1. Trang Chủ
  2. Hoá dầu
  3. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chuyển hóa mỡ cá basa thành polyhydroxyalkanoate (PHA)

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chuyển hóa mỡ cá basa thành polyhydroxyalkanoate (PHA)

Cá basa là một trong những mặt hàng sản xuất và xuất khuẩu quan trọng của ngành thủy sản Việt Nam. Trong quá trình chế biến mặt hàng đã tạo ra một lượng lớn mỡ cá phụ phẩm. Trong nghiên cứu này, mỡ cá basa được sử dụng làm nguồn cacbon để vi khuẩn lên men sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoate (PHA). Kết quả đã phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn M91 có khả năng chuyển hóa hiệu quả mỡ cá basa thành PHA. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học PHÂN

Thể loại Tài liệu miễn phí Hoá dầu

Số trang 6

Ngày tạo 4/6/2023 2:28:35 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.59 M

Tên tệp

Tải Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chuyển... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA MỠ CÁ BASA THÀNH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) Vũ Thị Mai Anh* Trường Đại học Sư phạm Hà Nội *Tác giả liên lạc: maianhvu05101995@gmail.com TÓM TẮT Cá basa là một trong những mặt hàng sản xuất và xuất khuẩu quan trọng của ngành thủy sản Việt Nam. Trong quá trình chế biến mặt hàng đã tạo ra một lượng lớn mỡ cá phụ phẩm. Trong nghiên cứu này, mỡ cá basa được sử dụng làm nguồn cacbon để vi khuẩn lên men sinh tổng hợp polyhydroxyalkanoate (PHA). Kết quả đã phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn M91 có khả năng chuyển hóa hiệu quả mỡ cá basa thành PHA. Chủng M91 có những đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rDNA tương đồng với các loài vi khuẩn thuộc chi Ralstonia. Khi nuôi cấy chủng M91 trong nồi lên men 10 lít, lượng sinh khối cực đại đạt khoảng 5,32 g/l và PHA tích lũy đạt 51,23% sau 63 giờ nuôi cấy. Từ khóa: Lên men, mỡ cá basa, PHA, Ralstonia pickettii. ISOLATION AND SCREENING OF BACTERIA FOR BIOCONVERTION OF BASA FISH FAT INTO POLYHYDROXYALKANOATE Vu Thi Mai Anh* Faculty of Biology, Hanoi National University of Education * Corresponding authour: maianhvu05101995@gmail.com ABSTRACT Basa fish is one of the important exported product of the Vietnamese seafood industry. Large amount of fish fat was generated during fish procesing. In this study, basa fish fat was used as carbon sources for biosynthesis of polyhydroxyalkanoate (PHA) by bacteria. We have isolated a bacterium strain M91 which can effectively convert basa fish fat into PHA. The morphological features and sequence of 16S rDNA gene of this strain are similar to those of the bacterial species belonging to the genus Ralstonia. The maximum biomass of 5,32 g/l and PHA content of 51,23% were obtained by this strain after 63 hours of cultivation in 10-litter fermentor. Keywords: Fermentation, basa fish fat, PHA, Ralstonia pickettii. TỔNG QUAN một lượng lớn mỡ cá phụ phẩm được tạo ra. Với đường bờ biển dài hơn 3.200 km, Việt Lượng mỡ cá basa thu hồi từ các cơ sở chế Nam có vùng đặc quyền kinh tế trên biển biến thủy sản hàng năm lên tới 300.000 tấn. rộng hơn 1 triệu km2 và vùng mặt nước nội Trước đây, lượng lớn mỡ từ cá basa chưa địa lớn, rộng hơn 1,4 triệu ha nhờ hệ thống được chế biến công nghiệp, chưa tinh luyện sông ngòi, đầm phá dày đặc. Vị trí địa lý và nên chưa đạt chỉ tiêu dầu mỡ thực phẩm. điều kiện tự nhiên thuận lợi giúp Việt Nam Chủ yếu là chiên mỡ cá bằng gia nhiệt trực có nhiều thế mạnh nổi trội để phát triển tiếp thành dạng lỏng, sau đó đem trộn với ngành công nghiệp thủy sản. Việt Nam từ lâu mỡ lợn và bán giá rẻ cho tư nhân hoặc bán ở đã trở thành một nước sản xuất và xuất khẩu vùng cao, Campuchia, Trung Quốc. Hiện thủy sản lớn trên thế giới. Năm 2016 sản nay, một phần nhỏ mỡ cá basa được tinh xuất của ngành Thủy sản nước ta đạt hơn 7 luyện và chế biến thành một số thực phẩm tỷ USD, nằm trong nhóm các nước sản xuất như dầu cá. Ngoài ra cũng có nhiều công và xuất khẩu thủy sản hàng đầu thế giới. trình nghiên cứu tận dụng nguồn mỡ cá basa Trong các mặt hàng thủy sản của nước ta, cá thô để sản xuất dầu diesel sinh học sử dụng basa là sản phẩm xuất khẩu quan trọng và trong các động cơ diesel thay thế cho dầu mang lại lợi nhuận kinh tế cao. Trong quá truyền thống. trình khai thác và chế biến mặt hàng này, Polyhydroxyalkanoates (PHA) là một nhóm 197
  2. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học các polymer có khả năng phân hủy sinh học loãng đến nồng độ 2.10–5. Hút 100µl dịch có hoàn toàn thành CO2 và H2O trong điều kiện độ pha loãng 2.10–4 và 2.10–5 trang đều trên hiếu khí hoặc CO2 và CH4 ở điều kiện kị khí bề mặt thạch trong đĩa Petri chứa môi trường nhờ hoạt động của vi sinh vật trong môi phân lập, đặt trong tủ ấm 35oC. Sau 48 giờ trường. PHA là polyester của các đơn phân lựa chọn trên đĩa Petri phân lập, các khuẩn hydroxyalkanoate, chúng được tích lũy trong lạc mọc riêng rẽ để cấy chuyển sang đĩa Petri tế bào của rất nhiều vi sinh vật như là nguồn chứa môi trường giữ giống. dự trữ carbon và năng lượng (hình 1). PHA Tuyển chọn chủng vi khuẩn tích lũy PHA không tan trong nước, không độc hại, có khả Nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập trên năng tự phân hủy, chịu nhiệt và có tính đàn môi trường MPA cải tiến có bổ sung thuốc hồi cao. Với những đặc điểm ưu việt trên, nhuộm Nile Blue A, tuyển chọn theo phương PHA được coi là vật liệu lý tưởng có thể thay pháp của Spiekermann và cộng sự (1999). thế polymer hóa dầu trong tương lai. Cấy truyền và giữ giống các chủng vi khuẩn Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên đã tuyển chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. cứu sản xuất PHA từ các nguồn cacbon giá Định loại vi khuẩn bằng kỹ thuật di truyền rẻ như: dầu thực vật, tinh bột, bã mía và chất phân tử thải của một số ngành công nghiệp giết mổ Nuôi cấy chủng tuyển chọn trên môi trường động vật nhưng chủ yếu là gia súc. Cho đến MPA lỏng, trong 12 giờ. Tiến hành tách nay mới có một bài báo công bố về nghiên chiết DNA tổng số theo các bước trong bộ cứu sử dụng dầu cá để sản xuất PHA (Ashby kit “ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM”. và Solaiman, 2008). Với tiềm năng to lớn DNA tổng số được sử dụng để tiến hành của ngành thủy sản Việt Nam, hướng nghiên phản ứng PCR với cặp mồi 314F - 907R và cứu sản xuất PHA từ mỡ cá basa là hướng 8F - 1492R. Sử dụng bộ kit “Dream Taq nghiên cứu có triển vọng trong tương lai. PCR Master Mix (2X)” (Thermo Fisher Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích Scientific, USA). Kiểm tra sản phẩm PCR phân lập được chủng vi khuẩn có khả năng trên gel agarose “PAGEr TMEM Gels sử dụng mỡ cá basa làm cơ chất để tích lũy Mid/High (10–350 kDa) 4 – 12% (Lonza, PHA. Nội dung nghiên cứu bao gồm 3 phần USA)”. Sản phẩm PCR được gửi tới công cơ bản sau: (1) Phân lập và tuyển chọn ty 1st Base, Singapore để giải trình tự. chủng vi khuẩn tích lũy PHA; (2) Nghiên Trình tự ADN của các mẫu được phân tích cứu đặc điểm sinh học của chủng; (3) Nghiên bằng phần mềm MEGA 6.0 và so sánh với cứu động thái của chủng vi khuẩn tuyển chọn ADN của các vi khuẩn đã công bố trên trong môi trường sản xuất PHA. ngân hàng gen bằng công cụ NCBI/BLAST. Xác định khối lượng tế bào khô và hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn Khối lượng tế bào khô được xác định theo phương pháp của Van-Thuoc và Quillaguamán (2014). Hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào vi khuẩn được xác định bằng hệ thống sắc ký khí. Lên men mẻ trong nồi lên men 10 lít Bổ sung 400ml giống vi khuẩn đã hoạt hóa 15 giờ vào trong nồi lên men chứa 3,6 lít môi Hình 1. Tế bào vi khuẩn tích lũy PHA trường sản xuất PHA. Sau 3 giờ lên men bắt đầu thu mẫu, 6 giờ thu mẫu một lần xác định VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP sinh khối khô và hàm lượng PHA tích lũy Phân lập vi khuẩn trong tế bào chủng vi khuẩn nghiên cứu. Cân 1g mẫu cho vào bình tam giác chứa 49 ml nước chứa 0,9% NaCl đã thanh trùng, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN trộn đều hỗn hợp bằng máy vortex. Pha Phân lập và tuyển chọn 198
  3. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Từ các mẫu đất vườn, phân lập được 235 nguồn carbon là mỡ cá basa phụ phẩm ở chủng vi khuẩn. Dựa trên phương pháp tuyển 35ºC, 48 giờ. Kết quả thu được 8/15 chủng chọn với thuốc nhuộm Nile Blue A kết hợp vi khuẩn có khả năng tích lũy PHA với với quan sát phát hiện các thể ẩn nhập trong nguồn cacbon là mỡ cá phụ phẩm. Trong 8 tế bào bằng kính hiển vi quang học, phát chủng có tích lũy PHA, chủng M91 tích lũy hiện được 15 chủng có biểu hiện tích lũy PHA cao nhất (50,1%), CDW (1.44 g/l). Kết PHA. Tiến hành lên men 15 chủng có biểu quả tuyển chọn được thể hiện trong hình 2. hiện tích lũy PHA trên trong môi trường có Hình 2. Khả năng sinh trưởng và tích lũy PHA của một số chủng vi khuẩn Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học Nuôi cấy chủng M91 trong các điều kiện nghiên cứu thích hợp. Nghiên cứu thấy chủng M91 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, tế bào có dạng trực khuẩn, kích thước 0,5 × 2 µm (hình 3B). Khi tích lũy PHA, kích thước tế bào lớn hơn, trong tế bào có chứa các hạt polymer (màu trắng sáng), mỗi tế bào thường chứa 2–3 hạt PHA có thể quan sát trên kính hiển vi quang học (hình 3C). C Hình 3. Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào bình thường trên SEM (B) hình thái tế bào khi tích lũy PHA (C) của chủng M91 199
  4. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Chủng M91 được nuôi cấy trong môi trường MPA lỏng trong 12 giờ, tiến hành tách ADN tổng số, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen của các vi khuẩn đã công bố cho kết quả như sau: DNA tổng số sau khi tách, thực hiện phản ứng PCR nhân đoạn trình gen 16S rDNA và kiểm tra sản phẩm PCR bằng cách điện di trên gel agarose thu nhân bản được 2 đoạn gen có kích thước khác nhau (khoảng 500 bp và gần 1.500 bp) tương ứng với 2 cặp mồi sử dụng (hình 4) Vạch băng thu được đậm, rõ nét đủ điều kiện gửi đi giải trình tự. Sản phẩm PCR của cả 2 cặp mồi khác nhau được gửi đi giải trình tự thu được trình tự gen gồm 1.413 nucleotide. So sánh kết quả thu được với các trình tự trên ngân hàng gen thế giới cho thấy đoạn trình tự gen 16S rDNA của chủng M91 giống trình tự gen 16S rDNA của các chủng thuộc loài Ralstonia pickettii đến 97%, giống các chủng thuộc loài Ralstonia mannitolilytica đến 96%. Dựa vào kết quả này bước đầu kết luận chủng M91 thuộc chi Ralstonia và gọi tên là Ralstonia sp. M91 (hình 5). Hình 4. Điện di DNA tổng số (A) và DNA sau khi PCR (B) Hình 5. Cây phát sinh chủng loại của chủng Ralstonia sp. M91 200
  5. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học Chi Ralstonia là chi có những loài có khả pickettii 61A6. Chủng Ralstonia pickettii năng sinh tổng hợp PHA từ mỡ động vật và 61A6 chỉ tích lũy được 177 mg PHA/l (0,177 dầu thực vật với hiệu suất cao như loài g/l) sau 50 giờ nuôi cấy với nồng độ Ralstonia eutropha trong nghiên cứu của saccharose 10% (Bonatto và CS, 2004). Như Sebastian và cộng sự (2015). Năm 2004 vậy có thể thấy hàm lượng PHA tích lũy Bonatto và cộng sự cũng đã phân lập được trong tế bào của chủng Ralstonia sp. M91 chủng Ralstonia pickettii 61A6 từ đất rừng cao hơn ít nhất 15 lần so với chủng Ralstonia mưa nhiệt đới có khả năng sinh tổng hợp pickettii 61A6 (chủng phân lập từ đất rừng PHA từ các nguồn carbon khác nhau như mưa nhiệt đới). saccharose và rỉ mật. Tuy nhiên khi so sánh khả năng sinh tổng Kết quả lên men mẻ chủng Ralstonia sp. hợp PHA trên nguồn mỡ cá với chủng vi M91 trong nồi lên men 10 lít khuẩn thuộc chi Pseudomonas thì khả năng Tiến hành lên men trong thiết bị lên men 10 sinh tổng hợp của chủng Ralstonia sp. M91 lít, với thể tích lên men 4 lít, lấy mẫu theo là tương đương. Các chủng Pr-14683 và Pr- các giờ để xác định khả năng sinh trưởng và 2649 có khả năng tích lũy hàm lượng PHA tích lũy PHA. Kết quả ở hình 6 cho thấy tốc cao nhất lần lượt là 2,4 g/l và 2,5 g/l sau 72 độ sinh trưởng của chủng Ralstonia sp. M91 giờ nuôi cấy (Ashby và Solaiman, 2008) khá chậm, để đạt lượng tế bào khô cực đại trong khi đó chủng Ralstonia sp. M91 là 2,73 5,32 g/l chủng này cần đến 63 giờ. Chủng g/l sau 63 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên nguồn Ralstonia sp. M91 tích lũy PHA từ rất sớm, carbon trong nghiên cứu của Ashby và sau 9 giờ nuôi cấy đã tích lũy 9,95 %CDW, Solaiman là mỡ cá thủy phân, trong nghiên hàm lượng PHA tăng trong quá trình nuôi này của chúng tôi là mỡ cá thô. Đây là lợi thế cấy và đạt cực đại (51 %CDW) sau 63 giờ của chủng Ralstonia sp. M91 – chủng này có nuôi cấy. Hàm lượng PHA tích lũy trong tế thể sử dụng trực tiếp nguồn mỡ cá mà không bào của chủng Ralstonia sp. M91 (2,73 g/l) cần qua bước thủy phân. cao hơn khác nhiều so với chủng Ralstonia Hình 6. Động thái quá trình lên men của chủng Ralstonia sp. M91 trong nồi lên men 10 lít KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ tiềm năng trong sản xuất PHA lớn và mỡ cá Phân lập được chủng vi khuẩn M91 từ đất có basa là nguồn dồi dào ở Việt Nam. Kết quả khả năng sinh tổng hợp PHA từ mỡ cá basa. này là những nghiên cứu ban đầu cho việc Chủng M91 có dạng trực khuẩn, Gram âm, nghiên cứu sản xuất PHA từ mỡ cá. Cần có có trình tự gen 16S DNA tương đồng với những nghiên cứu sâu hơn trong việc ứng các loài thuộc chi Ralstonia. Khi nuôi cấy dụng mỡ cá basa trong sản xuất PHA góp trong nồi lên men 10 lít, lượng sinh khối cực phần vào mục tiêu chung nhằm đưa PHA ứng đại đạt khoảng 5,32 g/l và PHA tích lũy đạt dụng rộng rãi trong đời sống. 51,23% sau 63 giờ nuôi cấy. Chủng M91 có 201
  6. Giải thưởng Sinh viên Nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ XIX năm 2017 Kỷ yếu khoa học TÀI LIỆU THAM KHẢO ASHBY, K.D., SOILAIMAN, D.K.Y., (2008) Poly(hydroxyalkanoate) biosynthesis from crude alaskan pollock (Theragra chalcogramma) oil. J Polym Environ, 16: 221-229. BONATTO, D., MATIAS, F., LISBOA, M.P., BOGDAWA, H.M., HENRIQUES, J.A.P., (2004) Production of short side chain-poly(hydroxyalkanoate) by a newly isolated Ralstonia pickettii strain. World J Microbiol Biotechnol, 20: 395-403. HUIJBERTS, G.N.M., VAN, D.W.H., WILKNSON, C., EGGINK, G., (1994) Gas- chromatographic analysis of poly(3-hydroxyalkanoates) in bacteria. Biotechnol Tech, 8: 187- 192. SEBASTIAN, L.R., STEFAN, J., STEVEN, K., MARTINA, C.E.B., CHRISTOPHER, J.B., JOHANNES, B., ULF, S., (2015) Polyhydroxyalkanoates production with Ralstonia eutropha from low quality waste animal fats. Journal of Biotechnology, 214: 119-127. SPIEKERMANN, P.S., REHM, H.A.R., KALSCHEUER, R.K., BAUMEISTER, D.B., (1999) A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Arc Microbiol, 171: 73-80. THUOC, D.V., PHONG, T.H., BINH, N.T, THO, N.T., LAM, D.M., QUILLAGUAMN, J., (2012) Polyester production by halophilic and halotolerant bacterial strains obtained from mangrove soil samples located in Northern Vietnam. Microbiology Open, 1: 395-406. 202
nguon tai.lieu . vn
Kiến trúc - Xây dựng Tự động hoá Điện - Điện tử Kĩ thuật Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Năng lượng Hoá dầu Hoá học Sinh học