polysaccharid, acid nucleic và các ch t phân t nh như
ư ng monose, các ch t lipid, mu i khoáng v.v... lo i b chúng ph i s d ng
ph i h p nhi u bi n pháp khác nhau.
lo i b mu i khoáng và các lo i ư ng... là các t p ch t có phân t lư ng th p
ngư i ta thư ng dùng phương pháp th m tích (dialysis) i nư c hay i các dung
d ch m loãng ho c b ng cách l c qua gel sephadex.
lo i b các protein t p và các t p ch t có phân t lư ng cao khác, ngư i ta hay
dùng k t h p nhi u bi n pháp khác nhau: phương pháp bi n tính ch n l c nh tác
d ng c a nhi t ho c pH c a môi trư ng, phương pháp k t t a phân o n b ng
mu i trung tính ho c các dung môi h u cơ (xem 5.2.1; 5.2.2. và 5.2.3), các phương
pháp s c ký trao i ion, i n di, phương pháp l c gel.
4.2. Các k thu t thông thư ng trong tinh s ch protein
Như trên ã trình bày, sau khi nh n ư c d ch chi t protein thô, ngư i ta thư ng s
d ng các phương pháp khác nhau tách chi t và ng th i làm tinh s ch protein.
Ngoài các k thu t ã ư c gi i thi u c th các ph n trên, có th s d ng các
phương pháp dư i ây ph c v cho vi c tinh s ch các protein.
4.2.1. Ly tâm
M t trong nh ng k thu t không th thi u ư c trong vi c tách chi t và tinh ch
protein là ly tâm.
Máy ly tâm ư c s d ng tách các ph n khác nhau kh i dung d ch. Ngư i ta g i
pha l ng là ch t l ng bên trên k t t a, pha r n mà thư ng l ng k t xu ng áy ng
ly tâm ư c g i là k t t a. Th c ch t, s ly tâm tăng t c k t t a c a nh ng ti u
ph n r n nh l c ly tâm. S sai khác v t tr ng c a nguyên li u lơ l ng so v i
ch t l ng càng l n thì t c k t t a s càng cao. M c d u ngư i ta coi s vòng
quay trong m t phút là ơn v thông thư ng c a l c ly tâm, nhưng quy ư c y
không th a mãn. Chính vì v y, m c tăng l c ly tâm ư c o m t cách chính xác
hơn b ng nh ng b i s c a tr s gia t c c a l c hút m t bi n, có nghĩa là ư c
- o m t l c ly tâm tương i (relative centrifugal force, RCF) ho c là ư c o b ng
các giá tr là b i s c a l c hút tr ng trư ng (xg). Công th c tính l c ly tâm
tương i là:
Trong ó r là bán kính n áy c a ng ly tâm tính ra "phút" (foot, 1foot =
30,48cm), n là s vòng quay trong 1 giây. Có th tính giá tr c a l c ly tâm tương
i m t cách tr c ti p theo công th c:
L c ly tâm tương i (g) = 1,1118 x 10-5 x R x N2.
Trong ó R là bán kính (cm) n p ly tâm tính t tâm c a tr c n áy ng ly tâm, N
là s vòng quay trong m t phút. Cũng có th dùng b n toán (nomogram) tính
l c ly tâm tương i
Thông thư ng có th làm k t t a nh ng ti u ph n l n v i l c ly tâm tương i bé
b ng các máy ly tâm bàn. làm k t t a nh ng ti u ph n bé hơn k c nh ng
thành ph n c a t bào c n có nh ng máy ly tâm c hi u b o m ư c các giá tr
l c ly tâm tương i cao hơn 15000 x g i v i b t kỳ nh lư ng nào. Có nh ng
nguyên t c làm vi c an toàn hơn v i máy ly tâm i v i ngư i thao tác cũng
như i v i nguyên li u ư c x lý mà lúc thí nghi m c n chú ý tuân th . ó là
nguyên t c cân b ng i x ng khi ly tâm và thăng b ng máy ly tâm khi t máy
làm vi c.
Do tính ch t không b n v i nhi t c a ph n l n các protein enzyme, khi tách chi t
tinh ch chúng, c n s d ng máy ly tâm l nh. Trong trư ng h p i u ki n thí
nghi m có h n ch , có th s d ng m t s phương cách nh m m b o duy trì m u
nhi t th p. C n làm l nh t t m u và ng ly tâm trư c khi ly tâm. N u trong
máy có các m thay th có th làm l nh chúng trong t l nh trư c khi ly tâm.
C n ph i ti n hành ly tâm v i th i gian t i thi u tránh nóng máy. Có th t tr c
ti p máy ly tâm bé vào t l nh, ưa dây d n ra ngoài qua l p m c a cánh c a t
l nh.
4.2.2. Th m tích
Th m tích là s khu ch tán vi phân qua màng v n không th m i v i nh ng ch t
keo hòa tan (protein, m t s các polysaccharid) nhưng th m i v i các d ng d ch
các tinh th .Các tinh th (các mu i, các h p ch t h u cơ có tr ng lư ng phân t
th p...) có th khu ch tán qua màng theo nh lu t Fick. Nư c s khu ch tán t
dung d ch có n ng th p hơn (thư ng là dung d ch r a) vào dung d ch keo, trong
- khi ó các ion (cation và anion) và các ch t phân t nh s chuy n vào dung d ch
có n ng th p hơn (thư ng chuy n vào dung d ch r a). Trong quá trình tách
chi t và tinh s ch protein, lo i mu i ammonium sulphate ra kh i dung d ch
protein thì cho dung d ch protein vào cái túi c hi u làm b ng nguyên li u bán
th m. Thông thư ng ngư i ta hay dùng túi colodion ho c cellophane (lo i sau hay
ư c dùng hơn). Sau ó t c túi vào bình ch a lư ng l n nư c ho c lư ng l n
dung d ch m ư c pha loãng (ví d m phosphate có pH = 7, n ng 0,01M).
Vì màng cellophane là màng bán th m, có kích thư c l ch cho các ch t có phân
t i qua vào các dung d ch m loãng theo nh lu t khu ch tán. Như v y, mu i
s khuy n tán vào nư c ho c dung d ch êm loãng (di chuy n theo hư ng gi m
n ng ), còn nư c ho c m loãng s di chuy n t dung d ch r a vào túi ch a
protein. Protein là nh ng i phân t không th vư t qua túi th m tích và ư c gi
l i trong túi. B ng cách thay i thư ng xuyên dung d ch r a có th t y s ch mu i
ra kh i protein , m c d u trong quá trình th m tích, nó là dung d ch ư c pha loãng
hơn. Có th làm gi m b t ho c lo i tr s pha loãng như th khi ti n hành th m
tích dư i áp su t, có nghĩa là khi dung d ch ư c x lý n m dư i m t áp su t th y
tĩnh y , dòng th y ng h c c a nư c t dung d ch s cân b ng s khu ch
tán c a các phân t vào dung d ch. Phương pháp này thư ng òi h i có thi t b c
bi t.
Hình 5.1 Th m tích lo i mu i
(NH4)2SO4 trong k t t a
protein.
Phương pháp th m tích thông thư ng là cho dung d ch có k t t a protein vào túi
th m tích (không quá 2/3 th tích túi). Cho thu c sát trùng ho c toluen b o qu n
protein (vì th i gian th m tích lâu, protein có th b th i h ng). Bu c túi vào m t
que th y tinh, gác que th y tinh lên mi ng ch u nư c gi túi gi a ch u. Cho
vòi nư c ch y nh liên t c vào áy ch u thay i nư c thư ng xuyên (hình 5.1).
Mu i (NH2)SO4 hòa tan trong nư c và b lo i d n.
Th i gian th m tích có th t 24 - 48 gi , làm th m tích l n cu i cùng b ng nư c
c t.
Có th tăng t c th m tích khi khu y dung d ch r a b ng máy tr n cơ h c hay
máy tr n t ho c là quay ch m túi nh ng cơ không l n. Khi th m tích các
- protein thư ng ngư i ta ti n hành t t c các thao tác môi trư ng l nh.
4.2.3. S c ký l c gel
S c ký l c gel là m t trong nh ng k thu t s c ký c t ư c dùng ph bi n trong
tách chi t và tinh s ch protein.
D ch chi t protein enzyme ã ư c lo i b ph n l n các protein t p nhưng v n
chưa m b o ng nh t c n thi t ư c ti p t c làm s ch b ng phương pháp s c
ký c t. Phương pháp s c ký (chromatography) là do hai ch "chroma" là màu s c
và "grapho" là vi t, nghĩa là vi t b ng màu. Thu ban u, ngư i ta s d ng
phương pháp s c ký tách các ch t màu và ch sau này ngư i ta áp d ng cho vi c
tách các ch t không màu.
S c ký l c gel còn ư c g i là phương pháp dùng ch t rây phân t , l c gel (gel
filtration)
Cơ s c a phương pháp l c gel là d a vào s khác nhau nhau v kích thư c, hình
d ng và phân t lư ng c a protein enzyme có trong h n h p tách chúng ra.
m b o cho vi c tách protein enzyme ư c t t, ch t rây phân t ph i là ch t
trơ, không ph n ng v i protein enzyme. Ch t này cũng không hòa tan và tương
i b n v i các y u t v cơ h c cũng như sinh h c. Ngoài ra ch t ư c s d ng
cho m c ích l c phân t ph i là ch t không có tính àn h i (không co) và ph i là
ch t ưa nư c (hidrofil).
Gel sephadex là ch t th a mãn các y u t trên. Sephadex là ch ph m dextran do
các loài vi sinh v t khác nhau là Leuconostoc t o ra khi chúng ư c nuôi c y trên
môi trư ng ch a saccharose. Tr ng lư ng phân t c a dextran có th t t i hàng
tri u và l n hơn. Phân t dextran bao g m các chu i do các g c glucose t o thành
các liên k t 1,6. Sephadex Nh n t dextran b ng cách x lý hóa h c (do tác d ng
c a epichlohidrin) t o ra các lư i phân nhánh có liên k t ngang g i là "sàng
phân t " và ch t này tr thành không tan trong nư c. S liên k t ngang t o ra càng
nhi u, kích thư c c a l sàng phân t càng nh .
Phương pháp l c phân t trên Sephadex ư c ti n hành như sau: cho sephadex vào
c t th y tinh dài và cân b ng b ng dung d ch m có pH nh t nh. Sau ó cho
dung d ch protein enzyme lên c t. Khi l c và chi t b ng dung môi thích h p, các
phân t có tr ng lư ng phân t nh ( ây là các mu i) s khu ch tán ch m ch p
qua các l nh c a các h t Sephadex b trương ph ng, còn ch t có tr ng lư ng
phân t l n hơn ( trư ng h p này là protein enzyme) không có kh năng i vào
mà lách nhanh qua các h t sephadex và s ư c chi t nhanh ra kh i c t (hình 5.2
và hình 5.3). Vì v y ta có th tách ư c ch t có tr ng lư ng phân t cao hơn thoát
ra kh i c t gel trư c so v i ch t có phân t lư ng nh . Hãng Sephadex
(Pharmacia) c a Th y i n ã tung ra th trư ng các lo i sephadex có kích thư c
khác nhau có ký hi u t G10 n G200. S ký hi u ch ra m c nh n (hút)
nư c c a chúng. Ví d G10 ch khi trương ph ng thì 1g gel khô nh n 1ml nư c
(1ml/g)
-
Hình 5.2 Ho t ng c a l c phân t sephadex.
Các sephadex có ký hi u khác nhau t G10 n G200 ph c v trong vi c l c phân
t cho phép các ch t có tr ng lư ng phân t khác nhau l t vào các ngư ng khác
nhau.
Ngư i ta còn s d ng sephadex lo i mu i thay cho quá trình th m tích. Cùng
nhóm ch t rây phân t có ngu n g c polisacharid, là ch ph m dextran như
sephadex (pharmacia) còn có molselect (Reanal) - là s n ph m c a Hungary ư c
ng d ng nhi u trong nghiên c u.
Có th dùng làm cô c các ch t có tr ng lư ng phân t l n như protein, peptid,
lo i mu i kh i protein enzyme (dùng nhanh hơn so v i th m tích), l c gel tách
theo tr ng lư ng phân t (như protein huy t thanh)
Hình 5.3 Tách các phân t theo kích thư c b ng s c ký l c gel.
ho c tách các s n ph m protein ư c hình thành dư i tác d ng c a enzyme phân
c t (như γ - G - globulin b c t b i papain). Ngoài nhóm ch t rây phân t là ch
ph m dextran còn có nhóm ch t rây phân t là ch ph m gel acrilamid bao g m
Biogel (Bio - Rad) và Acrilex (Reanal). Acrilex gel là lo i copolimer, s n ph m
c a Hungary ư c t o ra t acrilamid và N, N' - metilen bisacrilamid. Các acrilex
gel có ký hi u t P - 300 dùng tách các ch t có tr ng lư ng phân t trong
ngư ng t 100 - n 300.000. Có th s d ng vùng pH t 2 - 11. Ch t th ba là
agarose gel, ã lo i sulphate. Hay ph bi n là lo i sepharose (Pharmacia). Ngư i ta
thư ng dùng ch t này tách các phân t có tr ng lư ng l n hơn
106.
Tóm l i b ng phương pháp l c rây phân t ngư i ta th tách các ch t có tr ng
- lư ng phân t khác nhau có trong h n h p (như polimer, polisaccharid, acid
nucleic, protein). Ngư i ta có th dùng k thu t này lo i mu i thay cho quá
trình th m tích. Và hơn th n a, trong quá trình tinh ch protein enzyme, chúng
còn ư c s d ng cô c dung d ch protein enzyme.
4.2.4. Phương pháp s c ký trao i ion.
Phương pháp s c ký trao i ion d a vào s khác nhau v i n tích t ng s c a các
protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này ư c d a trên cơ s c a
ph n ng trao i ion gi a protein ư c tan trong nư c ho c dung d ch m loãng
và các tác nhân trao i ion. Tác nhân (hay nguyên li u) trao i ion có th là ch t
nh a có tích nhóm sinh ion ho c là ch t ionit. ây là nh ng ch t giá trơ, không tan
trong nư c, có b n ch t là cellulose ho c ch t gel dextran có lư i phân nhánh
(Sephadex, Molselect) ho c là ch t nh a polistirol. Ch t giá th này thư ng k t
h p v i các nhóm ion hóa. Các ch t trao i ion có ch t giá là celluose, sephadex,
molselect thông thư ng ư c dùng tách protein enzyme, còn các ch t trao i
ion có ch t giá là polistirol (ví d như Dowex, Amberlite) ch dùng tách các
peptid có tr ng lư ng phân t nh hơn.
* Các ch t trao i ion có ch t giá cellulose
- Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose)- là m t d n xu t este c a
cellulose.
Cellelose - O - CH2 - COOH
Khi phân li cho ra COO-. ây là ch t trao i cation.
Trên nh ng cationit, thì các protein ki m có th a nh ng nhóm amin và nh ng
nhóm ki m khác ư c h p ph (liên k t ion). S h p ph trên các cationit ư c
ti n hành v i nh ng dung d ch loãng pH 1,5 - 6,5. (Các protein ki m có ch a các
acid amin diamino - mono carboxylic như lys, Arg, His)
- Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là d n xu t este c a
cellulose)
Trong H2O nó ư c phân ly:
- o:href="http://mail.google.com/mail/?name=dd3fcf75bc82a822.jpg&attid=0.3&dis
p=vahi&vie w=att&th=11d94e949413c887"
src="file:///C:\DOCUME~1\server\LOCALS~1\Temp\msohtml1\01\clip_
image009.jpg">
ây là ch t trao i anion, b n thân tích i n dương.
Các anionit ư c áp d ng phân tích các protein acid có th a nh ng nhóm
carboxyl t do. S h p ph protein trên nh ng ionit như v y ư c ti n hành v i
nh ng dung d ch m có l c ion th p (0,005 - 0,1M) pH 7,5 - 8,5. (các protein
acid có ch a các amino acid monoamin dicarboxylic như glu, Asp)
Trong h n h p ch t ionit v i dung d ch m có pH tương ng, các ch t ionit ã
nói trên tr nên tích i n. Vì v y trên b m t l p ch t giá s hình thành m t l p
i n tích có d u ph thu c vào ki u nhóm ch c hóa h c c a nó. N u thêm protein
enzyme vào dung d ch m thì các phân t protein enzyme mang i n tích s b
các nhóm tích i n trái d u c a ch t trao i ion kéo l i. Khi dùng m t dung d ch
m ph n h p ph có pH khác ho c khi thêm m t lo i ion khác có l c ion l n
hơn thì phân t protein enzyme s b y ra kh i ch t trao i ion. Khi ti n hành
ph n h p ph , thư ng ngư i ta thêm vào các ion Na+ và Cl-
trong NaCl có n ng tăng d n theo b c thang hay theo gradient.
Các phân t protein enzyme nào có i n tích t ng s nh thì s b y ra trư c do
l c liên k t v i ch t trao i ion y u. Còn nh ng protein enzyme nào có liên k t
v i ionit l n hơn thì s b y ra b ng m t l c ion c a mu i l n hơn. Như v y,
b ng cách này, chúng ta có th tách ư c t ng ph n các lo i protein enzyme. Vi c
tách t ng ph n có l a ch n t t nh t là khi tăng d n n ng các ion thay th .
Nh n ng ion c a mu i tăng d n (gradient) ngư i ta có th rút ra t c t các lo i
protein enzyme khác nhau. Có th thu nh n d ch chi t enzyme protein sau khi qua
c t b ng máy thu phân o n t ng. Theo th t t ng ph n d ch thu ư c, ngư i
ta ti n hành nh lư ng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp o
quang ph và xác nh o t ho t c a enzyme.
* N u ch t giá là sephadex thì chúng ta có ch t trao i ion sephadex. ó là các
lo i DEAE - sephadex và CM - sephadex. Ưu i m c a lo i này là v a tách ư c
protein enzyme v kích thư c và v i n tích t ng s c a các protein enzyme.
Trư ng h p CM - sephadex trên ch t giá sephadex có g n nhóm COO-
-
COO-: mang i n tích âm → là ch t trao i cation
4.2.5. Phương pháp dùng ch t h p ph c hi u sinh h c hay là phương pháp s c
ký ái l c (affinity Chromatography).
Cơ s c a phương pháp này là ngư i ta g n nh ng phân t g n (ligand) vào ch t
mang (ch t giá) r n b ng liên k t c ng hóa tr mà protein enzyme c n tách s tương
tác c hi u v i nó. Nh ng ch t ó có th là cơ ch t (Substrate) ho c ch t c ch
(inhibitor) c nh tranh. Trong trư ng h p hai ch t kháng nguyên và kháng th có ái
l c liên k t c hi u v i nhau, ngư i ta thay th v trí ch t g n vào giá th gi a
kháng nguyên và kháng th nghiên c u t ng lo i gi ng như cơ ch t, ch t c ch
và enzyme c hi u c a chúng. Hay nói cách khác dùng ch t ch có kh năng liên
k t c hi u v i m t enzyme ho c protein ta nghiên c u. Ch t mang th r n có th
là b t kỳ m t lo i nào ph c v cho l c gel như sephadex, nhưng ngư i ta hay s
d ng nh t là gel Sepharose
trên c t giá th hay ch t mang ch a cơ ch t c nh pH và l c ion phù h p, ch
có protein enzyme nào có kh năng chuy n hóa cơ ch t m i g n vào, các protein
khác thì ch y xu ng c t. B ng cách thay i pH và l c ion phù h p ho c có th
b ng cách thêm ch t c ch c nh tranh ã ư c hòa tan vào thì có th tách ư c
protein enzyme kh i c t tr ng thái s ch.
4.2.6. K t tinh protein.
ây là phương pháp c hi u t t nh t tách t ng ph n protein enzyme giai
o n tinh ch cu i cùng.
Khi protein enzyme ã ư c làm tinh khi t hoàn toàn, trong nh ng trư ng h p
riêng bi t, ngư i ta có th ti n hành k t tinh chúng. M t i u c n chú ý là protein
enzyme tr ng thái tinh th không th ư c coi là b ng ch ng v s tinh khi t.
Các tinh th protein enzyme k t tinh l n u ôi khi có s ch không vư t quá
50% và có th ch a các protein enzyme khác. Ngư i ta thư ng ti n hành k t tinh
protein enzyme trong dung d ch
(NH4)2SO4. Quá trình k t tinh có
th ti n hành t t kéo dài vài ngày th m chí hàng tu n n u mu n nh n ư c các
tinh th t t. Thông thư ng là thêm mu i
(NH4)2SO4 vào dung d ch protein
enzyme khá m c cho n khi làm v n c nh nhàng dung d ch. Sau ó t
dung d ch vào m t nơi, ng th i tăng r t t t n ng mu i trong dung d ch. Có
- th ti n hành tăng n ng mu i theo nhi u cách, thêm dung d ch mu i m c
hơn vào dung d ch protein enzyme theo t ng gi t, thêm mu i qua màng bán th m
ho c có th cho bay hơi ch m ch p dung d ch protein enzyme. Trong quá trình k t
tinh có th thay i ch s pH ho c nhi t . k t tinh protein enzyme ư c d
dàng, nh ng giai o n trư c ó, ngư i ta thư ng tách t ng ph n các protein
enzyme b ng các dung môi h u cơ. i u này có l liên quan n vi c các ch t cơ
b n, ch t lipid b lo i ra kh i dung d ch protein enzyme t o i u ki n t t cho quá
trình k t tinh.
4.2.7. Làm khô và b o qu n ch ph m protein.
Tính c nh c u trúc c a protein ư c b o m nh kh năng liên k t nư c c a
chúng. N u dung d ch protein enzyme b khô nhi t trong phòng thì a s
protein enzyme b bi n tính. Protein enzyme ch có th ư c gi dang khô trong
trư ng h p n u vi c s y khô ư c ti n hành vô cùng nhanh ho c nhi t th p.
Nhi u protein như chúng ta ã bi t, nhi t th p có th ư c k t t a b ng rư u
ho c acetone. N u k t t a thu ư c b ng cách ó em x lý b ng rư u tuy t ói,
b ng acetone ho c b ng ether và sau ó làm khô th t nhanh thì protein s không b
bi n tính. d ng khô, b t protein có th gi m t th i gian lâu, khi hòa tan nó trong
nư c nó th hi n nh ng tính ch t ban u c a mình.
Tuy nhiên, nhi u protein không ch u ư c cách x lý như v y. Vì v y, ngư i ta s
d ng phương pháp làm ông khô là phương pháp làm khô protein th n tr ng nh t,
phương pháp này có th s d ng ư c cho h u h t protein.
Dung d ch protein ã ư c th m tích ư c làm óng băng và làm thăng hoa băng
áp su t 0,01-0,001 mm thu ngân ( ư c t o ra nh máy hút chân không m nh).
Nơi nư c ư c t o ra u ư c óng băng trong b u d tr nhi t th p hơn (-
70, -80oC). Sau m t vài gi ch còn l i b t protein. Sau ó b t này
(trong chân không) có th ư c gi nhi t cao hơn. Protein ã ư c làm ông
khô b ng cách như th khi hoà tan trong nư c c t s cho dung d ch protein (nguyên
th ) ngay sau m t vài năm. Ngư i ta ã b o qu n huy t thanh máu b ng phương
pháp như th , huy t thanh khô này có th ư c s d ng trong m c ích truy n
máu.
V. nh lư ng và ánh giá tinh s ch c a ch ph m protein
5.1. Các phương pháp xác nh hàm lư ng protein
Protein sau khi ã ư c tách chi t và làm s ch có th nh lư ng ư c. N u protein
nghiên c u là enzyme thì vi c nh lư ng thông qua xác nh ho t c a enzyme
(theo quy ư c qu c t : 1 ơn v ho t enzyme là lư ng enzyme làm chuy n hoá
1µmol cơ ch t trong 1 phút các i u ki n tiêu chu n). Như v y c sau các bư c
tách chi t và làm s ch protein ngư i ta th y t ng lư ng protein gi m nhưng ho t
enzyme tăng nghĩa là ho t riêng tăng r t cao. Protein ư c coi là s ch n u
nh ng bư c tách chi t và làm s ch sau không làm tăng ho t riêng c a chúng
n a, và ch khi ó ta m i hoàn thành vi c tách chi t và làm s ch protein. N u
- protein không ph i là enzyme thì ta có th nh lư ng chúng b ng các phương
pháp khác. N u protein ta nghiên c u là hormon ho c các c t thì chúng ư c
xác nh qua hi u ng sinh h c mà chúng gây ra; ví d như hormon sinh trư ng
(growth hormone) s kích thích s sinh trư ng c a các t bào ích nuôi c y. N u là
protein v n chuy n thì có th xác nh chúng thông qua n ng ch t mà chúng
v n chuy n. Sau ây là m t s phương pháp thư ng ư c s d ng xác nh hàm
lư ng protein.
- nh lư ng nitrogen theo phương pháp kjeldahl:
Ph n l n các phương pháp gián ti p xác nh protein u d a trên cơ s xác nh
lư ng nitrogen. Lư ng nitrogen có trong các protein là g n gi ng nhau không ph
thu c vào ch t lư ng và ngu n protein. ương nhiên trên cơ s lư ng nitrogen có
th xác nh ch các protein ã ư c tinh s ch ho c lư ng protein c a các m u
nghiên c u mà ngoài protein ra không ch a nh ng ch t ch a nitrogen khác. Trong
nông nghi p và công nghi p th c ph m, protein thô ư c nh lư ng b ng cách
xác nh lư ng nitrogen toàn ph n và k t qu nhân v i 6,25, nghĩa là coi protein
luôn luôn ch a 16% nitrgen. Th c t , trong th c ph m, bên c nh protein còn có
nh ng ch t h u cơ khác có ch a nitrogen như amid, alcaloid, ammonia (ví d như
trong th c ph m lên men) acid nitric... do ó hàm lư ng nitrogen toàn ph n chính
th c cao hơn 16% (16-17%) nhưng protein th c v t thì hàm lư ng này l i th p
hơn 16%. H s 6,25 là h s trung bình thô. Trong m t vài trư ng h p, mu n có
k t qu chính xác, nên dùng nh ng h s c bi t.
Nguyên lý c a phương pháp này là vô cơ hoá m u b ng
H2SO4 m c và ch t xúc tác. Dùng m t ki m
m nh (NaOH ho c KOH) y NH3 t mu i
(NH4)2SO4. Sau ó h ng
NH3 vào dung d ch acid có n ng xác nh. Sau ó dùng ki m
có n ng xác nh chu n acid dư. T ó tính ư c lư ng nitrogen có trong
nguyên li u.
- nh lư ng protein theo phương pháp Lowry:
Phương pháp này d a trên cơ s dùng máy o màu xác nh màu s n ph m kh
c a phosphomolipden - phosphowolframate (thu c th Folin - Ciocalteau) v i
ph c h p ng - protein. Ph c màu xanh t o thành có th o bư c sóng 675nm.
Cư ng màu c a h n h p ph n ng t l thu n v i n ng protein. D a vào
th chu n protein (thông thư ng dùng tinh th albumin huy t thanh bò) ta có th
tính ư c hàm lư ng protein trong m u nghiên c u.
Phương pháp Lowry ư c dùng r ng rãi xác nh nhi u lo i protein khác nhau.
Phương pháp này có nh y cao, cho phép phát hi n ư c protein trong dung d ch
n ng 1µg/ml. Tuy nhiên cư ng màu còn tuỳ thu c nhi u vào lo i protein.
Ví d , cùng m t n ng , dung d ch trypsin cho cư ng màu cao g p 3 l n
gelatin, hemoglobin cho cư ng màu th p hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin.
- Ngoài ra, nhi u ch t khác có th làm tăng hay gi m cư ng màu ph n ng, vì
v y phương pháp này cho k t qu chính xác khi xác nh protein ã ư c tinh
s ch.
- nh lư ng protein b ng phương pháp quang ph :
Phương pháp ơn gi n nh t o n ng protein trong dung d ch là h p th tia
c c tím c a nó. N u protein tinh s ch thì n ng tuy t i c a nó ư c tính theo
giá tr o ư c. N u protein không tinh s ch (ví d , d ch chi t t m t s c ký) thì
n ng c a protein t ng ư c tính tương i t h p th . Nguyên t c c a
phương pháp này là các protein h p th tia c c tím c c i bư c sóng 280nm do
các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine. h p th
280nm thay i tuỳ lo i protein nhưng h s t t o ư c (nghĩa là h p th c a
dung d ch protein 1% v i ư ng sóng truy n qua 1cm) cho m i protein cho phép
tính n ng c a protein tinh s ch.
V i m t h n h p các protein ho c v i b t c m t loai protein nào mà không bi t h
s t t thì n ng protein ư c tính như sau:
N ng protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260
Trong ó: A280: h p th bư c sóng 280nm
A260: h p th bư c sóng 260nm
Phương pháp này không dùng ư c cho các dung d ch có n ng protein th p hơn
0,1mg/ml ho c khi có m t nhi u ch t khác mà h p th cùng m t vùng c c tím (ví
d , m, acid nucleic và m t s ch t béo), ho c khi protein trong d ch truy n phù
ch không ph i trong dung d ch. (Ví d , trong màng ho c các ph c h p có tr ng
lư ng phân t l n). Cũng c n chú ý là n u t l
A280/A260 th p hơn 0,6 nghĩa là dung d ch
protein chưa s ch, b l n các ch t khác, c bi t v i acid nucleic thì nên s d ng
phương pháp Lowry o n ng protein.
Vì v y, phương pháp o h p th tia c c tím thư ng ư c dùng nh lư ng
protein ã tinh s ch ho c xác nh protein trong các phân o n nh n ư c khi
s c ký tách các protein qua c t.
5.2. ánh giá tính ng th c a protein:
Khi ã nh n ư c m t protein enzyme tr ng thái k t tinh, ngư i ta ph i th l i
mc tinh khi t hay tính ng th c a nó. ng th c a ch ph m protein
enzyme ph i ư c ki m tra b ng m t s phương pháp d a trên nh ng nguyên lý
khác nhau. Trong m t s trư ng h p protein enzyme ư c coi là ng th khi ly
tâm, nhưng l i có th phân chia thành m t s isoenzyme b ng phương pháp i n di
trên gel. Chính vì v y, n u dùng nhi u lo i phương pháp khác nhau ki m tra
s ch c a protein mà k t qu u cho là ng th thì protein ó có th ư c công
nh n là tinh khi t. Nh ng phương pháp ki m tra tính ng th hay dùng là xây
d ng th v hoà tan, i n di và siêu ly tâm.
- Phương pháp ki m tra tính ng th (ho c còn g i là tính ng nh t) c a protein
- ơn gi n và nh y nh t là xây d ng ư ng bi u di n v hoà tan.
Cách làm như sau: Trong hàng lo t m u dùng m t th tích không i m t lo i dung
môi (nư c ho c dung d ch mu i) l c v i nh ng s lư ng enzyme khác nhau. Sau
ó l c và xác nh s protein trong d ch l c. Cu i cùng xây d ng ư ng th .
Trong nh ng lo i m u u, t t c các protein thêm vào b hoà tan và s lư ng
protein thêm vào b ng s lư ng protein có trong d ch l c hay d ch ly tâm. K t qu
nh n ư c bi u di n là m t ư ng th ng. Sau ó dung d ch t ư c bão hoà. N u
protein em hoà tan là tinh khi t nghĩa là ng nh t thì khi thêm protein trong d ch
l c s không tăng lên và ư ng bi u di n có m t i m u n. N u trong m u có m t
protein th hai thì sau khi t ư c bão hoà i v i protein ít hoà tan hơn, lo i
protein th hai còn có th hoà tan ư c n a.
K t qu là có m t i m bão hoà th hai và ư ng bi u di n có hai i m u n. N u
d ch chi t (h n h p) có nhi u protein enzyme thì s có nhi u i m u n. Phương
pháp này ư c Northrop và Kunitz s d ng r t có k t qu . Nay v n còn ng d ng
nhi u.
- Phương pháp th hai xác nh ng th c a protein enzyme là phương pháp
i n di. Phương pháp i n di là ng d ng tính ch t lư ng tính c a protein, d a trên
cơ s d ch chuy n c a các ti u ph n ch ph m protein enzyme mang i n trong
i n trư ng. em ch ph m protein enzyme i n di pH và l c ion nh t nh. N u
trên i n di có m t băng protein thì ch ng t protein enzyme ó là ơn th . N u
có hai băng ch ng t có hai protein enzyme trong ch ph m ó. B n i n di này
ư c ua vào máy detector phát hi n không ch n ng c a băng i n di mà
còn phát hi n ư c s lư ng các băng v t.
Hình 5.4: ư ng bi u di n hoà tan protein
- Phương pháp siêu ly tâm:
ây cũng là phương pháp r t quan tr ng xác nh tính ng th c a protein
enzyme. Phương pháp ư c th c hi n như sau:
Dùng l c ly tâm r t l n b ng cách tăng s vòng quay ly tâm lên hàng nghìn, hàng
v n vòng trong m t phút. V i t c ly tâm r t l n, ngư i ta có th tách ra ư c
các phân t enzyme có tr ng lư ng phân t khác nhau.
T c k t t a c a protein enzyme trong máy siêu ly tâm ư c xác nh b ng tr ng
lư ng phân t c a nó. Khi d ng quay thì các phân t protein l i khuy ch tán vào
- dung d ch. B i v y, c n ph i quan sát t c l ng trong quá trình siêu ly tâm.
Chính vì v y, trong c c siêu ly tâm, ngư i ta g n m t thi t b quang h c c bi t,
v các ư ng ánh sáng c a k t qu phân tích lên m t màn. N u trong dung d ch có
m t loai protein enzyme (có m t tr ng lư ng phân t ) thì trên màn sáng s cho
ư ng th có m t nh. N u làm vi c v i hai protein enzyme thì s có hai nh
v.v...
TÀI LI U THAM KH O
1. Nguy n H u Ch n, Nguy n Th Hà, Nguy n Nghiêm Lu t, Hoàng Bích Ng c,
Vũ Th Phương. 2001. Hoá sinh. Nxb Y h c - Hà N i.
2. Ph m Th Trân Châu, Tr n Th Áng. 1999. Hoá sinh h c.Nxb Giáo d c - Hà
N i.
3. Nguy n Ti n Th ng, Nguy n ình Huyên. 1998. Giáo trình sinh hoá hi n i.
Nxb Giáo d c - Hà N i.
4. Lê Ng c Tú, Lê Văn Ch , ng Th Thu, Ph m Qu c Thăng, Nguy n Th
Th nh, Bùi c H i, Lưu Du n, Lê Doãn Diên. 2002. Hoá sinh công nghi p. Nxb
Khoa h c & K thu t - Hà N i.
5. Ajtai K., Szilagyi L..1985. Biokémiai gyakorlatok.Tankonyv. Jankonyv Kiado,
Budapest.
6. Kerese I. 1984 Methods of Protein analysis. Akademiai Kiado, Budapest
7. Lehninger A.L. 2004. Principles of Biochemistry, 4th Edition.
W.H Freeman, 2004
8. Stryer l., 1981. Biochmistry. W. H. Freeman and company, San francisco.
VI. Các quá trình tách chi t và tinh s ch protein
Qua nhi u năm, vi c gia tăng s d ng vi sinh v t như là m t ngu n cung c p
protein, c bi t là các enzyme, ã c i thi n áng k hi u qu s n xu t và s n ph m
ư c t o ra nhi u hơn. Ph n l n enzyme s d ng trong công nghi p là các protein
ngo i bào t các cơ th như Aspergillus sp. và Bacillus sp., bao g m: α-
amylase, β-glucanase, cellulase, dextranase, protease và glucoamylase. Nhi u lo i
trong s này v n còn ư c s n xu t t các ch ng g c t nhiên c a vi sinh v t. Tuy
nhiên, trong s n xu t protein s d ng các lĩnh v c ch n oán lâm sàng và cho
các ng d ng tr li u, công ngh protein và công ngh DNA tái t h p ã th hi n
m t vai trò ngày càng quan tr ng. Công ngh DNA tái t h p, ngoài vi c cho phép
c i thi n hi u su t cao, nó cũng cho phép chuy n các v t li u di truy n t ng v t
vào vi khu n v t ch . Theo phương th c này, các protein v n ch có m t lư ng nh
t mô ng v t bây gi có th ư c s n xu t trong m t lư ng g n như vô h n t
các vi khu n sinh trư ng d dàng. M t ví d i n hình là hormone sinh trư ng
ngư i, ch t này ư c s n xu t m i l n v i m t lư ng r t nh t tuy n yên c a
ngư i cho n khi nó ư c th a nh n hi n di n m t r i ro ti m tàng i v i b nh
nhân t s nhi m b n prion là y u t ư c ám ch trong h i ch ng Creutzfeld-
Jacob. Hormone sinh trư ng ngư i bây gi ư c s n xu t v i m t lư ng l n hơn
- r t nhi u t vi khu nE. coli và nó hoàn toàn s ch không b nhi m prion không
mong mu n.
Các protein ho c enzyme ư c s n xu t b ng vi sinh v t có th n i bào,
khoang gian bào ho c ti t vào môi trư ng nuôi c y. i v i các enzyme ngo i bào,
mc tinh s ch c n thi t thư ng là t i thi u, khi s n ph m cu i cùng ư c dùng
trong công nghi p và không c n tinh s ch cao. Các quá trình quy mô l n như
th có th cho s n lư ng protein lên n hàng t n.
Nhi u lo i protein khác ư c s n xu t trong các h n h p n i bào ph c t p ã gây
ra nhi u khó khăn trong quá trình tinh s ch chúng. Nh ng protein òi h i ph i tinh
s ch này thư ng ư c s n xu t s d ng trong i u tr , do ó ph i c g ng hư ng
t i các tiêu chu n tinh s ch r t cao, và có ư c i u này ngư i ta c n ph i phát
tri n các quy trình tinh s ch ph c t p. M t l n n a, công ngh DNA tái t h p ã
có óng góp hi u qu trong lĩnh v c này. Trong trư ng h p các protein tr li u,
thư ng có nh ng thu n l i n u protein quan tâm có th ư c ti t ho c vào kho ng
gian bào ho c vào trong môi trư ng. i u này giúp gi m r t l n nhi m b n c a
protein và các i phân t khác, s n ph m tinh s ch như th thư ng thu ư c ch
trong hai ho c ba bư c tinh s ch. Ch n l a h th ng bi u hi n thích h p có th cho
hi u qu cao hơn trong h lên men, có liên quan t i vi c c i thi n ho t tính c bi t
c a nguyên li u kh i u. Cũng có kh năng b sung các nhóm ch c vào protein
giúp cho s tinh s ch, t o ra cho nó các tính ch t c bi t và sau ó lo i b các
nhóm ch c này khi chúng không ư c yêu c u lâu hơn.
Trong thi t k quy trình tinh s ch quy mô l n thì s lư ng các bư c, và s thu
h i s n ph m m i bư c ã nh hư ng quan tr ng lên s n lư ng toàn ph n. S thu
h i c trưng c a m t bư c s c ký là trong kho ng 80% và 90%, vì s tinh s ch
ph c t p òi h i nhi u bư c do ó s n lư ng toàn ph n nhi u khi ch b ng 10%
c a nguyên li u kh i u. i u này không thành v n trư ng h p tinh s ch quy
mô phòng thí nghi m, nhưng n u tinh s ch quy mô l n thì ó là v n r t quan
tr ng c n quan tâm t i ưu toàn b quá trình t h th ng bi u hi n ho c s lên
men n bư c tinh s ch cu i cùng, gi m thi u s bư c tinh s ch c n thi t.
1. Thu h i protein
S thu h i và tinh s ch các protein và enzyme cũng quan tr ng như các giai o n
lên men xét theo góc kinh t c a quá trình s n xu t. Thách th c chính trong các
bư c thu h i là gi m thi u s m t ho t tính c a protein. Trong ph n này s trình
bày các bư c thu h i và tinh s ch truy n th ng cho protein.
1.1. Thu h i các protein ngo i bào
Các protein ngo i bào tương i d thu h i và tinh s ch. T bào và n ng ca
dung d ch ho t ng ư c lo i b m t cách ơn gi n, và có th cung c p tr c ti p
protein thô thích h p cho m t s ng d ng.
- Dung d ch protein tương i s ch có th thu ư c b ng cách cho các nuôi c y sinh
trư ng trên môi trư ng ơn gi n có thành ph n xác nh. Các bư c thu h i và tinh
s ch gi ng như các bư c ã dùng cho protein n i bào sau khi phá v t bào.
1.2. Thu h i các protein n i bào
tách chi t các protein n i bào t các ngu n ng-th c v t, mô ph i ư c phá v
gi i phóng chúng.
1.2.1. Phá v t bào
a. Nguyên lý chung
Làm khô mô là phương pháp thu n l i n nh và phá v t bào ng-th c v t.
Phương pháp ông khô không thích h p phá v mô nhưng tránh ư c s t
gãy protein, m c dù nó vô cùng t trong s n xu t quy mô l n. Mô có th ư c
làm khô trong i u ki n chân không ho c trong không khí, ho c k t t a b ng dung
môi tr n v i nư c. Sau ó, thu d ch chi t enzyme t các nguyên li u khô b ng cách
hydrate hóa tr l i nguyên li u trong m t dung d ch m thích h p. Phương pháp
ông l nh ơn gi n cũng có tác d ng phá v m t ít mô, m c dù ây là phương
pháp không thích h p cho vi c tăng quy mô s n xu t.
M t s nguyên li u ng-th c v t c n có quá trình ng hóa trư c ó, sao cho mô
ư c phá thành nh ng m nh nh và tr n l n v i nhau, sau ó s d ng phương
pháp cơ h c phá v t bào. M t khi protein ư c hòa tan, các v t bào ch t
ư c lo i b d dàng b ng phương pháp l c. Ly tâm t c th p cũng có th ư c
s d ng. m t s mô có s hi n di n c a ch t béo, vi c lo i b l p ch t béo b ng
ly tâm g p nhi u khó khăn. Các ch t béo ch ư c lo i b d dàng b ng tách chi t
dung môi; k t t a acetone là phương th c thích h p tách protein ra kh i các
nguyên li u lipid. M t phương th c khác là các dung môi tr n nư c như hexane,
cũng có th ư c s d ng.
Phá v các t bào vi sinh v t thư ng g p nhi u khó khăn hơn các t bào ng th c
v t. Các t bào vi sinh v t thư ng dai hơn và có kích thư c nh (kho ng 0,2-10
µ m) nên ph i có phương pháp phá v c bi t. Nhi u enzyme t n m men và các
vi khu n Gram âm có th ư c chi t b ng cách dùng các dung môi không tr n
nư c, như toluen ho c chloroform, có th phá v màng t bào và gi i phóng
enzyme. Các dung môi hòa tan nư c, như ethanol và 2-propanol, ư c dùng
tách chi t enzyme t kho ng gian bào, nhưng s d ng các dung môi này òi h i
mc an toàn cao trong s n xu t quy mô l n. Các ch t t y thích h p có th
ư c dùng tách chi t các phân t enzyme nh (kh i lư ng phân t dư i 70.000
Da).
Trong m t s trư ng h p enzyme n nh giá tr pH cao, có th s d ng dung
d ch ki m phân gi i các t bào vi khu n. Thành t bào vi khu n ư c phân gi i
b ng lysozyme, tuy nhiên giá thành c a enzyme này là r t cao. Tương t , n m men
nguon tai.lieu . vn
