- Trang Chủ
- Nông nghiệp
- Xây dựng quy trình Taq-Man real-time PCR phát hiện một số nhóm gene Blaoxa ở Acinetobacter baumannii
Xem mẫu
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 77
XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ
NHÓM GENE blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII
Nguyễn Tuấn Anh1*, Huỳnh Minh Tuấn2, Nguyễn Kim Huyền2, Nguyễn Vũ Hoàng Yến2,
Trịnh Thị Thoa2, Huỳnh Kim Ngân2, Võ Thị Tuyết Nga2, Nguyễn Văn Vĩnh Châu3, Hồ
Huỳnh Thùy Dương14
1
Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Khoa Thương
2
Khoa Kiểm soát Nhiễm khuẩn, Bệnh viện Đại học Y Dược
3
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
4
Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh
* Nguyễn Tuấn Anh, Email: ntanhbio@gmail.com
TÓM TẮT
Tổng quan: Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện
nguy hiểm hàng đầu hiện nay. Đặc biệt, các chủng A. baumannii sở hữu một số nhóm gene
bla
OXA, có khả năng biểu hiện tính đa kháng kháng sinh, nhất là đối với carbapenem.
Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình Taq-Man real-time PCR phát hiện một số
nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51 và blaOXA-58 điển hình ở A. baumannii.
Phương pháp: Quy trình sử dụng các mẫu dò Taq-Man được thiết kế đặc trưng cho từng nhóm
gene với các kênh màu khác nhau (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) để phát hiện các nhóm gene
bla
OXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 và gene 16S rRNA tương ứng trong cùng một phản ứng.
Phản ứng multiplex real-time PCR này được tối ưu để đạt hiệu suất nhân bản tốt nhất cho tất cả
các gene đích cần phát hiện.
Kết quả: Kết quả cho thấy quy trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA-23,
bla
OXA-51 và blaOXA-58 đặc trưng của A. baumannii với độ nhạy (4 bản sao/phản ứng) và độ
đặc hiệu cao, không cho tín hiệu dương tính với DNA của nhiều loài vi khuẩn thường thấy trong
bệnh viện.
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình Taq-Man real-time PCR phát hiện một
số nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51 và blaOXA-58 ở A. baumannii. Quy trình có thể được sử
dụng để đồng thời phát hiện nhanh các chủng A. baumannii và một số nhóm gene kháng kháng
sinh của chúng. Quy trình có thể được ứng dụng để nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện
diện một số nhóm gene blaOXA phổ biến ở A. baumannii.
Từ khóa: A. baumannii, β-lactamase, carbapenemase, OXA, real-time PCR, Taq-Man
ABSTRACT
DEVELOPMENT OF A TAQ-MAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR THE DETECTION
OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII
Nguyen Tuan Anh*, Huynh Minh Tuan*, Nguyen Kim Huyen, Nguyen Vu Hoang Yen, Trinh
Thi Thoa, Huynh Kim Ngan, Vo Thi Tuyet Nga, Nguyen Van Vinh Chau,
Ho Huynh Thuy Duong
Backgrounds: Acinetobacter baumannii currently is one of the most leading and dangerous
factors causing nosocomial infections. In addition, A. baumannii harbouring several blaOXA
genes could express the ability of multidrug resistance, especially with carbapenem.
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 78
Objectives: To set up a Taq-Man real-time PCR protocol for the detection of several typical
bla
OXA genes in A. baumannii, including blaOXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes.
Methods: The process using Taq-Man probes was designed specifically to individual genes
with distinguish flourophores (Cy5, FAM, Texas Red, HEX) to detect blaOXA-23, blaOXA-51,
bla
OXA-58 and 16S rRNA correspondingly in one reaction. The multiplex Taq-Man real-time
PCR was optimized to get the highest amplification efficiency for all targeted genes.
Results: The results showed that the protocol could detect precisely blaOXA-23, blaOXA-51 and
bla
OXA-58 genes specific to A. baumannii with high sensitivity (4 copies/reaction) and
specificity, not reacting with DNA of many common bacteria in hospital environment.
Conclusions: We built up a Taq-Man real-time PCR protocol successfully for the detection of
bla
OXA-23, blaOXA-51 and blaOXA-58 genes in A. baumannii. The protocol can also be used to
identify A. baumannii rapidly and their antimicrobial resistant blaOXA genes. Potentially, the
protocol might become a tool to study molecular epidemiology of blaOXA genes popularly in
A. baumannii.
Keywords: A. baumannii, β-lactamase, carbapenemase, OXA, real-time PCR, Taq-Man
TỔNG QUAN
Acinetobacter baumannii (A. loại vi khuẩn siêu kháng thuốc, nổi lên như tác
baumannii) có cấu trúc của một cầu trực nhân hàng đầu gây nhiễm trùng tại các bệnh
khuẩn Gram âm, nguồn gốc từ thiên nhiên viện trên thế giới [7].
(đất, nước), hiếu khí tuyệt đối và dễ mọc trên Carbapenem thường được sử dụng để
các môi trường thông thường. Khuẩn lạc nhẵn, điều trị nhiễm khuẩn do A. baumannii, đặc
màu xám trắng, đôi khi hơi nhầy, đường kính biệt đối với các chủng kháng thuốc, nhưng
khoảng từ 1,5 - 3 mm. A. baumannii có khả hiện nay thường không còn hiệu quả bởi sự
năng thích ứng với điều kiện và môi trường trỗi dậy của các chủng đa kháng (multidrug
sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trường resistance – MDR) hoặc đa kháng mở rộng
bệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế. (extensive drug resistance - XDR) [9]. Nhiều
Nhờ khả năng tạo màng sinh học (biofilm) với cơ chế kháng liên quan đến tính kháng
tính bám dính cao, vi khuẩn A. baumannii có carbapenem ở A. baumannii như sản xuất
thể gắn chặt vào bề mặt dụng cụ, môi trường, carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các
và trên da người khỏe mạnh, đặc biệt là nhân protein màng bị biến đổi, tăng biểu hiện các
viên chăm sóc sức khỏe, tạo điều kiện cho vi bơm màng hay sự mất các kênh màng / thay
khuẩn dễ dàng lây lan và tồn tại lâu dài, thu đổi tính thấm của màng. Tính kháng với
nhận, tích lũy nhiều gene kháng kháng sinh và carbapenem ở A. baumannii liên quan chủ yếu
từ đó có thể trở thành tác nhân đa kháng, gây tới sự biểu hiện của β-lactamase /
khó khăn trong điều trị và kiễm soát nhiễm carbapenemase; trong khi những cơ chế khác
khuẩn. Có nhiều loài Acinetobacter và tất cả chỉ đóng vai trò thứ yếu [8]. Bên cạnh đó,
chúng đều có khả năng gây bệnh cho người, carbapenemase phổ biến nhất ở A. baumannii
trong đó A. baumannii chiếm hơn 80% trường là β-lactamase mã hóa bởi blaOXA [10].
hợp bị nhiễm bởi các chủng thuộc Nhóm gene oxacilinase (blaOXA) là
Acinetobacter. Sự nguy hiểm của A. một trong những nhóm gene kháng kháng sinh
baumannii ở chỗ nó có khả năng kháng lại tất β-lactam của A. baumannii có khả năng giúp
cả các loại kháng sinh hiện nay. Và vì thế, đặc vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh khác
biệt nguy hiểm cho những bệnh nhân nằm nhau, đặc biệt carbapenem [5]. Nhóm gene
viện lâu ngày, phải dùng các biện pháp can này thường được mã hóa trên plasmid giúp
thiệp như ống thở hay kim truyền liên tục, tính kháng có thể lan truyền giữa các chủng vi
dùng quá nhiều kháng sinh hoặc bị suy giảm khuẩn. Sản phẩm của nhóm gene này là
miễn dịch. A. baumannii đã và đang trở thành enzyme oxacilinase, có khả năng thủy phân
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 79
carbapenem [6]. Nhóm gene này được chia Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy
thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã trình Taq-Man real-time PCR phát hiện đồng
được phát hiện ở A. baumaniii là blaOXA-23, thời các gene blaOXA-23, -51, -58 trong cùng
bla
OXA-24, blaOXA-51 và blaOXA-58 [2]. một phản ứng, giúp nhanh chóng và dễ dàng
Dịch tễ học phân tử cho thấy các nhóm gene trong công tác nghiên cứu dịch tễ học phân tử
bla
OXA phổ biến tùy khu vực khác nhau trên các gene này. Từ đó, có cơ sở xác định những
thế giới [1, 8, 10]. chủng nguy hiểm, nguy cơ cao gây nhiễm
trùng bệnh viện.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Vi khuẩn A. baumannii chuẩn (ATCC Kiểm soát nhiễm khuẩn của bệnh viện Đại học
19606) mang gene blaOXA-51 và các mẫu vi Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trong thời
khuẩn A. baumannii được phân lập bởi khoa gian từ tháng 01/2012 đến tháng 12/2013.
Chọn lựa và thiết kế mồi
Các cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho từng TTGCGCGACGTATCGGTCTTGATC -
nhóm gene blaOXA-23, -51, -58 của A. BHQ2; O58-P: Texas Red –
baumannii và cặp mồi/mẫu dò đặc hiệu cho TTTACTTTGGGCGAAGCCATGCAAG -
gene 16S rRNA (Acinetobacter spp.) làm BHQ2. Mồi và mẫu dò được đặt tổng hợp tại
chứng nội phản ứng được chọn từ một số công ty IDT (Integrated DNA Technologies,
nghiên cứu trước [3, 4] và thiết kế mới như sau USA).
O23-P: Cy5 –
Phương pháp tách chiết DNA của A. baumannii
Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii hấp phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica)
được thu nhận và tăng sinh trong môi trường bằng bộ kit tách chiết “DNA column-based
LB ở điều kiện 370C trong 24 giờ. Sau khi kết extraction kit” (Khoa Thương). Tất cả mọi
thúc tăng sinh, DNA bộ gene của A. thao tác đều được thực hiện theo đúng hướng
baumannii được tách chiết theo nguyên tắc dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất.
Thành phần phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR
Hỗn hợp phản ứng multiplex Taq-Man phản ứng multiplex Taq-Man real-time PCR:
real-time PCR tối ưu có thành phần gồm1X 15 phút – 95oC và 30 chu kỳ lập lại gồm 10
buffer, 3 mM MgCl2, 400 nM dNTPs và 2X h- giây - 95oC và 15 giây - 60oC. Tín hiệu được
Taq DNA polymerase (Solgent), 200 nM cho thu nhận với bốn màu huỳnh quang đặc trưng
từng cặp mồi O23-F/R, O51-F/R và O58-F/R, là FAM (510-530 nm), HEX (560-580 nm),
100 nM cho từng mẫu dò O23-P, O51-P và Texas Red (597-616 nm) và Cy5 (646-669
O58-P, 400 nM cho cặp mồi 16S-F/R và 200 nm). Quy trình được thực hiện trên các dòng
nM cho mẫu dò 16S-P (IDT), với 2 µl DNA máy luân nhiệt Stratagene Mx3000P hoặc
trong tổng thể tích là 25µl. Chu trình nhiệt cho Mx3005P (Agilent).
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 80
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR
Từng bộ mồi/mẫu dò được tối ưu hiệu sao/µl. Các thông số như nhiệt độ lai (Ta) của
quả nhân bản với phản ứng monoplex real- từng bộ mồi/mẫu dò, thành phần phản ứng lần
time PCR bằng mẫu DNA tổng hợp nhân tạo lượt được tối ưu. Điều kiện để phản ứng real-
của 4 đoạn gene tương ứng với 4 nồng độ như time PCR tối ưu là hiệu suất phản ứng (E) từ
nhau: 2x102, 2x104, 2x106 và 2x108 bản 90% - 105% và hệ số tương quan (R2) > 0,980.
Bảng 1. Giá trị Ct tối ưu của phản ứng monoplex real-time PCR
[DNA]* OXA-23 OXA-51 OXA-58 16S rRNA
4x102 31,8±0,4 32,6±0,9 33,8±0,5 34,8±0,3
4x104 24,9±0,1 26,6±0,0 27,2±0,2 28,6±0,4
4x106 18,1±0,2 18,7±0,2 20,4±0,1 20,7±0,4
4x108 10,3±0,1 11,3±0,1 12,2±0,1 13,7±0,0
E 90,8 90,2 90,3 90,0
R2 0,998 0,995 0,997 0,997
*
Nồng độ mẫu DNA: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 1) cho thấy các phản R2 ≥ 0,980). Đây là điều kiện chuẩn để so sánh
ứng monoplex real-time PCR đã đạt điều kiện khi phản ứng multiplex real-time PCR được
tối ưu theo như tiêu chí (E = 90% - 105% và tối ưu sau này.
Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR
Để cho thuận tiện trong việc phát hiện 16S rRNA trong cùng một phản ứng. Các
đồng thời các gene blaOXA của A. baumannii thông số như nồng độ enzyme, nồng độ MgCl2
và các vi khuẩn khác trong loài Acinetobacter và nồng độ từng bộ mồi/mẫu dò được tối ưu
spp., chúng tôi kết hợp 4 bộ mồi/mẫu dò phát trên nền mẫu DNA tổng hợp nhân tạo như
hiện blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 và trên.
Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu của phản ứng multiplex real-time PCR
[DNA]* OXA-23 OXA-51 OXA-58 16S rRNA
4x102 33,6±0,6 33,8±0,0 33,7±0,6 35,4±1,3
4x104 27,7±0,6 27,8±1,0 29,3±0,4 28,1±0,6
4x106 21,0±0,1 20,3±0,7 20,0±0,6 20,8±1,6
4x108 12,2±0,2 12,8±0,9 13,3±0,4 14,2±0,8
E 90,5 90,3 90,7 90,8
R2 0,991 0,991 0,981 0,984
*
Nồng độ mẫu DNA: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 2) cho thấy phản ứng time PCR (Bảng 1). Vì thế, phản ứng
multiplexreal-time PCR đã đạt điều kiện tối multiplex real-time PCR được cho là đã tối ưu
ưu theo như tiêu chí của phản ứng real-time thành công để phát hiện đồng thời các gene
PCR. Hơn nữa, giá trị Ct tại 4 nồng độ mẫu bla
OXA của A. baumannii và các vi khuẩn
của phản ứng multiplex real-time PCR gần Acinetobacterspp. khác trong cùng một phản
tương đương với phản ứng monoplex real- ứng.
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 81
Đánh giá quy trình multiplex real-time PCR
Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu của phản ứng multiplex flexneri (ATCC 15391), Vibrio cholerae và
real-time PCR phát hiện A. baumannii vừa tối Vibrio parahaemolyticus (ATCC 17802). Kết
ưu được xác định bằng cách thực hiện phản quả cho thấy chỉ có DNA của các chủng A.
ứng trên mẫu DNA có nguồn gốc từ chủng A. baumannii cho tín hiệu dương tính, các mẫu
baumannii (ATCC 19606) và một số chủng A. DNA của các vi khuẩn khác không cho tín
baumannii lâm sàng, đồng thời với DNA từ hiệu dương tính với với bất cứ màu huỳnh
các chủng vi khuẩn khác như: Campylobacter quang nào của quy trình. Chứng tỏ quy trình
coli, Campylobacter jejuni, Clostridium được xây dựng đặc hiệu với các gene blaOXA
botulinum, E. coli (ATCC 25922, 35218, của A. baumannii. Một số sản phẩm PCR của
35401), Listeria monocytogenes (ATCC các gene blaOXA tương ứng được giải trình tự.
19115), Salmonella typhimurium (ATCC Kết quả hoàn toàn phù hợp với các trình tự
29946), Salmonella para typhimurium, gene blaOXA khác đã được công bố trên ngân
Staphylococcus aureus (ATCC 12600), hàng dữ liệu NCBI.
Shigella boydii (ATCC 8700), Shigella
Độ nhạy
Để đánh giá độ nhạy của phản ứng mang gene blaOXA-23 và blaOXA-51 được pha
multiplex real-time PCR, DNA mẫu vi khuẩn loãng bậc 10 thành 7 nồng độ nhỏ hơn. Thành
A. baumannii TN19 (1,78x106 bản sao/μl) phần và chương trình nhiệt tối ưu của phản
mang gene blaOXA-51 và blaOXA-58 và mẫu ứng multiplex real-time PCR được sử dụng.
A. baumannii YD132 (2,76x106 bản sao/μl)
Bảng 3. Giá trị Ct độ nhạy của phản ứng multiplex real-time PCR
blaOXA- blaOXA- 16S blaOXA- blaOXA- 16S
TN19* YD132*
51 58 rRNA 23 51 rRNA
5,52x10-
N/A N/A N/A N/A N/A N/A
3,56x10-1 1
3,56x100 36,6±0,9 36,1±0,4 37,1±0,2 5,52x100 34,4±0,3 34,2±0,2 35,4±0,1
3,56x101 34,4±0,8 34,5±0,5 35,1±0,1 5,52x101 31,4±0,5 31,6±0,3 34,4±0,4
3,56x102 30,6±0,3 30,6±0,6 31,4±0,3 5,52x102 27,6±0,4 28,3±1,1 31,3±0,1
3,56x103 26,9±0,4 26,9±0,2 28,1±0,2 5,52x103 23,7±0,3 25,8±0,8 26,8±0,8
3,56x104 23,0±0,2 22,9±0,6 24,6±0,2 5,52x104 20,0±0,6 21,8±0,2 22,7±1,0
3,56x105 19,3±0,2 19,4±0,3 19,7±0,0 5,52x105 16,6±0,2 18,2±0,2 19,2±0,8
3,56x106 16,0±0,0 15,8±0,2 16,5±0,0 5,52x106 13,3±0,5 15,4±0,7 15,2±1,3
E 90,8 90,4 90,0 E 0,997 0,99 0,997
R2 0,995 0,992 0,992 R 90,2 104,2 91,0
*
Đơn vị nồng độ mẫu: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 3) cho thấy độ nhạy đạt Tổng hợp kết quả khảo sát trên mẫu
được của quy trình multiplex real-time PCR DNA tổng hợp nhân tạo cũng như mẫu DNA
phát hiện các gene OXA của A. Baumannii bộ gene của một số vi khuẩn A. baumannii cho
khoảng 4 bản sao/phản ứng. thấy khoảng động học của phản ứng multiplex
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 82
real-time PCR ổn định từ 4x100 – 4x108 bản
sao/phản ứng.
Độ ổn định
Quy trình được xác định tính ổn định điểm khác nhau, cách nhau 1 tuần, có nồng độ
bằng cách thực hiện lập lại ba lần trên 2 nồng 2x101 và 2x108 bản sao/µl.
độ mẫu DNA tổng hợp nhân tạo, tại ba thời
Bảng 4.Giá trị Ct độ ổn định của phản ứng multiplex real-time PCR
Thời điểm [DNA]* blaOXA-23 blaOXA-51 blaOXA-58 16S rRNA
1 4x108 12,9±0,1 13,0±0,2 13,8±0,1 14,2±0,2
1
4x10 35,4±0,7 36,1±0,9 35,8±0,3 36,5±0,5
2 4x108 13,1±1,0 13,5±0,6 14,0±0,0 15,4±0,5
1
4x10 34,7±0,9 34,7±1,5 35,0±1,9 35,4±1,2
3 4x108 14,0±0,8 14,1±0,3 15,6±0,8 15,2±1,2
1
4x10 34,9±0,2 35,8±0,9 37,0±0,4 34,6±0,1
*
Nồng độ mẫu DNA: bản sao/phản ứng
Kết quả (Bảng 4) cho thấy quy trình ổn nhau trên những mẫu DNA tổng hợp nhân tạo
định qua các lần lập lại tại các thời điểm khác có nồng độ cao và nồng độ thấp.
Thử nghiệm quy trình multiplex real-time PCR
Quy trình multiplex real-time PCR PCR của một số mẫu DNA có tín hiệu dương
được áp dụng thử nghiệm trên 117 mẫu vi tính đối với các gene blaOXA và 16S rRNA
khuẩn đã thu thập tại bệnh viện Đại học Y được giải trình tự để kiểm chứng.
Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Sản phẩm
Bảng 5. Kết quả phát hiện các gene blaOXA và 16S rRNA của A. baumannii và Acinetobacter
spp. bằng phương pháp multiplex real-time PCR
Gen blaOXA-23 blaOXA-51 blaOXA-58 16S rRNA
Kết quả n % n % n % n %
Dương tính 39 60 46 70,8 3 4,6 65 55,6
Âm tính 26 40 19 29,2 62 95,4 52 44,4
Tổng 65 100 65 100 65 100 117 100
Kết quả (Bảng 5) cho thấy trong các bla
OXA-58. Các chủng mang gene blaOXA-51
mẫu vi khuẩn thu thập được, có 65 (55,6%) được cho là các chủng A. baumannii mà
chủng được xác định là Acinetobacter spp. nghiên cứu đang tìm kiếm. Tất cả cả các chủng
qua sự hiện diện của gene 16S rRNA. Trong A. baumannii này đều đồng thời mang thêm
các chủng Acinetobacter spp. này, có 46 gene blaOXA-23 (39/46), không chủng nào
(70,8%), 39 (60%) và 3 (4,6%) chủng lần lượt mang blaOXA-58 (0/46). Số chủng mang gene
mang các gene blaOXA-51, blaOXA-23 và bla
OXA-58 đều thuộc vào nhóm không có
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 83
OXA-51, được xếp vào nhóm Acinetobacter
bla
sàng và cơ chế sinh bệnh do vi khuẩn này gây
spp. Kết quả giải trình tự xác nhận tính đặc ra.
hiệu của các sản phẩm được nhân bản tương Hệ enzyme β-lactamase được tạo ra
ứng và chính xác cho từng gene được phát một cách đều đặn và tồn tại tự nhiên ở A.
hiện bởi quy trình multiplex real-time PCR. baumannii thường bao gồm AmpC và
oxacillinase có hoạt tính carbapenemase.
Hiện nay, phương pháp phát hiện A.
Cùng với các enzyme tự nhiên này, một vài β-
baumannii chủ yếu là phương pháp nuôi cấy
lactamase thu nhận từ ngoài cũng được xác
truyền thống, vì A. baumannii rất dễ nuôi cấy.
định có hoạt tính carbarpenemase, các enzyme
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này
này thuộc lớp B (Metallo β-lactamase) và lớp
là mất thời gian để phân lập, định danh vi
D (OXA β-lactamase) theo hệ thống phân loại
khuẩn. Hình thái (que ngắn, nhầy) và đặc tính
của Ambler, là yếu tố quan trọng giúp A.
khó tẩy màu làm nó dễ bị định danh nhầm với
baumannii có khả năng kháng lại carbapenem
các vi khuẩn Gram (-) và (+) hình cầu khác.
(imipenem, meropenem, ertapenem,
Hơn nữa, hệ vi khuẩn A. Calcoaceticus - A.
doripenem). Mặc dù Metallo β-lactamse có
baumannii lại rất giống với
hoạt tính carbapenemase rất mạnh nhưng
Enterobacteriaceae. Ngoài ra, để định danh
được cho là không thường xuyên hiện diện ở
chính xác A. baumannii, phương pháp lai
A.baumannii, còn oxacillinase có khả năng
DNA-DNA là phương pháp tiêu chuẩn. Tuy
phân giải carbapenem, lại luôn hiện diện ở A.
nhiên, phương pháp này tốn công lao động và
baumannii. Carbapenemase phổ biến nhất ở
khó có thể ứng dụng thường qui trong chẩn
A.baumannii là nhóm OXA β-lactamase. Hiện
đoán lâm sàng. Một số phương pháp sinh học
nay, bốn nhóm OXA β-lactamase đươc xác
phân tử đã được phát triển và sử dụng để định
định ở A. baumannii là: blaOXA-23, blaOXA-
danh chính xác các chủng Acinetobacter như
24, blaOXA-51 và blaOXA-58. Trong đó,
phân tích các phân đoạn cắt giới hạn gen 16S bla
OXA-51 là enzyme được mã hóa trên nhiễm
rRNA (ARDRA), phương pháp phân tích đa
sắc thể và đặc trưng cho A. baumannii;
hình các phân đoạn gen được nhân bản, bla
OXA-23, blaOXA-24 và blaOXA-58 là
ribotyping, phân tích trình tự vùng spacer của
enzyme được mã hóa trên plasmid, là nguyên
gen 16S-23S rRNA ... Tất cả những phương
nhân giúp chúng được lan truyền mạnh trong
pháp này đều rất mất thời gian, chỉ được sử
cộng đồng.
dụng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm.
Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng Nghiên cứu này dựa trên đặc tính sở
phát hiện nhanh A. baumannii bằng real-time hữu gene blaOXA-51 để định danh chính xác
PCR dựa trên nhóm gen blaOXA-51, là gen A. baumannii và đồng thời phát hiện một số
bản thể của vi khuẩn này. Ưu điểm của gene blaOXA điển hình khác ở A. baumannii
phương pháp là đỡ tốn thời gian khi thực hiện như blaOXA-23 và blaOXA-58 nhằm đánh giá
quy trình kỹ thuật, khả năng thực hiện nhiều tính phổ biến của các gene blaOXA trong quần
mẫu cùng một lúc, hạn chế ngoại nhiễm và độ thể chủng vi khuẩn A. baumannii thu thập
nhạy và độ đặc hiệu cao. Hơn nữa, trên quan được. Qui trình tạo ra bởi nghiên cứu này
điểm lâm sàng và kiểm soát nhiễm khuẩn, điều không bao gồm blaOXA-24 vì tác giả đã thực
cần thiết phải phát hiện và phân biệt A. hiện một nghiên cứu khảo sát trước đó về sự
baumannii và các loài Acinetobacter khác, hiện diện của gene; kết quả cho thấy không
không phải A. baumannii vì các loài phát hiện gene này trong 252 chủng vi khuẩn
Acinetobacter khác rất hiếm khi là đối tượng Acinetobacter spp. được khảo sát (kết quả
quan tâm của công tác kiểm soát nhiễm khuẩn không thể hiện ở đây).
vì thường nhạy với nhiều loại kháng sinh và Kết quả khảo sát sự phổ biến của các
việc nhiễm khuẩn gây ra bởi các loài vi khuẩn gene blaOXA của nghiên cứu này cho thấy sự
này thường không đáng lo ngại. Trên quan hiện diện của blaOXA-51 / A. baumannnii
điểm nghiên cứu, việc xác định chính xác A. trong nhóm vi khuẩn Acinetobacter spp. / 16S
baumannii giúp hiểu rõ về dịch tễ học lâm rRNA+ chiếm 70,8%. Kết quả này phù hợp
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 84
tương đối với nhận định “A. baumannii chiếm này trong quần thể vi khuẩn A. baumannnii đã
hơn 80% trường hợp bị nhiễm bởi các chủng thu thập. Các hướng nghiên cứu tiếp theo cần
thuộc Acinetobacter”. Hơn nữa, tất cả các được tiến hành để đánh giá vai trò của gene
chủng A. baumannnii đều mang gene blaOXA- này đối với tính đa kháng sinh ở A. baumannii.
23. Điều này xác định tính phổ biến của gene
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Quy trình multiplex real-time PCR đã xây thời xác định xem những chủng vi khuẩn này
dựng cho phép phát hiện loài vi khuẩn có mang thêm những gene blaOXA khác, đã
Acinetobacter spp. và phát hiện chính xác A. phổ biến ở A. baumannii hay không, như
baumannii dựa trên gene blaOXA-51, đồng bla
OXA-23 và blaOXA-58.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. HIGGINS, P.G., DAMMHAYN, C., HACKEL, M., SEIFERT, H., (2010). Global
spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother 65
(2) 233-238.
2. MA, Z., ZHOU, L.Q., WANG, H., LUO, L.P., (2015). Investigation on the genomic
diversity of OXA from isolated Acinetobacter baumannii. International Journal of
Clinical and Experimental Medicine 8 (3) 4429-4432.
3. NGUYỄN, T.A., HUỲNH, M.T., NGUYỄN, V.V.C., HỒ, H.T.D., (2014). Xây dựng
qui trình EvaGreen real-time PCR phát hiện các gene blaOXA ở Acinetobacter
baumannii. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh 18 (5) 197-201.
4. NGUYỄN, T.A., ĐÀO, M.Y., HUỲNH, T.T.H., HỒ, H.T.D., (2015). Xây dựng và đánh
giá quy trình phát hiện Acinetobacter baumannii bằng real-time PCR. Tạp chí Y học TP.
Hồ Chí Minh 19 (5) 194-199.
5. NIGRO, S., HALL, R.M., (2015). Distribution of the blaOXA-23-containing transposons
Tn2006 and Tn2008 in Autralian carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii
isolates. Journal of Antimicobial Chemotherapy. Research letter.
6. NORDMANN, P., POIREL, L., (2002). Emerging carbapenemases in Gram-negative
aerobes. Clin Microbiol Infect 8 (6) 321-31.
7. OIKONOMOU, O., SARROU, S., PAPAGIANNITSIS, C.C, GEORGIADOU, S.,
MANTZARLIS, K., ZAKYNTHINOS, E., DALEKOS, G.N., PETINAKI, E., (2015).
Rapid dissemination of colistin and carbapenem resistant Acinetobacter baumannii in
central Greece: mechanisms of resistance, molecular identification and epidemiological
data. BMC infectious diseases 15 (1) 559.
8. POIREL, L., NORDMANN, P., (2006). Carbapenem resistance in Acinetobacter
baumannii: mechanisms and epidemiology. Clin Microbiol Infect 12 (9) 826-836. 5
9. PEREZ, F., HUJER, A.M., HUJER, K.M., DECKER, B.K., RATHER, P.N.,
BONOMO, R.A., (2007). Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter
baumannii. Antimicrob Agents Chemother 51 (1) 3471-84.
10. ZARRILLI, R., GIANNOULI, M., TOMASONE, F., TRIASSI, M., TSAKRIS, A.,
(2009). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic
features of an emerging problem in health care facilities. J Infect Dev Ctries 3 (5) 335-
341.
nguon tai.lieu . vn
