1. Trang Chủ
  2. Hoá dầu
  3. Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào tử nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum)

Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào tử nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum)

Mục đích của nghiên cứu này là xác định phương pháp phá vách bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum. Enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại C20032 hoạt động tối ưu ở 500C và pH 5. Tỉ lệ phá v vách bào tử bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum khi kết hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại cellulase C20032 ở 500C, pH 5 trong 10 ngày là 53,5%. Mời các bạn cùng tham khảo! Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An nin

Thể loại Tài liệu miễn phí Hoá dầu

Số trang 12

Ngày tạo 4/2/2023 2:36:51 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.61 M

Tên tệp

Tải Ứng dụng enzyme và siêu âm phá vách bào tử nấm Lin... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 ỨNG DỤNG ENZYME VÀ SIÊU ÂM PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) *Đặng Thị Kim Tuyền; Trần Điền Ánh Tuyết Trường Đại học Công nghệ TP.HCM Email: *dtkimtuyen96@gmail.com TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu này là xác định phương pháp phá vách bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum. Enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại C20032 hoạt động tối ưu ở 500C và pH 5. Tỉ lệ phá v�vách bào tử bào tử nấm Linh Chi Ganoderma lucidum khi kết hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm thương mại cellulase C20032 ở 500C, pH 5 trong 10 ngày là 53,5%. Sau khi xử lý enzyme, áp dụng chế độ siêu âm công suất 500 W trong 5 phút ở độ khuếch đại 100%, tỉ lệ phá v�bào tử tăng lên đến 71,7%. Tiền xử lý bào tử trước khi thực hiện phản ứng enzyme là bước không thể thiếu, tuy nhiên không có sự khác biệt về tỉ lệ phá v�vách bào tử giữa 4 điều kiện nhiệt độ là -40C, -200C, -700C (đá khô) và -1960C (nitơ lỏng). Sau khi phá v�bào tử bằng enzyme, dịch trong sau ly tâm chứa 12,03% polysaccharide và 50,5% lipid tổng, trong khi đó từ phần vỏ bào tử chỉ thu được 0,04% polysaccharide và 1,08% lipid tổng. Sau khi phá v�bào tử bằng enzyme kết hợp siêu âm, dịch trong sau ly tâm chứa 16,80% polysaccharide và 86,17% lipid tổng, trong khi đó từ phần vỏ bào tử chỉ thu được 0,03% polysaccharide và 6,75% lipid tổng. Từ đó, quy trình phá v�bào tử nấm Linh chi bằng enzyme kết hợp siêu âm và thu hồi hoạt chất từ bào tử phá v�được đề nghị. Từ khóa: chitinase, phá vách bào tử Ganoderma lucidum, polysaccharide, lipid, siêu âm. GIỚI THIỆU Bào tử Linh Chi (Ganoderma lucidum spores) có kích thước rất nhỏ (khoảng 5-6 × 8,5 – 12 μm), chứa các thành phần có hoạt tính sinh học như polysacharide, triterpenoid, acid béo, amino acid, vitamin và các nguyên tố vi lượng với hàm lượng đậm đặc hơn thể quả nấm Linh Chi từ 7 – 20 lần (Cheng CR et al., 2010, Heim et al., 1992, Boh B et al., 2007). Các hoạt chất này có giá trị dinh dư�ng và dược lý có thể tăng cường sức khỏe, giúp ngăn ngừa ung thư và tái phát. Tuy nhiên, bào tử Linh Chi có lớp vách đôi rất cứng, dày c�0,7 - 1,2 μm, enzyme tiêu hóa của cơ thể người không thể phá v�. Chỉ khi nào vách ngoài của nó bị phá v�thì các hợp chất có hoạt tính sinh học đó mới phát huy tác dụng quý giá trong trị liệu. Thành phần vách bào tử nấm Linh Chi chứa 19,01% Si, 19,01% Ca, 52,08% - 57,64% là chitin (Jingjing Ma et al., 2007). Cấu trúc phức tạp của vách bào tử nấm Linh Chi nhờ sự liên kết của cellulose với các thành phần trên tạo ra vách bền vững giúp cho bào tử nấm Linh Chi chống chịu được acid và kiềm. Việc phân hủy 391
  2. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 chitin đóng vai trò rất quan trọng trong việc phá vách bào tử nấm Linh chi. Nhiều nghiên cứu phá v�vách bào tử sử dụng phương pháp nghiền. Một số khác sử dụng enzyme để giảm thiểu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính sinh học hoạt chất trong bào tử (Patent CN 101596220 A, 2009). Các thông số kỹ thuật của các quá trình này đều không được công bố rõ ràng. Đó là lý do nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định các thông số phá v�bào tử nấm Linh Chi bằng enzyme và kết hợp siêu âm, từ đó có thể trích ly các hoạt chất đưa vào ứng dụng. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Bào tử nấm Linh Chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh, sấy ở nhiệt độ 400C, bảo quản trong điều kiện khô ráo. Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ thể quả nấm Linh Chi do phòng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng trường Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp. Enzyme thương mại C20032 được cung cấp bởi công ty TNHH Khoa học và Công nghệ Sài Gòn. Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 Môi trường chứa glucose 1 g/L, chitin huyền phù 10 g/L, NH4NO3 0,5 g/L, MgSO4.7H2O 0,5 g/L, K2HPO4 0,7 g/L, KH2PO4 0,3 g/L, FeSO4.7H2O 0,01 g/L, ZnSO4 0,001 g/L, chloramphenicol 0,005 g/L, hấp tiệt trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Cấy bào tử Trichoderma harzianum T2 đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA với mật độ 106 bào tử/ml, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày nuôi cấy, thu dịch trong sau khi ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt động enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 (DNC) và chế phẩm C20032 (EC) Hoạt động của enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy được xác định với cơ chất là chitin 1%, nhiệt độ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, pH 4, 5, 6, 7. Thời gian phản ứng là 60 phút, bất hoạt enzyme bằng cách đun sôi 5 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút thu dịch nổi. Đường khử tạo thành được xác định bằng phương pháp DNS đo ở bước sóng 535 nm dựa trên đường chuẩn glucosamine (Elson et al., 1933). Từ đó xác định t0opt và pHopt của dịch nuôi cấy. Khảo sát động học phá vách bào tử nấm Linh Chi bằng hỗn hợp enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2, enzyme thương mại C20032 20 g bào tử nấm Linh Chi trong 200 ml nước cất được lạnh đông ở -40C trong 12 giờ, sau đó rã đông ở nhiệt độ phòng và thu hồi bằng ly tâm 4000 vòng/ phút trong 10 phút, cuối cùng được ngâm có khuấy từ trong 300 ml dung dịch enzyme T. harzianum T2 bổ sung 300 ml dung dịch C20032 10%, 400 ml đệm acetate 50 mM pH 5 ở 500C. Sau thời gian tối đa 10 ngày, bào tử 392
  3. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 nguyên vẹn được đếm trong buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại x100 và tỉ lệ phá v�bào tử được xác định. Hoạt lực chitinase được xác định trong điều kiện tiêu chuẩn cơ chất chitin 1%, pH = 5, nhiệt độ 500C, thời gian 60 phút. Một đơn vị hoạt lực chitinase là lượng enzyme xúc tác thủy phân chitin tạo ra 1 µmol glucosamine trong thời gian 1 phút ở điều kiện phản ứng. Phá vỡ bào tử bằng sóng siêu âm Hút 15 ml dịch bào tử sau khi ủ enzyme bổ sung 15 ml đệm tiến hành siêu âm bằng máy phá tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica với công suất 500 W, độ khuếch đại 100% trong 5 phút, giữ mẫu trong đá lạnh kiểm soát nhiệt độ mẫu không quá 500C. Tỉ lệ phá v�bào tử được xác định. Ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý bào tử nấm Linh chi bằng lạnh đông 2 g bào tử bổ sung 20 ml nước cất được lạnh đông ở -40C (ngăn đá tủ lạnh), -200C (tủ đông), - 700C (đá khô), -1960C (nitơ lỏng) trong 12 giờ, rã đông ở nhiệt độ phòng và thực hiện các bước khảo sát tương tự như phương pháp phá bào tử đã nêu trên. Tỉ lệ phá v�bào tử được xác định. Xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử Tỉ lệ phá vỡ bào tử (%) = (số lượng bào tử ban đầu - số lượng bào tử sau xử lý)/ số lượng bào tử ban đầu × 100 Định tính các hợp chất có trong bào tử nấm Linh Chi Huyền phù bào tử sau khi thực hiện phản ứng enzyme và siêu âm được ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi sau ly tâm được trích ly lỏng lỏng bằng cùng thể tích diethyl ether thu pha hữu cơ. Sau khi đuổi dung môi, phát hiện saponin được thực hiện theo Fontan-Kaudel, protein sử dụng thử nghiệm Biuret, carbonhydrate được thực hiện theo thử nghiệm Molisch và triterpenoid được thực hiện theo thử nghiệm Liebermann-Burchard (Saha et al., 2011). Định lượng polysaccharide tổng số bằng phương pháp Phenol – Sulfuric (Brennan et al., 2008) Định lượng lipid tổng số bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb (Pearson’s Composition and Analysis of Foods, 9th Edn, 1991) Phân tích thống kê Kết quả được thể hiện dưới dạng trung bình  SD. Số liệu được xử lý bằng phần mềm SAS 9.4. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel với độ lệch chuẩn (STD). Mỗi đơn vị thí nghiệm được thực hiện ba lần. 393
  4. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt lực enzyme chitinase của dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 Chủng Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh Chi được sử dụng để sinh enzyme ứng dụng phá v�vách bào tử nấm với kỳ vọng các enzyme trong dịch nuôi cấy, đặc biệt chitinase mang tính đặc hiệu cơ chất chitin trên vách bào tử. Kết quả ở bảng 1 cho thấy enzyme chitinase thể hiện hoạt lực cao nhất ở nhiệt độ 500C, pH 5 với giá trị hoạt lực 0,170 ± 0.001 (U/ml). Từ đó chọn điều kiện nhệt độ 500C và pH = 5 để ứng dụng enzyme từ Trichoderma harzianum T2 phá v�vách bào tử nấm Linh Chi. Bảng 1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt lực chitinase (U/ml) trong dịch nuôi cấy T. harzianum T2 Nhiệt độ pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 (0C) Hoạt lực (U/ml) Hoạt lực (U/ml) Hoạt lực (U/ml) Hoạt lực (U/ml) 30 0,110 ± 0,003 0,151 ± 0,004 0,134 ± 0,008 0,105 ± 0,002 40 0,126 ± 0,012 0,157 ± 0,007 0,135 ± 0,009 0,106 ± 0,002 50 0,127 ± 0,010 0,170 ± 0,001 0,143 ± 0,004 0,118 ± 0,009 60 0,107 ± 0,003 0,150 ± 0,004 0,127 ± 0,002 0,109 ± 0,004 70 0,037 ± 0,014 0,084 ± 0,020 0,077 ± 0,011 0,094 ± 0,022 Ghi chú: Hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt lực enzyme chitinase trong chế phẩm C20032 Vì enzyme do T.harzianum T2 là enzyme chủ đạo trong phá v�bào tử nấm Linh Chi, điều kiện hoạt động của enzyme này được ưu tiên, đặc biệt là pH = 5. Tuy nhiên, chỉ sử dụng enzyme này dẫn đến tỉ lệ phá v�bào tử không đáng kể. Chế phẩm thương mại C20032 được khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt lực chitinase ở pH = 5. Bảng 2: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 pH = 5 Nhiệt độ (0C) Hoạt tính (U/ml) 30 0,234b ± 0,020 40 0,245a ± 0,043 50 0,248a ± 0,031 60 0,227c ± 0,031 70 0,219d ± 0,012 Ghi chú: Hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD 394
  5. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 Bảng 2 cho thấy enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 thể hiện hoạt lực cao nhất ở cả hai nhiệt độ 400C và 500C. Lựa chọn nhiệt độ 500C để kết hợp với enzyme dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 trong các thí nghiệm tiếp theo là thích hợp. Ảnh hưởng của tỉ lệ dịch enzyme Trichoderma harzianum T2 và chế phẩm C20032 10% lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh Chi Bảng 3: Ảnh hưởng tỉ lệ dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% lên tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi theo thời gian Tỷ lệ enzyme T.harzianum T2: C20032 48 giờ 72 giờ 96 giờ 10% 1:0 0,85b ± 0,22 2,49d ± 0,33 3,20d ± 0,85 (3,93:0 U/g) 0:1 0,71b ± 0,24 3,41d ± 0,64 3,91d ± 1,05 (0:6,40 U/g) 1:1 5,33a ± 1,19 13,29a ± 0,81 18,55a ± 0,85 (3,93 + 6,40 U/g) 1:2 (3,93+12,80 U/g) 4,19a ± 1,01 8,03b ± 0,65 10,95b ± 1,17 2:1 (7,86 + 6,40 U/g) 0,78b ± 0,33 4,98c ± 0,53 6,47c ± 0,96 Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD Kết quả ở bảng 3 cho thấy tỉ lệ % bào tử nấm Linh Chi bị phá v�đạt cao nhất (18,55%) ở ngày theo dõi thứ 4 khi kết hợp dịch nuôi cấy và chế phẩm enzyme C20032 10% theo tỉ lệ 1:1 (NT3 (1 DNC : 1 C20032 10%)). Với việc chỉ sử dụng riêng rẽ dịch nuôi cấy hay chế phẩm C20032 10% để thực hiện thí nghiệm phá vách bào tử nấm Linh Chi nhận thấy kết quả thu được khá thấp (NT1 (1 DNC)), NT2 (1 C 10%)). Khi có sử dụng dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% với các tỉ lệ khác nhau nhận thấy bào tử nấm Linh Chi bị phá vách có tăng lên nhưng không đáng kể (NT4(1 DNC:2 EC10%), NT5(2 DNC:1 EC10%)). Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp enzyme Trichoderma harzianum T2 lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh Chi Nhằm xác định nồng độ enzyme tối thiểu trong phản ứng phá v�vách bào tử nấm Linh Chi nhờ enzyme, tỉ lệ chế phẩm thương mại được giảm dần, trong khi dịch enzyme từ nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 không cần pha loãng hơn. Kết quả được trình bày trên bảng 4. 395
  6. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp enzyme Trichoderma harzianum T2 lên tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi Enzyme T. harzianum Ngày 4 Ngày 7 Ngày 10 T2: C20032 10% 18,98a ± 0,57 21,46a ± 0,96 24,45a ± 1,86 (3,93 + 6,40 U/g) 5% 14,78b ± 0,89 17,20b ± 0,81 18,76b ± 1,54 (3,93+3,20 U/g) 1% 5,19cd ± 0,86 6,47c ± 0,75 7,39cd ± 0,65 (3,93+0,64 U/g) 0,5% 3,91cd ± 0,65 4,83d ± 0,65 6,18cd ± 0,85 (3,93+0,32 U/g) 0,1% (3,93+0,06 U/g) 2,70cd ± 0,65 3,70d ± 0,69 4,26cd ± 0,77 Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,05 theo trắc nghiệm LSD Bảng 4 cho thấy bào tử nấm Linh Chi bị phá v�nhiều nhất ở ngày thứ 10 (24,45%) khi giữ nồng độ chế phẩm C20032 ở 10%. Khi giảm nồng độ C20032 xuống 1%, 0,5%, 0,1% thì tỉ lệ bào tử nấm Linh Chi bị phá v�không đáng kể. Hình 1: Vòng phân giải của hỗn hợp enzyme trên đĩa thạch chứa chitin theo thời gian ủ với bào tử: a) Ngày 0; b) Ngày 3; c) Ngày 7; d) Ngày 9; e) Ngày 10 Việc ủ enzyme và bào tử kéo dài 10 ngày dựa trên cơ sở enzyme vẫn duy trì hoạt tính ở điều kiện thí nghiệm là pH 5 và 50oC. Hình 1 cho thấy sau 10 ngày ủ, enzyme chitinase trong hỗn hợp phản ứng suy yếu nhưng chưa hoàn toàn bất hoạt. Như vậy có thể kéo dài phản ứng enzyme đến 10 ngày để đạt hiệu quả phá v�bào tử cao nhất trong điều kiện thí nghiệm. 396
  7. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 Tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh Chi kết hợp xử lý enzyme và sóng siêu âm Phá v�bào tử nấm Linh Chi sẽ đạt hiệu quả cao hơn khi phản ứng enzyme thực hiện trong điều kiện thí nghiệm có khuấy đảo. Sóng siêu âm được áp dụng sau phản ứng enzyme có thể giúp tăng tỉ lệ phá v�bào tử. Hình 2 tổng hợp tỉ lệ phá v�của bào tử nấm Linh Chi theo ngày (ngày 2, 3, 5, 7, 8, 10) khi ủ bào tử với enzyme Trichoderma harzianum T2: C20032 10% theo tỉ lệ 1:1, khuấy từ gia nhiệt ở 50oC trong hai trường hợp có và không kết hợp siêu âm. Khi ủ enzyme với bào tử không siêu âm trong điều kiện thí nghiệm có khuấy đảo, tỉ lệ phá v�đạt 53,5%. Siêu âm 5 phút sau xử lý enzyme 10 ngày có thể phá v�71,7 % bào tử. Hình 2: Tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi khi xử lý enzyme không và có siêu âm (giá trị TB theo sau bởi cùng một chữ cái thì không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm Duncan (CV% = 3.077117) a) b) c) d) Hình 3: a) Bào tử nấm Linh Chi trước khi xử lý enzyme; b) Sau khi xử lý enzyme Trichoderma harzianum T2 + C20032 10% tỉ lệ 1:1 ở 500C sau 10 ngày; c) Sau xử lý enzyme kết hợp siêu âm; d) Enzyme bị bất hoạt sau siêu âm 397
  8. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 Hình 3 cho thấy kết hợp siêu âm sau enzyme, bào tử được phá v�hiệu quả hơn. Hình 3d cho thấy siêu âm cũng bất hoạt hoàn toàn enzyme. Ảnh hưởng của phương pháp tiền xử lý bằng lạnh đông lên tỉ lệ phá vỡ bào tử Bảng 5: Ảnh hưởng của chế độ lạnh động tiền xử lý lên tỉ lệ phá v�bào tử nấm Linh Chi Nhiệt độ (0C) 30 -4 -20 -70 -196 Tỉ lệ phá v�(%) 8,73b±5,51 67,07a±4,63 60,23a ±10,02 73,70a ±8,27 64,22a ±2,74 Ghi chú: Tỉ lệ % phá vỡ được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Bảng 5 cho thấy nếu không tiền xử lý bào tử bằng lạnh đông tỉ lệ phá v�bào tử là không đáng kể (8,73%). Khi tiền xử lý bằng lạnh đông ở các chế độ khác nhau sau 12 giờ trong buồng lạnh đông tủ lạnh -40C, tủ âm -200C, đá khô (-700C) và Nitơ lỏng (-1960C) thì tỉ lệ phá v�cao nhất đạt được ở -700C trong đá khô (73,7%), tuy nhiên sự sai khác không có ý nghĩa thống kê so với các chế độ tiền xử lý khác. Như vậy có thể chọn chế độ tiền xử lý lạnh đông qua đêm sau 12 giờ sử dụng buồng lạnh đông tủ lạnh -40C vì lý do tiện lợi và kinh tế. Phương pháp nghiền có thể đạt đến tỉ lệ phá v�bào tử là 100% (Pattent CN 101596220 A, 2009). Tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bị lớn và chất lượng hoạt chất có thể không được bảo đảm Định tính các hợp chất trong dầu bào tử sau khi trích ly lỏng lỏng dịch thủy phân bào tử Sau khi trích ly lỏng lỏng dịch thủy phân bào tử bằng diethyl ether, dầu bào tử được thu hồi sau khi đuổi toàn bộ dung môi. Định tính dầu bào tử bằng các phương pháp thường quy cho thấy dầu bào tử không còn chứa protein (âm tính thuốc thử Biuret), tuy nhiên có chứa polysaccharide (dương tính thuốc thử Mollisch) và triterpenoid (dương tính thuốc thử Liebermann-Burchard). Định lượng polysaccharide tổng số và lipid tổng số có trong dịch bào tử sau khi phá vỡ Định lượng polysaccharide tổng số Chú thích kí hiệu: KSA: Không siêu âm SA: Siêu âm BT: Vỏ bào tử PHC: Pha hữu cơ PN: Pha nước 398
  9. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 Bảng 3.7: Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá v�bào tử và vỏ bào tử từ 100 g bào tử phá v�bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm (Hiệu suất thu hồi polysaccharide) Mẫu Hiệu suất thu hồi polysaccharide (%) Dịch KSA 12,03b±1,00 BT KSA 0,04c±0,00 Dịch SA 16,80a±1,15 BT SA 0,03c±0,01 Ghi chú: Hiệu suất thu hồi (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Kết quả bảng 3.7 cho thấy polysaccharide chủ yếu được tìm thấy trong pha lỏng sau ly tâm. Siêu âm làm tăng nồng độ polysaccharide thu được từ 12,3% lên 16,80%, tức là tăng 1,37 lần). Bào tử phá v�còn chứa rất ít polysaccharide, so với trong pha lỏng chỉ chiếm 0,3% và 0,17% lần lượt cho BT KSA và SA. Từ đó có thể thấy sử dụng phương pháp enzyme phá v�tế bào có siêu âm hay không siêu âm, polysaccharide chủ yếu thu được ở pha lỏng sau khi ly tâm tách bào tử. So sánh với nghiên cứu của Zhu X và cộng sự (2012), sử dụng phương pháp hóa – cơ học để chiết xuất polysaccharide, thời gian trích ly 130 phút thì hàm lượng polysaccharide tổng số thu được là 5,92±013%. Các chất chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen (Krings and Berger, 2001). Thí nghiệm này được thực hiện để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide từ bào tử bị phá v�chiết xuất bằng phương pháp hóa – cơ học. Kết quả nghiên cứu của Zhu X và cộng sự thu được là khả năng kháng oxy hóa của polysaccharide tăng khi tăng nồng độ, cao hơn đối chứng dương BHT (Butylated hydroxytoluene) nhưng lại thấp hơn Vc (Vitamin C) khi ở cùng nồng độ. Dựa vào kết quả này thì khả năng kháng oxy hóa được xếp theo thứ tự Vc > polysaccharide > BHT. Giá trị IC50 của polysaccharide, Vc và BHT lần lượt là 0,36 mg/mL, 0,25 mg/mL và 0,43 mg/mL. Bảng 3.8: Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng lỏng dịch phá v�bào tử bằng diethyl ether từ 100 g bào tử không siêu âm và siêu âm PHC (%) PN (%) KSA 0,25c ± 0,02 11,77b ± 0,99 SA 0,30c ± 0,01 16,50a ± 1,15 Ghi chú: Hàm lượng (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Từ bảng 3.8, phân tích định lượng cho thấy pha nước thu hồi sau trích ly lỏng lỏng chứa phần lớn polysaccharide, sai khác giữa siêu âm và không siêu âm là có ý nghĩa thống kê. Đối với dung môi 399
  10. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 diethyl ether pha hữu cơ chỉ chứa 2,1% khi không siêu âm và 1,81% khi siêu âm so với pha nước, sai khác không có ý nghĩa thống kê. Từ đó cho thấy thu hồi các hoạt chất từ dịch ly tâm sau khi phá v�bào tử bằng cách trích ly lỏng lỏng bằng dung môi diethyl ether (hay các dung môi không phân cực khác) thu pha hữu cơ thì phần lớn polysaccharide bị loại bỏ trong pha nước. Định lượng lipid tổng số Thành phần lipid trong bào tử gồm triterpenoid và acid béo. Tuy nhiên do không có chất chuẩn nên triterpenoid không được phân tích. Bảng 3.9: Hàm lượng lipid có trong dịch phá v�bào tử và vỏ bào tử từ 100 g bào tử phá v�vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm (hiệu suất thu hồi lipid tổng) Mẫu Hiệu suất thu hồi lipid (%) Dịch KSA 50,50b ± 1,32 BT KSA 1,08c ± 0,63 Dịch SA 86,17a ± 10,41 BT KSA 6,75c ± 1,75 Ghi chú: Hàm lượng (%) được thể hiện dưới dạng TB ± SD. Trong cùng một cột hoặc một hàng mang chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa α=0,01 theo trắc nghiệm LSD Dựa vào bảng 3.9 hàm lượng lipid tổng số thu được đạt giá trị cao nhất là 86,17% đối với mẫu dịch có siêu âm, cao hơn mẫu không siêu âm (50,50%). Có thể nói, nhờ kết hợp enzyme và siêu âm đã nâng hàm lượng lipid thu được lên 1,7 lần so với không siêu âm. Bên cạnh đó, ở dịch trích ly bào tử siêu âm đã thu được hàm lượng lipid là 6,75%, cao hơn mẫu bào tử không siêu âm (1,08%) tuy nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê. So sánh với phần lớn lipid thu hồi trong pha dịch sau ly tâm, việc dùng dung môi hữu cơ chủ yếu để thu hồi lipid trong đó có triterpenoid, thành phần này có phần khác biệt với thể quả. Theo Li JJ và cộng sự (2014), hàm lượng triterpenoid trong thể quả nấm chiếm 0,44% - 1,42%, trong khi đó ở bào tử phá v�chiếm 1,89% - 3,15%. Từ đó kết luận rằng phương pháp siêu âm làm tăng tỉ lệ phá v�và vì vậy tăng hàm lượng polysaccharide cũng như lipid thu hồi trong phần dịch phá v�bào tử cao hơn là trong vỏ bào tử. Đề nghị quy trình phá vỡ bào tử nấm Linh chi thu hoạt chất Như vậy, quy trình phá vách và thu hồi dịch chiết bào tử nấm Linh chi được đề nghị bao gồm các quá trình chính sau: – Tiền xử lý lạnh đông -40C 12 giờ, rã đông. – Ủ bào tử với hỗn hợp enzyme dịch nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 (3,93 U/ml chitinase) và chế phẩm cellulase C20032 (6,40 U/ml chitinase), 500C, pH = 5,0 đệm acetate trong 10 ngày. 400
  11. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 – Siêu âm 5 phút, 500C, độ khuếch đại 100%. – Ly tâm 4000 vòng phút, 15 phút tách pha. – Trích ly pha rắn bằng ethanol. – Phối trộn dịch trích bằng ethanol và pha dịch sau ly tâm. – Cô quay chân không loại bỏ phần lớn dung môi. – Sấy phun hoặc đông khô. KẾT LUẬN Các kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy có thể phá v�khoảng 70% bào tử nấm Linh Chi bằng phương pháp rẻ tiền là sử dụng enzyme và kết hợp siêu âm. Tỉ lệ phá v�bào tử không cao so với phương pháp nghiền, vì vậy enzyme phá v�vách bào tử hiệu quả hơn cần được tiếp tục nghiên cứu, cũng như thành phần và các hoạt tính sinh học các chất thu được sau khi phá v� vách bằng enzyme và siêu âm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boh B, Berovic M, Zhang J, Zhi-Bin L. Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds. Biotechnol Annu Rev. 2007;13:265–301 [2] Brennan, C.S., Yuliarti, O., Goh, K., Matia-Merino, L., Mawson, J. & Drummond, L. (2008). Effect of extraction techniques and conditions on the physicochemical properties of the water soluble polysaccharides from gold kiwifruit (Actinidia chinensis). International Journal of Food Science and Technology, 43, 2268–2277 [3] Cheng CR, YueQX, WuZY, et al. Cytotoxic triterpenoids from Ganoderma Lucidum. Phytochemistry 2010; 71: 1579-1585 [4] Elson, LA. and Morgan, W. (1933) A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine, Biochem. J. 27, 1824-1828 [5] Heim, Y. R. Li, Q. Chen, Z. Lin, D. Xia, L. Ma, 1992. Chemical studies on immunologically active polysaccharides of Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr.) Karst. Chung – Kuo – Chung – Yao – Tsa – Chih. 17 (4):266 – 8. 256 (1992) [6] Jungjing MA, Zhengyi FU, Peiyan MA, Yanli SU, Qingjie Z (2007) Breaking and characteristics of Ganoderma lucidum spores by high speed centrifugal shearing pulverizer. J. Wuhan Univ. Tech-Mater. Sci. Ed. 22: 617-621 [7] Krings, U. & Berger, R.G. (2001). Antioxidant activity of some roasted foods. Food Chemistry, 72, 223–229 [8] Li J.J., Hu X.Q., Zhang X.F., Liu J.J., Cao L.S. (2014). Study on variation of main ingredients from spores and fruiting bodies of Ganoderma lucidum, Article in Chinese. 401
  12. Hội nghị Khoa học An toàn dinh dưỡng và An ninh lương thực lần 2 năm 2018 [9] Pattent CN 101596220 A (2009). Wall-breaking method of Ganoderma lucidum spore [10] Pearson’s Composition and Analysis of Foods, 9th Edn, 1991 page 538 [11] Saha, S., Subrahmanyam, E. V. S., Kodangala, C., & Shastry, S. C. (2011). Isolation and characterization of triterpenoids and fatty acid ester of triterpenoid from leaves of Bauhinia variegata. Der Pharma Chemica, 3, 28-37 [12] Zhu X., Chen X., Xie J., Wang P., Su W. (2012). Mechanochemical-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum spores. Int J Food Technol, 47 (5), 927 – 32 COMBINATION OF ENZYMATIC AND ULTRASONIC METHODS FOR THE BREAKAGE OF GANODERMA LUCIDUM SPORE WALLS ABSTRACT The purpose of this study was to determine the method for Ganoderma lucidum spore wall breakage. Chitinase activity in the Trichoderma harzianum T2 extract and commercial enzyme C20032 displayed their optimal temperature of 500C and their optimal pH of 5.0. Spore wall breakage efficiency was found to be 53.5% when using simmultanneously Trichoderma harzianum T2 enzyme chitinase and commercial enzyme C20032 at 500C, pH 5 during 10 days. After enzymatic treatment, applying 500W ultrasound in 5 minutes with 100% amplification increased the spore breakage efficiency to 71.7%. Freezing Ganoderma lucidum spores as a pretreatment step seemed to be a prerequisite for spore wall breakage. However, there was no significant difference between freezing methods such as storage under -40C, -200C, -700C (in dry ice) and -1960C (in liquid nitrogen). For spore wall breakage by enzyme only, the centrifugal supernatant contained 12.03% total polysaccharide and 50.5% total lipid, while from the spore walls in pellet only 0.04% total polysaccharide and 1.08% total lipid were extracted. By combining enzymatic and ultrasonic methods for the breakage spore walls, the centrifugal supernatant contained up to 16.80% total polysaccharide and 86.17% total lipid, while the spore walls in pellet as in the previous case kept only a small part of spore substances, namely 0.03% total polysaccharide and 6.75% total lipid. A flow chart of breaking spore wall by combining enzymatic and ultrasonic methods and active substance recovery was designed. Keywords: chitinase, Ganoderma lucidum spore wall breakage, polysaccharide, lipid, ultrasound. 402
nguon tai.lieu . vn
Kiến trúc - Xây dựng Tự động hoá Điện - Điện tử Kĩ thuật Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Năng lượng Hoá dầu Hoá học Sinh học