- Trang Chủ
- Sinh học
- Bài giảng công nghệ sinh học - Chuyên đề 1: Các phương pháp nghiên cứu enzyme
Xem mẫu
- Chuyên đề 1
CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
1
học
- NỘI DUNG
1.1. Các phƣơng pháp xác
định hoạt độ enzyme
2.2. Các phƣơng pháp tách
chiết và tinh sạch enzyme
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh học 2
- 1.1. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HOẠT ĐỘ ENZYME
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
3
học
- NGUYÊN TẮC
• S còn lại
• P tạo thành Có thể xác định được hoạt
độ enzyme nghiên cứu
• Cả S và P
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh học 4
- CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ
ENZYME
• Hai phương pháp:
- Phương pháp phân tích liên tục: đo cơ chất bị biến đổi
hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời
gian
Ứng dụng: khi không có chất hay cách làm ngưng phản
ứng tức thì. Khó áp dụng
- Phương pháp phân tích gián đoạn: cho E tác dụng với
S sau khoảng t nhất định thì làm ngưng phản ứng
Ứng dụng: rất phổ biến; tác nhân ngưng phản ứng: nhiệt
độ cao, thay đổi pH, dùng chất bất hoạt enzyme
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
5
học
- PHƢƠNG PHÁP ĐO ĐỘ NHỚT
• Yêu cầu: độ nhớt
của S phải lớn hơn
nhiều so với P
• Chất có M lớn thì
độ nhớt càng cao:
AN, protein,
cellulose
Nhớt kế Brookfield - USA
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
6
học
- PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ
UV-vis Biorad
• Yêu cầu: S, P có khả năng hấp thụ ánh sáng phân cực ở các
xác định
• Điều quan trọng: là xác định được của P hoặc S
• Ví dụ: NADH (340nm); Phosphoenolpyruvat – PEP (240 nm),
Aa (260-280 nm),….
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
học 7
- PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ
• Yêu cầu: pứ E có
sự hình thành
acid hoặc base
• Áp dụng: xác
định hoạt độ
lipase
• Ưu điểm: độ
chính xác cao METTLER TOLEDO T70
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
8
học
- PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC
• Yêu cầu: P là các
chất màu có độ
hấp thụ ánh sáng
cực đại ở vùng nào
đó
• Áp dụng: xđ hoạt
độ enzyme -
amylase
• Kiểm tra mức độ
nấu malt bia
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
9
học
- PHƯƠNG PHÁP HUZNH QUANG
• Áp dụng: Khi các phương
pháp thông thường không
xác định được
• Cơ sở: dựa trên sự hình
thành các bức xạ của các
chất đồng vị phóng xạ gắn
vào S tại nhóm chức thích
hợp để có thể đo độ phóng
xạ (sự phân rã) của S còn
lại, hay P tạo thành
• Ví dụ: ATPase với cơ chất -
[P32]-ATP. Sau pứ tạo thành
P32 va ADP
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
10
học
- ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG KHI TIẾN HÀNH
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME
1
S và Cofactor ở mức độ dư thừa
2
Thời gian xác định càng ngắn càng tốt
3
Cần có sự biến đổi tuyến tính giữa [E] , t phản
ứng, và mức độ chuyển hóa S
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
11
học
- MỘT SỐ LƢU Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ
HAY THỰC HIỆN PHẢN ỨNG E
1 - Chọn pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp
2 – Lưu ý đến S, thành phần đệm, lực ion hay nồng
độ muối, các chất làm bền như Ca2+, glycerol, BSA,…
3- S, E, đệm đều phải đạt cùng 1 nhiệt độ khi tiếp
xúc với nhau để bắt đầu phản ứng
4-Phải luôn có mẫu kiểm tra nhất định để tránh sai
số
5- Chọn cách làm ngưng phản ứng thích hợp
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
12
học
- ĐƠN VỊ ĐO HOẠT ĐỘ ENZYME
• Đơn vị IU (International unit)
1IU = 1 µM cơ chất/phút
• Đơn vị Katal (Kat) – ít được dùng
1 kat = 1M cơ chất/ giây
1IU = (1/60). 10-6 kat = 16,66 nkcat
1 kcat = 60. 106 IU
• Hoạt độ riêng (specific activity) – dùng khi tinh
sạch E
…được tính bằng số đơn vị hoạt độ E trên một đơn
vị khối lượng (miligam hay gam) protein
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
13
học
- 1.2: CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH
CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
14
học
- GIÁ THÀNH ENZYME
PROTEASE: papain protease LIPASE: 9001-62-1
Huangpu Port etc: 300 USD/kg Dianmei: 70-80 USD/kg
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
15
học
- KHU TRÚ CỦA E
• Enzyme ngoại bào: e. hydrolase; tổng hợp
trong TB rồi sau đó tiết ra môi trường nuôi cấy
chìm,…
• Enzyme nội bào: được tổng hợp và sử dụng
bên trong tế bào; thường ở dạng liên hợp;
“nhốt” trong các bào quan TB
• Các enzyme periplasmic: E nằm ở xoang ngoài
màng sinh chất nhưng trong màng TB
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
16
học
- NHỮNG ĐIỀU CẦN LƢU Ý KHI TÁCH CHIẾT VÀ
TINH SẠCH E
CẦN TUÂN THỦ
Vì E là protein: dễ mất hoạt tính sinh học nên:
• Chọn dung dịch chiết thích hợp
• Chọn nhiệt độ chiết: khoảng 40C
• Bổ sung chất làm bền: CaCl2, MgCl2 2-5nM, glycerol 10-20%
• Chất chống oxy hóa: betas-mercaptoethanol; dithiothreitol
1-5mM
KHÍA CẠNH SX:
- E khó giữ được hoạt tính. Nên E có hoạt tính cao thì càng
đắt
- Xây dựng quy trình công nghệ đơn giản nhất có thể
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
17
học
- THU NHẬN CHẾ PHẨM E THÔ
• Phá vỡ màng tế bào: siêu âm, dùng E
(lysozyme), máy nén, sốc nhiệt, nghiền với cát
thủy tinh, nghiền bi
• Thu dịch chiết E: ly tâm
• Cô đặc dịch chiết ở t thấp
• Tủa protein: etanol, aceton, muối trung tính
như ammonium sulfate
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
18
học
- TÁCH TỪNG PHẦN VÀ TINH SẠCH ENZYME
• Sắc kí trao đổi ion: dùng ở bước đầu
• Sắc kí lọc gel: thường dùng với mẫu đã cô đặc,
thể tích mẫu nhỏ
• Ly tâm siêu tốc: cần có gradient nồng độ là
glycerol hay saccharose
• Sắc kí ái lực: nhanh chóng nhất hiện hay, khó
khăn là không tìm được chất gắn thích hợp
• Điện di chế phẩm: áp dụng ở quy mô rất nhỏ
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
19
học
- SẮC KÍ TRAO ĐỔI ION
- Thường được dùng ở bước tinh sạch ban đầu
- chất nhồi (nền) là cellulose, sephadex hay sepharose được gắn các nhóm chức tích điện dương như
DEAE (diethylaminoethyl), QAE (quaternaly aminoethyl), hoặc tích điện âm như CM (carboxyl
methyl), SP (sulphoproxyl)
- Ái lực lk giữa E với gel trao đổi ion phụ thuộc vào mức độ tích điện của mẫu
- Lựa chọn pH của mt sắc kí trao đổi ion cho phép E cần tinh sạch gắn với gen hoặc không gắn
TS. Bùi Xuân Đông - Bộ môn Công nghệ sinh
20
học
nguon tai.lieu . vn