Xem mẫu
- 8/30/2016
Bài 1: Quan sát hình thái vi sinh vật
Thực hành 1. Giới thiệu kính hiển vi quang học
2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm
Vi sinh vật đại cương 3. Phương pháp nhuộm màu Gram
4. Quan sát tiêu bản nhuộm
I. Sử dụng kính hiển vi quang học
Mục đích
(light microscope)
• Làm quen với cấu tạo kính hiển vi quang
học. Nắm được cách sử dụng
• Học cách làm tiêu bản cố định và phương
pháp nhuộm Gram
• Quan sát một số hình thái cơ bản của vi
khuẩn, nấm men, nấm mốc
1.1. Cấu tạo kính hiển vi quang học b. Phần quang học
Bộ phận chiếu sáng:
a. Phần cơ học
Tụ quang kính: gồm nhiều thấu kính ghép
• Thân kính: dịch chuyển lên xuống nhờ núm điều chỉnh lớn để lại với nhau hội tụ các tia sáng xuất phát
đưa ảnh của vật quan sát vào đúng tiêu điểm
từ nguồn svà tụ quang kính nền đen
- Bàn xoay (mâm kính): gắn ở phía trên thân kính, nơi gắn các vật
kính áng và được phản xạ lại qua gương
- Ống kính: Gắn ở phía trên thân kính, có thể xoay quanh một trục Có 2 loại tụ quang kính: Tụ quang kính nền
thẳng đứng tùy theo vị trí quan sát. Phía trên ống kính có gắn thị sáng và tụ quang kính nền đen
kính
- Bàn kính/khay kính: nơi để tiêu bản quan sát. Trên bàn kính có
các kẹp giữ tiêu bản. Dưới bàn kính có giá giữ bộ tụ quang kính.
- Đế kính (chân kính): cấu tạo vững chắc đỡ toàn bộ KHV
- Ốc điều chỉnh: gồm
+ Ốc điều chỉnh tiêu bản;
+ Ốc điều chỉnh vĩ cấp (điều chỉnh thô/điều chỉnh lớn);
+ Ốc điều chỉnh vi cấp (điều chỉnh tinh/điều chỉnh nhỏ) Tụ quang kính nền sáng Tụ quang kính nền đen
1
- 8/30/2016
c. Vật kính c. Thị kính
- gồm một hệ thống thấu kính hội - Gồm 2 thấu kính: thấu kính
tụ có tiêu cự ngắn khoảng vài mắt phía trên, thấu kính tụ
mm, đặt trong một vỏ bọc kim phía dưới. Giữa hai thấu
loại kính có màn chắn giữ lại
- Chức năng: Tạo ảnh thực, phóng các tia sáng xung quanh, chỉ
đại, ngược chiều với vật quan để các tia sáng gần với trục
sát. quang đi qua hình rõ nét
hơn (phóng đại thêm ảnh
- Độ phóng đại của vật nghiên cứu của vật kính-vai trò giống
phụ thuộc vào tiêu cự và độ kính lúp)
cong của thấu kính ngoài cùng.
Độ cong càng lớn, thì tiêu cự - Các loại thị kính: 7x, 10x,
càng ngắn độ phóng đại của 15x, 20x
vật kính càng lớn Độ phóng đại của mẫu
quan sát bằng tích số giữa
- Các vật kính: 8x, 10x, 40x, 60x
độ phóng đại của vật kính
(vật kính khô), 100x (vật kính
với độ phóng đại của thị
dầu)
kính
1.2 Giới thiệu một số loại kính hiển vi khác
Phạm vi quan sát của KHV quang học và điện tử
a. Kính hiển vi điện tử
- KHV điện tử truyền qua (Transmission electron
microscope – TEM): sử dụng chùm điện tử có năng
lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng
các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (1.106
lần). Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, hay trên
film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ
thuật số
- KHV điện tử quét (Scanning electron microscope –
SEM): là một loại kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng
khác với TEM: chùm điện tử không truyền qua mẫu mà
hội tụ thành một chùm hẹp và quét trên mẫu, do đó cho
phép ghi ảnh với độ phân giải rất cao
Nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, nguyên tử, virus…
Scanning transmission electron microscope (STEM)
Kính HV điện tử truyền qua (TEM)
SIGMA Advanced Analytical Scanning
Electron Microscope SEM
2
- 8/30/2016
KHV huỳnh quang Kính hiển soi nổi
• Kính hiển vi phản pha Trái: quan sát với KHV quang học.
(fluorescence microscope) Phải: với KHV phản pha (40x)
(stereoscopic microscope) (Phase contrast
microscopy-Nobel prize
1953): Ánh sáng xuyên
qua các vật thể trong
suốt, không màutiêu
bản không cần nhuộm
• Kính hiển vi nền đen
(dark field microscope):
loại những chùm tia sáng
không phân tán từ ảnh
vật vùng xung quanh
vật quan sát thường tối
1.3. Cách sử dụng kính hiển vi quang học
a. Chuẩn bị:
- Kính hiển vi, dầu soi, dầu lau, sổ ghi chép, bút…
- Chuẩn bị tiêu bản quan sát
- Tư thế ngồi quan sát kính HV: ngồi ngay ngắn, đặt sổ ghi chép bên
tay phải (nếu thuận tay phải)
A C b. Quan sát với vật kính khô:
- Cắm điện và bật công tắc đèn
- Điều khiển kính tụ quang bằng bàn tay trái: Nâng lên ở mức hợp lý;
+ Mở hệ thống chắn sáng tối đa và điều chỉnh khi có tiêu bản để được
ảnh của mẩu vật đẹp nhất theo ý muốn.
- Đặt tiêu bản quan sát lên khay kính, điều chỉnh vị trí cần quan sát
trên tiêu bản
- Chọn vật kính quan sát: Ví dụ Nấm mốc 4x, 10x; Nấm men 40x
B D
- Sử dụng ốc điều chỉnh vĩ cấp để nâng tiêu bản lên sát với vật kính;
A. Nấm men quan sát vơi KHV quang học Mắt nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính xuống đến khi nhìn thấy chớp
B. Nấm men quan sát dưới KHV nền đen ảnh thì sử dụng ốc điều chỉnh vi cấp để chỉnh độ nét của ảnh.
C. Nấm men quan sát dưới KHV phản pha
D. Nấm men quan sát dưới KHV huỳnh quang
c. Quan sát với vật kính dầu
d. Bảo quản sau khi sử dụng kính
(100x)
- Nâng vật kính lên lấy tiêu bản ra.
- Nếu dùng vật kính dầu chú ý:
+ Nhỏ 1 giọt dầu soi kính vào vị trí - Nếu là vật kính dầu thì dùng khăn
vùng định quan sát trên tiêu bản vải/giấy mềm tẩm dầu lau kính xylene
(Hình A) lau nhẹ vào đầu vật kính cho thật sạch.
+ Hạ từ từ vật kính cho đến khi chạm - Đưa vật kính nhỏ nhất vào vị trí tiêu
nhẹ vào giọt dầu (Hình B)
bản.
+ Nhìn vào thị kính, nhẹ nhàng điều
chỉnh ốc điều chỉnh vĩ cấp nâng vật - Tắt công tắc đèn, rút phích cắm khỏi
kính lên cho đến khi thấy chớp ảnh ổ điện.
trên vi trường - Cho kính vào hộp hay đậy kính bằng
Khi nâng vật kính lên vẫn phải đảm bao nilon.
bảo đầu vật kính vẫn ngập trong dầu - Chuyển kính vào tủ lớn có hệ thống
soi (Hình C)
đèn bật thường xuyên để chống mốc và
+ Điều chỉnh thêm ốc chỉnh vi cấp
bụi bẩn.
cho rõ nét.
3
- 8/30/2016
II. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm 2.2. Các bước làm tiêu bản cố định
(tiêu bản cố định) Bước 1: Chuẩn bị vết bôi: Lấy lam kính đã tiệt trùng; sử dụng bút viết
kính vẽ lên một vòng tròn định vị vùng làm vết bôi.
- Tiêu bản cố định được nhuộm màu dùng để nghiên cứu các đặc
điểm hình thái học vsv, kiểm tra độ thuần khiết của giống… Bước 2: Làm vết bôi
+ Đối với mẫu lỏng: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một giọt mẫu, đặt
- Tiêu bản này có thể bảo quản lâu dài
lên vòng tròn trên lam kính và dàn mỏng ra.
- VSV quan sát được giết chết trong quá trình xử lý an toàn + Đối với mẫu rắn: Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1-2 giọt nước cất
cho người quan sát đặt lên vòng tròn; Tiệt trùng que cấy và tiếp tục lấy mẫu ở ống giống;
2.1 Các bước chuẩn bị: hòa tan cùng với giọt nước cất dàn mỏng ra
- Chuẩn bị mẫu vật gồm: Bước 3:Làm khô: để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
+ Mẫu lỏng: dung dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic Bước 4: Cố định vết bôi: kẹp chặt tiêu bản, hơ qua lại tiêu bản trên ngọn
+ Mẫu rắn: 01 ống thạch nghiêng nuôi cấy TB nấm men lửa đèn cồn vài lần. Mục đích của bước cố định tiêu bản:
- chuẩn bị dụng cụ gồm que cấy, đèn cồn, nước cất vô trùng, bút - Giết chết vsv an toàn cho người quan sát và giúp cho vsv bắt màu
tốt hơn
viết kính, lam kính sạch
- Giúp cho vsv gắn chặt vào lam kính khi rửa không bị trôi đi
- Chuẩn bị lam kính: + chọn lam kính sạch, hơ qua lại trên ngọn - Giữ nguyên hình dạng và kích thước khi nhuộm
lửa đèn cồn để làm sạch. Lưu ý: + tránh đun tiêu bản còn ướt trên ngọn lửa đèn cồn
+ Sử dụng bút viết kính ghi ký hiệu mẫu tiêu bản cần nhuộm + Tiệt trùng que cấy ngay sau khi sử dụng
III. Phương pháp nhuộm Gram
3.1. Lịch sử:
- Là phương pháp nhuộm màu nhằm phân biệt vi khuẩn Gram
âm và Gram dương
- Do Christian Gram (1853-1938), nhà vật lý người Đan mạch
phát minh
Cố định tiêu bản 3.2. Chuẩn bị thuốc nhuộm
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ nhất: Tím gentian/ Crystal violet
- Dung dịch cố định màu: Dung dịch lugol
- Dung dịch tẩy màu: Cồn axeton
- Dung dịch thuốc nhuộm thứ hai: Đỏ phenol/ Fuchsin/
Safranin
- Nước rửa: Nước sạch
Tiêu bản sau khi cố định
3.3. Các bước nhuộm Gram
Gồm 4 bước
Bước 1: Nhỏ dung dịch Tím gentian ngập vết bôi để 1-2 phút. Sau đó
rửa thuốc nhuộm thừa với nước sạch: Nghiêng lam kính 45o, cho
nước chảy từ đầu đến cuối lam kính, đến khi không còn màu tím
Bước 2: Cố định màu với dung dịch Lugol: nhỏ dung dịch ngập vết bôi,
để 1 phút Rửa với nước sạch vẩy khô
Bước 3: Tẩy màu với cồn 95%: Nghiêng phiến kính 45o, tẩy cồn cho đến
khi không còn màu tím. Sau đó rửa lại ngay bằng nước sạch, vẩy khô.
Bước 4: Nhuộm màu với đỏ phenol: Nhỏ thuốc nhuộm ngập vết bôi, để 1 phút
Rửa thuốc nhuộm thừa với nước làm khô, sử dụng giấy thấm hoặc hơ
qua ngọn lửa đèn cồn Pseudomonas (gram -) E. coli (gram -) Salmonella (gram -)
Lactobacillus sp. (gram +) Staphylococcus aureus (gram +) Bacillus cereus (gram +)
4
- 8/30/2016
Nấm men: giả khuẩn ty (mũi tên) Nấm men Saccharomyces
nảy chồi (mũi tên)
Nấm men nảy chồi (mũi tên)
Yêu cầu báo cáo thực hành
1. Quan sát tiêu bản làm sẵn
+ Tiêu bản vi khuẩn (E. coli, Staphylococcus…)
+ Tiêu bản nấm mốc (vật kính 4x, 10x)
2. Quan sát tiêu bản cố định
+ Tiêu bản vk lactic (vật kính 100x)
+ Tiêu bản nấm men (vật kính 100x)
3. Mô tả hình thái (yêu cầu vẽ hình)
• Hình thái: Hình que, cầu….
• Cách thức sắp xếp: đứng riêng rẽ, nối đôi, nối chuỗi …
• Tính chất bắt màu: Gram âm/dương
• Đặc điểm sinh sản (nấm men, nấm mốc): nảy chồi ?,
hình thành bào tử gì?
Bài 2: Kỹ thuật ria cấy vi sinh vật 2.1. Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv
a. Môi trường đặc (rắn)
Nội dung: Môi trường có sử dụng các chất làm đông đặc môi trường: 1,5-2%
thạch (agar). Một số loại môi trường chủ yếu:
• Giới thiệu các môi trường nuôi cấy vsv Môi trường dinh dưỡng:
• Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa và thạch ống • Môi trường đơn giản/MT cơ sở peptone + agar; môi trường
nước thịt peptone
• Quan sát hình thái khuẩn lạc
• Môi trường phức tạp: có bổ sung các chất dinh dưỡng cao thịt,
Mục đích cao nấm men, casein… + các chất khoáng hoặc các chất đặc hiệu
• Nắm được các kỹ năng, thao tác cơ bản về nuôi Môi trường chọn lọc: MT có chứa những thành phần ưu tiên sự
sinh trưởng của một số VSV và ức chế các VSV khác (ví dụ Mt
cấy vi sinh vật trên các môi trường khác nhau chọn lọc VK sinh protease có bổ sung gelatin/casein…)
• Quan sát sự hình thành khuẩn lạc ở các môi Môi trường chẩn đoán/ phân biệt: Có các thành phần hoặc hóa
trường nuôi cấy khác nhau chất giúp phân biệt các vsv bằng mắt thường (Ví dụ: môi trường
MacConkey phân biệt E. coli và Salmonella)
5
- 8/30/2016
Một số loại môi trường chọn lọc
Mannitol salt agar MacConkey agar Casein media: chọn lọc Protease
MT dinh dưỡng Sabouraud agar: MT chọn lọc cho nấm Môi trường thạch nghiêng
2.2. Phương pháp làm môi trường dịch thể
b. Môi trường dịch thể (lỏng)
a. Môi trường dinh dưỡng dịch thể (Nutrient broth)
• Là môi trường không bổ sung thêm chất đông đặc (thạch) Sử dụng để nuôi cấy các vsv dị dưỡng.
Thành phần: Chuẩn bị: - 500g thịt, loại bỏ xương, mỡ,
Thịt bò (lợn): 500g gân, xay nhỏ. Thêm 1000ml nước cất, để
Peptone: 10g ở nhiệt độ phòng 12h. Sau đó đem đun sôi
NaCl: 5g 30 phút. Đợi nguội lọc bỏ cặn, bã.
Nước cất: 1000ml - Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1lit,
pH: 7.5±0.2 (25 °C) thêm 0,5% NaCl và 1% pepton. Điều
chỉnh pH.
- Hấp khử trùng ở 121o/1atm/20 phút
Sau khi hấp tiệt trùng, chia vào các ông nghiệm hoặc bình tam
giác để sử dụng
b. Môi trường peptone dịch thể (Peptone Water)
• Hòa tan Peptone 1% và NaCl 0.5% với 1 lít nước.
33
• Môi trường này được sử cho các MT lên men đường (bổ sung
thêm 1% đường) và MT kiểm tra phản ứng indole.
2.3 Phương pháp làm môi trường rắn
Môi trường Hansen: Sử dụng để nuôi cấy nấm men
Thành phần: Chuẩn bị:
Glucose: 50g - Cân chính xác thành phần của môi
Pepton: 10g trường, hòa tan với nước cất bằng cách
K2HPO4: 3g đun sôi.
MgSO4.7H2O: 2-5g - Chỉnh pH từ 5-6; Hấp tiệt trùng ở
Agar: 15-18g 121o /1atm/20 phút
Nước cất: 1000ml - MT có màu vàng nhạt
- Khi sử dụng, nuôi cấy ở 30-35oC/24-48h
Môi trường Sabouraud: Sử dụng để nuôi cấy nấm mốc, nấm men
Chuẩn bị:
Thành phần:
- Cân chính xác thành phần của môi trường,
Glucose: 40g/l đun cho tan các thành phần. Chỉnh pH từ
Peptone: 10g/l 5,6±0,2 ở 25o C; Hấp tiệt trùng ở 121o/1atm/15
Thạch: 15g/l phút
- MT có màu kem hoặc vàng nhạt.
6
- 8/30/2016
b. Các bước tiến hành:
2.4. Kỹ thuật ria cấy Bước 1: Lấy giống cần cấy
+ Đốt đèn cồn tiệt trùng que cấy bằng cách hơ que cấy thẳng đứng
2.4.1. Kỹ thuật ria cấy trên thạch ống
trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ để nguội
Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong cấy truyền
+ Lấy ống giống cần cấy: sử dụng ngón tay út + má lòng bàn tay lấy
giống, nhân giống, giữ giống, phân lập/chọn lọc giống
nút bông, tiệt trùng miệng ống Lấy một lượng giống cần cấy
a. Chuẩn bị tiệt trùng miệng ống, đậy nút bông
- Dụng cụ: môi trường thạch nghiêng, que cấy, đèn cồn, Bước 2: Cấy truyền sang môi trường mới:
bút viết kính + Đưa que cấy đã lấy giống xuống đáy ống môi trường mới. Ria que
- Môi trường sử dụng: Hansen agar cấy từ trái sang phải theo đường zich zắc chữ chi về phía miệng ống
- Ống giống: Nấm men Saccharomyces sp. + Tiệt trùng miệng ống đậy nút bông đem nuôi cấy
- Tiệt trùng buồng cấy, tay, dụng cụ trước khi tiến hành Lưu ý: + Tiến hành ria cấy giống trong buồng cấy/phòng vô trùng
- Ghi tên giống, thời gian nuôi cấy lên môi trường mới + Mọi thao tác kỹ thuật cần được tiến hành xung quanh ngọn
lửa đèn cồn
Các bước ria cấy trên thạch ống 2.4.2. Kỹ thuật ria cấy trên thạch đĩa
Mục đích: sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu phân lập, chọn lọc
giống nhằm tách khuẩn lạc thuần.
Các bước chuẩn bị như phương pháp ria trên ống. Chỉ khác phần kỹ
thuật ria
Kỹ thuật ria 2-3 lần đốt que cấy:
Bước 1: Sử dụng que cấy vô trùng, lấy 1 ít giống cần cấy
- Vô trùng miệng đĩa, hé mở nắp hộp lồng, đưa que cấy đã lấy giống
vào, ria ở 1/3 đĩa dừng lại, đốt que cấy lần 1
Bước 2: Đợi que cấy nguội; Xoay đĩa sang trái1 góc 45o; Đặt que
cấy vào đường ria cuối cùng của lần ria thứ nhất ria ngang tiếp 1/3
đĩa đốt que cấy lần 2
Bước 3: Làm tiếp tục như bước 2, ria nốt 1/3 đĩa còn lại vô trùng
miệng đĩa, nuôi cấy trong tủ ấm ở trạng thái úp ngược
7
- 8/30/2016
2.5. Đánh giá sinh trưởng của vsv trên môi
trường thạch
VSV sinh trưởng trên môi trường đặc (rắn) sẽ hình thành khuẩn lạc
Khuẩn lạc là sự tập trung một số lượng lớn tế bào ở cùng một nơi, được
hình thành từ một tế bào ban đầu.
Sự sinh trưởng được đánh giá thông qua các tiêu chí:
- Số lượng khuẩn lạc (đếm bằng phương pháp pha loãng nồng độ)
khuẩn lạc vi khuẩn khuẩn lạc vk lactic khuẩn lạc nấm men
- Hình thái, kích thước của khuẩn lạc
- Rìa, bề mặt, trạng thái, kết cấu khuân lạc
- Màu sắc của khuẩn lạc;
- Mùi của môi trường
Hai dạng khuẩn lạc thường gặp:
- Khuẩn lạc láng bóng (dạng S): thường có bề mặt cong lồi, rìa gọn mịn,
mặt láng bóng, nhẵn.
- Khuẩn lạc nhám (dạng R): bề mặt nhám xù xì, rìa nhọn hay có góc cạnh.
khuẩn lạc nấm mốc
8
- 8/30/2016
Yêu cầu báo cáo
• Quan sát hình thái khuẩn lạc ở các đĩa nuôi
cấy:
- Hình thái khuẩn lạc
- Màu sắc
- Trạng thái
- Rìa
- Bề mặt
- Kích thước: sử dụng thước đo
9
nguon tai.lieu . vn
