- Trang Chủ
- Hoá dầu
- Ảnh hưởng ph đến hoạt tính xúc tác của enzyme lipasecandida rugosa và porcine pacreas
Xem mẫu
- HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG
- >> HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG
- Enzyme lipase Candida rugosa (LCR), Type 2.3.2. Ảnh hưởng của pH
VII ký hiệu L1754, do công ty Sigma-Aldrich * Thông số khảo sát:
cung cấp. - Enzyme lipase Candida rugosa pH = 5.5 - 6.0 -
- Enzyme lipase Porcine pacreas (LPP), Type 6.5 - 7.0 - 7.5 - 8.0, sử dụng đệm Phosphat
II, ký hiệu L3126 do công ty Sigma-Aldrich cung - Enzyme lipase Porcine pancreas pH = 6.5 - 7.0
cấp. - 7.5 - 8.0 - 8.5 - 9.0, sử dụng đệm Borat
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất khác * Thông số cố định:
* Dầu olive: được nhập khẩu từ Italia, sản phẩm - Dung dịch đệm: 6 ml (đệm Phosphat pH 7.2
được đóng chai tại Việt Nam bởi công ty TNHH đối với LCR, đệm Borat pH 7.7 đối với LPP)
Dầu Thực vật Cái Lân, Hiệp Phước, Thành phố - Dung dịch enzyme: 1 ml (3.04 mg enzyme /ml
Hồ Chí Minh. Sản xuất theo công nghệ chiết xuất với LPP, 0.32 mg enzyme/ml đối với LCR)
lạnh. - Nhũ tương dầu olive: 3 ml
* Hóa chất khác - Thời gian phản ứng: 1 giờ
- Gum Arabic, H3PO4 85%, NaOH, KOH, H2SO4, - Nhiệt độ: 37oC
Etanol 99.5%, chất chỉ thị màu Phenoltalein, - Tốc độ khuấy: 250 rpm
KH2PO4, Na2HPO4, AlCl3, CaCl2, MgCl2, và một Khi kết thúc phản ứng, để bất hoạt enzyme bổ
số hóa chất khác (China). sung thêm 3ml etanol 99.5%. Sau đó nhỏ 3 giọt
- Nước cất được sử dụng trong suốt quá trình phenoltalein 0.1% làm chất chỉ thị màu rồi chuẩn
làm thí nghiệm. độ bằng NaOH 0.1M.
2.2. Thiết bị Hoạt tính của enzyme được tính theo công thức
- Máy đo pH - Bể điều nhiệt (1) ở mục 2.3.1.
- Máy khuấy từ có gia nhiệt - Máy đồng hóa 2.3.3. Độ bền pH
- Tủ lạnh - Tủ sấy Để khảo sát độ bền pH của 2 enzyme tiến hành
Và một số thiết bị thông thường khác như sau:
2.3. Phương pháp nghiên cứu * Thông số thay đổi là:
2.3.1. Chuẩn bị nhũ tương dầu olive pH = 6.5 - 7.0 - 7.5 - 8.0 đối với LCR
Thành phần gồm: 73 ml nước cất, 7 gam Gum pH = 7.5 - 8.0 - 8.5 - 9.0 đối với LPP
Arabic, 93 ml dầu olive. Đầu tiên trộn đều Gum * Thông số cố định:
với nước cất sau đó cho dần dần dầu vào và thực - Dung dịch đệm: 6 ml
hiện nhũ hóa 10 - 15 phút trong máy đồng hóa. - Dung dịch enzyme: 1 ml (3.04 mg enzyme/ml
Hỗn hợp sau đồng hóa được cho là đạt là khi để với LPP; 0.32 mg enzyme/ml đối với LCR)
yên trong 1 thời gian không thấy hiện tượng bị - Nhũ tương dầu olive: 3 ml
phân lớp. - Nhiệt độ: 37oC
* Hoạt tính của enzyme (U/mg enzyme) được Với từng giá trị pH, đo hoạt tính của enzyme
tính theo công thức sau: sau 30phút - 1h - 2h - 3h - 4h - 5h xảy ra phản
ứng. Khi kết thúc phản ứng, để bất hoạt enzyme
bổ sung thêm 3ml etanol 99.5%. Sau đó nhỏ 3 giọt
phenoltalein 0.1% làm chất chỉ thị màu và chuẩn
độ bằng NaOH 0.1M.
Trong đó: Hoạt tính của enzyme được tính theo công thức
a: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu có enzyme (ml) (1) ở mục 2.3.1.
b: Lượng NaOH chuẩn độ ở mẫu trắng (ml) * Xác định thời gian bán hủy t1/2
m: Khối lượng enzyme (mg) Hệ số ức chế kd, và thời gian bán hủy t1/2 được
Hoạt tính riêng của enzyme. Được xác định tính theo công thức sau (Bailey et al., 1986;
thông qua hoạt tính tổng (U) và hàm lượng protein Bayramolu et al.,2003) [19]
có trong mẫu thí nghiệm, tức là số đvht/mg protein [A] = [Ao]. (2)
enzyme. k d: hệ số ức chế (1/phút)
2 > ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
- HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG 0.05 thì sự khác biệt giữa các mẫu không có ý
nghĩa về mặt thống kê.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính hai Hình 2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính LPP và LCR
enzyme
pH có ảnh hưởng khá lớn đến vận tốc phản ứng ứng 100% hoạt tính) khi tăng pH lên 8.0 hoạt
của enzyme, mỗi enzyme hoạt động mạnh trong 1 tính LCR giảm đi chỉ còn một nửa (864.78 U/mg
dải pH khác nhau. Đối với lipase khoảng pH dao enzyme) còn khi giảm pH thì hoạt tính enzyme có
động khá rộng: như lipase từ dầu thầu dầu thì pH giảm chậm dần (xem kết quả ở bảng 1), điều này
là 4.7 [3], còn lipase từ tuyến tụy của động vật pH cho thấy LCR hoạt động được ở dải pH rộng từ
có thể lên đến 9.0. Như vậy tùy thuộc vào nguồn pH 5.5 đến pH 7.5, pH tối ưu là 7.0. Ở các giá
gốc mà mỗi lipase sẽ có một giá trị pH tối ưu khác trị pH không phải là tối ưu, hoạt tính dao động
nhau. Ở giá trị pH mà tại đó enzyme hoạt động từ 73% đến 94% hoạt tính tối đa. Kết quả nghiên
mạnh nhất gọi là pH tối ưu. Tiến hành xác định cứu này cũng giống như kết quả của tác giả Banu
hoạt độ lipase của LCR và LPP với các giá trị pH ÖZTÜRK (2001), theo đó tác giả cũng kết luận
thay đổi, với cùng cơ chất nhũ tương dầu olive, ở lipase từ Candida rugosa hoạt động khá ổn định
nhiệt độ 37°C. Sử dụng đệm phosphat cho LCR, trong khoảng pH 6.0 đến 7.0. Và theo Fadõloğlu
đệm borat cho LPP. Kết quả thí nghiệm được thể and Söylemez (1997) cũng cho kết quả rằng pH
hiện ở bảng 1 và biểu diễn trên hình 2. tối ưu của lipase từ Candida rugosa là 7.0. Ngoài
Với LCR và LPP lấy hoạt tính tại giá trị pH cho ra, kết quả của tôi cũng gần tương tự như nhóm tác
hoạt tính cao nhất làm đối chứng giả Montero và cộng sự (1993), họ kết luận rằng
Qua bảng 1 và hình 2 cho thấy hoạt tính LCR lipase tự do từ Candida rugosa ổn định hoạt tính
mạnh nhất ở pH 7.0 (1572.3 U/mg enzyme, tương trong khoảng 6.2 đến 7.7 và khi tăng pH lên 8.0 thì
ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ < 3
- >> HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG
lipase bị mất hoạt tính một cách đáng kể. Bảng 2. Thời gian bán hủy và hệ số ức chế của LPP
Còn đối với LPP thì hoạt tính tốt nhất ở pH 8.5 tại các pH khác nhau
(hoạt tính đạt 240.1 U/mg enzyme, tương ứng Lipase từ Porcine pancreas
pH
100%). Tuy nhiên so với hoạt tính tối đa của LCR t1/2 (min) kd (min-1)
thì hoạt tính của LPP thấp hơn nhiều lần. Khi 7.5 165 4.2.10-3
tăng lên pH 9.0 hoặc giảm pH 7.5 thì hoạt tính 8.0 154 4.5.10-3
8.5 148 4.7.10-3
giảm chỉ còn 45 - 55%, tiếp tục giảm thì hoạt tính 9.0 408 1.7.10-3
LPP giảm rất nhanh (pH 6.5 chỉ còn 41.1 U/mg
enzyme, tương ứng 17% hoạt tính còn lại). Điều Bảng 3. Thời gian bán hủy và hệ số ức chế của LCR
này cho thấy LPP có dải pH hoạt động hẹp hơn so tại các pH khác nhau
với LCR và LPP là một lipase ưa kiềm, đặc tính pH Lipase từ Candida rugosa
này cho thấy đây là một loại enzyme rất thích hợp t1/2 (min) kd (min-1)
cho ngành công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
6.5 217 3.2.10-3
hoạt động ở một môi trường có tính kiềm cao. Kết 7.0 210 3.3.10-3
quả của chúng tôi khá tương đồng với nhóm tác 7.5 169 4.1.10-3
giả K. Bagi, L. M. Simon (1996) cho rằng pH tối 8.0 151 4.6.10-3
ưu cửa LPP là 8.9 [4]. Như vậy, chúng tôi kết luận
LCR hoạt động trong môi trường trung tính và hơi
acid còn LPP hoạt động trong môi trường kiềm.
Từ các kết quả trên chúng tôi chọn pH 7.0 đối
với LCR, và pH 8.5 đối với LPP để tiếp tục tiến
hành các thí nghiệm về sau.
3.2. Ảnh hưởng của pH tới tính bền của hai
enzyme
Cấu trúc bậc ba của một protein phụ thuộc vào
liên kết hydro giữa các nhóm R, chỉ cần một sự
thay đổi nhỏ pH cũng có thể thay đổi khả năng
ion hóa của các chuỗi mạch bên và phá vỡ các cấu
trúc tự nhiên, trong một số trường hợp có thể làm Hình 3. Độ bền pH theo thời gian của LPP
biến tính enzyme. Do đó mỗi enzyme đều có một
khoảng pH tối ưu để giúp duy trì cấu trúc tự nhiên
của nó trong môi trường mà nó hoạt động.
Để xác định tính chất của lipase khi thủy phân
cơ chất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính bền
của hai enzyme này trong quá trình thực hiện thủy
phân dầu olive. Khảo sát tính bền của LCR trong
các giá trị pH từ 6.5 đến 8.0 sử dụng đệm phosphat,
còn LPP thì các giá trị pH từ 7.5 đến 9.0 với đệm
borat. Với mỗi giá trị pH sau những khoảng thời Hình 4. Độ bền pH theo thời gian của LCR
gian xác định (30 phút - 1h - 2h - 3h - 4h - 5h) của
quá trình thủy phân thì tiến hành đo lượng cơ chất Qua kết quả ở bảng và hình cho thấy đối với
tạo thành, xác định hoạt tính tại từng thời điểm đó, LCR tại pH 6.5, thời gian bán hủy là 217 phút (3,6
xác định giá trị kd, và tính t1/2 như công thức (2) và giờ) tương ứng với hoạt tính còn lại 50% sau 3,6
(3) trong phần 2.3.3 đã giới thiệu. Kết quả được giờ thủy phân. Tại pH 7.0, thời gian bán hủy cũng
trình bày trong bảng 2 và bảng 3 như sau: gần với tại pH 6.5 (3,5 giờ), khi pH tăng lên 8.0,
4 > ĐẶC SAN THÔNG TIN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
- HOẠT ĐỘNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỊA PHƯƠNG
nguon tai.lieu . vn
