Xem mẫu
- III. Các phương pháp tách dòng gen
Tách dòng gen (gene cloning), còn ư c g i v i nhi u tên khác nhau: t o dòng
gen, nhân dòng gen, phân l p gen…Tách dòng gen là t p h p các k thu t nh m ưa
m t gen, m t o n DNA c n thi t (DNA ensert) vào t bào ch (host cell), t o i u
ki n tích h p các t bào ch phân chia, t o nên vô s các t bào cùng mang m t
o n DNA insert gi ng nhau, t o nên m t dòng t bào tái t h p mang gen c n tách
dòng.
Tách dòng gen có t h ư c th c hi n theo nhi u phương pháp khác nhau.Các
phương pháp tách dòng gen ch y u u c s d ng nhi u trong công ngh sinh h c
phân t là tách dòng th c nghi m (cloning in vitro) và tách dòng o (cloning in
silico).
1. Tách dòng invitro.
Tách dòng in vitro hay tách dòng th c nghi m là tách dòng gen ư c th c hi n
t các m u sinh h c (mô t vào, lông tóc, d ch sinh h c…), mang các gen c n tách
dòng ho c t ng h p nhân t o o n gen c n tách dòng.
Tách dòng in vitro g m phương pháp khác nhau, có th tách dòng t DNA, tách
RNA ho c tách dòng trên cơ s
dòng t trình t cac acid amin trong chu i
polypeptid….
1.1. Tách dòng gen t DNA:
Tách dòn t DNA g m các bư c cơ b n sau:
Bư c 1: Chuân b gen c n tách dòng (gen c n thi t, gen ích - target gene) và
ch n vectơ tách dòng.
- Chu n b gen c n tách dòng:
Trong các phòng thí nghi m sinh h c ph n t gen c n tách dòng thư ng ư c
tách chi t t các m u sinh h c. Phương pháp này chu n b gen tách dòng b ng t ng
h p nhân t o t các oligonucleotid ít ư c s d ng, do k thu t ph c t p, t n kém và
chu n xác không cao.
Trư ng h p chưa bi t trình t c a gen c n tách dòng, ph i d a vào kích thư c
ch n l c o n gen c n tách dòng. Các bư c th c hi n ch
c a gen c n tách dòng
y u: tách chi t DNA b gen, nhân gen b ng PCR, s d ng enzym gi i h n c t thành
các o n DNA nh , i n di trên gel agar (ho c gel polyacrylamid) v i thang DNA
1
- i n di, d a vào kích thư c c a gen c n tách dòng l a ch n ư c
chu n. T k t qu
o n DNA ch a gen c n tách dòng.
Sơ k thu t tách dòng th c nghi m
- Ch n vectơ tách dòng
D a vào kích thư c gen c n tách dòng và m c ích tách dòng ch n vectơ
tách dòng là plasmid, phage, các nhi m s c th nhân t o…
Bư c 2: T o vectơ tái t h p.
S d ng các enzym gi i h n thích h p c t các gen c n tách dòng và vectơ tách
dòng nh ng v trí c hi u gi ng nhau, t o i u ki n thu n l i cho quá trình tái t
h p gi a vectơ tách dòng và các o n DNA inset. S d ng enzym n i DNA ligase g n
các gen c n tách dòng vào vectơ có hi u qu , hình thành các vectơ tái t h p
(recombinant vectơ).
hi u qu t o vectơ tái t h p cao, c n chú ý t l thích h p gi a vectơ tách
dòng và các o n DNA insert, ng th i b sung các enzym n i DNA thích h p.
Enzym T4DNA ligase xúc tác hình thành các liên k t phosphoeste n i các do n DNA
2
- u b ng v i nhau, nên ư c s d ng r t r ng rãi trong t o vectơ n i các o n
ct
DNA.
Bư c 3: Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch .
Bi n n p vectơ tái t h p vào t bào ch (host cell) b ng các phương pháp khác
nhau: Siêu âm, vi tiêm, b n gen, s d ng PEG (polyethylen glycol)… V i các t bào
ch là vi khu n thư ng s d ng phương pháp bi n n p s c nhi t. Phương pháp s c
nhi t có hi u qu cao v i các t bào ch là vi khu n E.coli và m t s loài vi khu n
khác. Trư ng h p t bào ch là n m men có th s d ng phương pháp bi n n p là
xung i n, bán gen….
Bư c 4: Sàng l c các dòng tái t h p
Sàng long (screeing) các th tái t h p nh m ch n l c các t bào mang vectơ tái
t h p trong qu n th . Tuỳ thu c gen ch th (marker) trong các vectơ tái t h p là ch
l a ch n phương pháp thích h p.
th kháng sinh, ho c ch th màu
Bư c 5: Nuôi c y dòng tái t h p thu sinh kh i và protein tái t h p.
Nuôi c y các dòng tái t h p trong môi trư ng dinh dư ng các i u ki n thích
t 108 - 109 t bào/1ml có th li tâm thu sinh kh i t bào.
h p, khi m t t bào
1.2. Tách dòng gen t RNA thông tin (mRNA).
Tách dòng gen t mRNA là m t quá trình ph c t p, có th th c hi n theo các
bư c sau:
Bư c 1: Tách chi t mRNA
RNA thông tin ư c tách chi t theo các protcol thông d ng trong các phòng thí
nghi m. Có th s d ng s c kí ái l c v i bi t có mang oligo nucleotid T. Các phân t
mRNA có uôi poly A t o liên k t v i oligo - dT, làm cho các phân t mRNA bám
trên b m t các viên bi t . S d ng k thu t li tâm phân o n tách mRNA ra kh i bi t
- 850C
thu mRNA. Có th gi mRNA nhi t ti p t c nghiên c u.
Bư c 2: T ng h p cDNA m ch kép.
d ng k thu t PCR ngư c có s tham gia c a enzym phiên mã ngư c
S
(reverse transcriptase enzyme), enzym DNA polymerase t ng h p cDNA (cDNA
complêmntary DNA). Thu phân s i khuôn mRNA b ng enzym RNase H, sau ó b
t ng h p s i ơn cDNA th hai, t o
sung enzym DNA polymerase và các dNTP
phân t cDNA m ch kép.
3
- Bư c 3,4,5: G n cDNA m ch kép v i các vectơ tách dòng thích h p, hình thành
các vectơ tái t h p. Bi n n p vào t bào ch , sau ó sàng l c các t bào mang vectơ
tái t h p và c y truy n vào các ng th ch nghiêng t o nên các dòng khác nhau u c
tách dòng t mRNA.
Tách dòng gen t mRNA
K t qu t mRNA có th t o nên các dóng vi khu n mang o n cDNA m ch
kép, tương ưng v i các gen c n tách dòng.
2. Tách dòng in sillico.
Tách dòng in silico hay tách dòng o (cloning in silico) là s t ng h p, phân
tích các k t qu tách dòng gen in vitro, trên cơ s thông tin t các ngân hàng d li u
(STS, EST…) l a ch n m t o n DNA ho c m t gen c n thi t nào ó.
K t qu tách dòng in silico cho phép l a ch n phương án thi t k vectơ tái t
h p có hi u qu , d toán trư c k t qu tách dòng và hi u qu bi u hi n gen cũng như
mc thành công c a th c nghi m.
4
- Bư c 1: S d ng ph n m m pDRAW 32 ch n vectơ tách dòng. Gi i thi t
ch n vectơ pCR 2.1 trong các lo i vectơ hi n th , ng th i ki m tra rình t nucleotid
c a vectơ pCR 2.1 và tìm v trí c t c a enzym gi i h n thích h p. Ví d , o n DNA
insert có kích thư c 958 bp, có th ài g n vào vectơ pCR 2.1 v trí 294 và k t thúc
v trí 1252 .
IV. Ngân hàng b gen (genome bank)
1. Khái ni m ngân hàng b gen.
Ngân hàng b gen là t p h p các o n DNA b gen ư c tách dòng trong t bào
ch , t o nên các dòng t bào khác nhau, m i dòng mang m t o n DNA khác nhau c a
b gen. B gen c a sinh v t b c cao g m các gen phân o n, có các exon xen k
intron. Do ó, ngân hàng b gen bao g m các o n DNA có các trình t mang mã di
truy n (exon) xen k v i các trình t không mang mã di truy n (intron).
M i lo i enzym gi i h n c t c hi u DNA nh ng trình t nh t nh. M t b
gen, khi s d ng các lo i enzym gi i h n khác nhau, t o nên s lư ng o n c t khác
nhau, s hình thành nên các ngân hàng b gen khác nhau.
2. Thi t l p ngân hàng b gen.
Thi t l p ngân hàng b gen có th th c hi n các m c khác nhau: ngân
hàng gen c a m t nhi m s c th , m t t bào hay m t loài.
Thi t l p ngân hàng b gen có th th c hi n theo các bư c cơ b n sau:
Tách chi t và tinh s ch DNA b gen, s d ng m t ho c m t s lo i enzym gi i
h n c t DNA b gen thành t ng o n có kích thư c nh theo ý mu n.
Tách riêng t ng o n DNA và g n v i m t vectơ tách dòng t o nên các vectơ
tái t h p, m i vectơ tái t h p ư c chuy n vào m t t bào ch t o nên m t dòng.
5
- Sơ thi t l p ngân hàng b gen
V. Ngânhàng cDNA
Tách chi t và tinh s ch mRNA c a t bào, mô t ng th i i m nh t nh thu
ư c s lo i mRNA tương ng v i s gen ang ho t ng trong t bào. S d ng k
thu t phiên mã ngư c t mRNA t o nên các cDNA tương t ng, m i cDNA ư c g n
vào m t vectơ tách dòng, t o nên các còng cDNA khác nhau.
T p h p t t c các mRNA thu u c t m t lo i t bào, các giai o n phát tri n
khác nhau t o nên t p h p cDNA ư c tách dòng g i là ngân hàng cDNA c a m t t
bào.
1. K thu t phiên mã ngư c t o cDNA.
Ký thu t phiên mã ngư c t o cDNA khác nhau, g m hai nhóm phương pháp
ch y u:
1.1 Phiên mã ngư c b ng phân hu hoàn toàn s i khuôn mRNA
S d ng k thu t PCR v i các m i c hi u có uôi oligo - dT, các lo i
nucleotid t do và enzym DNA polymerase, t s i khuôn mRNA t ng h p s i ơn
cDNA có c u trúc k p tóc (hairpin loop) u cu i ( u 3'). S d ng enzym RNase H
phân hu hoàn toàn s i khuôn mRMA, ng th i b sung enzym DNA polymerase
và các nucleotid t do t ng h p s i ơn cDNA th 2, nh kéo dài c u trúc k p tóc (c u
trúc vòng). X lý enzym S1 nuclease c tb o n c u trúc k p tóc, t o nên phân t
cDNA có c u trúc xo n kép, mang mã di truy n tương ng v i gen mã hoá mRNA.
6
- Sơ ò t o cDNA theo cách phân hu hoàn toàn mRNA
1.2. Phiên mã ngư c t o cDNA theo k thu t RACE
K thu t RACE g n các bư c tương t như tách dòng t mRNA.
Sau khi t ng h p ư c cDNA m ch ơn, thu phân toàn b phân t mRNA
b ng RNase H. Th c hi n k thu t n i thêm uôi poly C (CCCC) vào u 3' c a
cDNA nh enzym terminal transferase và ATP. B sung thêm các m i oligo dG
(GGGG), dNTP, enzym DNA polymerase và th c hi n nhân gen PCR t ng h p
m ch cDNA th hai.
7
- S d ng k thu t RACE tách dòng gen t mRNA
2. Thi t l p ngân hàng cDNA
Ngân hàng cDNA có th xây d ng trên m t nhi m s c th , m t cơ quan ho c
toàn b cơ th .
T m i phân t mRNA thu ư c, th c hi n phiên mã ngư c t o nên m t cDNA
m ch kép. M i phân t cDNA m ch kép ư c g n vào m t vectơ tách dòng và chuy n
vào m t t bào ch o nên các dòng cDNA.
8
nguon tai.lieu . vn
