- Trang Chủ
- Nông nghiệp
- Xây dựng quy trình định lượng dioscin từ hoa thốt nốt (Borassus flabellifer L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao
Xem mẫu
- QUANTITATIVE ANALYSIS OF DIOSIN
IN Borassus flabellifer L. FLOWER BY HPLC
Nguyen Pham Tuan1*, Tran Thi Que1,
Nguyen Hoang Nam1, and Nguyen Hoang Thai1
1
An Giang Biotechnology center, Chau Thanh district, An Giang province
*Corresponding author: ngphamtuan1983@gmail.com
Tel: +84.0988.202055
Abstract
The study introduced a HPLC method for quantitative analysis of dioscin in
Borassus flabellifer flower. A rapid and effective HPLC method is described for the
assay of diosin in me 20 µL of dioscin solution was injected onto a C8 reverse phase
column (5 µm, 120 Å, 4.6×150 mm). The mobile phase employed was acetonitrile:
water (65: 40, v/v) at a flow rate of 0.8 mL/min. The column effluent was monitored
within 5 minutes by diot array detection at 209 nm. The retention time of dioscin was
found to be 5.02 minutes. In the concentration range of 60 - 300 μg/mL, there was a
tight linear correlation between peak area y (mAU.min) and sample concentration x
(μg/mL) according to the equation y = 6854.4x + 7144.4 as the squared correlation
coefficient R2 was 0.997. The limit of detection and limite of quantification were
respectively 2 and 6.6 μg/mL. The method was specific to dioscin with good precision
and accuracy. The percentage recovery was ≤ 100 ± 4%, the relative standard
deviation of the repeatability was ≤ 1.69% and the relative standard deviation of the
intermediate precision was ≤ 1.85%.dicinal plant.
Keywords: HPLC, Borassus flabellifer, dioscin, accuracy, precision.
190
- XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG DIOSCIN
TỪ HOA THỐT NỐT (Borassus flabellifer L.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÂNG CAO
Nguyễn Phạm Tuấn1*, Trần Thị Quế1,
Nguyễn Hoàng Nam1 và Nguyễn Hoàng Thái1
1
Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang,
huyện Châu Thành, tỉnh An Giang
*Tác giả liên hệ: ngphamtuan1983@gmail.com
Số điện thoại: 0988.202055
Tóm tắt
Mục đích của nghiên cứu này là xây dựng được quy trình định lượng dioscin từ
hoa thốt nốt. Một quy trình định tính, định lượng dioscin nhanh chóng, hiệu quả bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha tĩnh được sử dụng là cột sắc ký
pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 µm), pha động là hỗn hợp acetonitril: nước
(60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Mẫu được tiêm với thể tích 20 µL, thời gian sắc
ký 5 phút, bước sóng phát hiện 209 nm. Thời gian lưu của dioscin là 5,02 phút. Kết
quả thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ từ 60 - 300 μg/mL, có sự tương quan
tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (μg/mL)
theo phương trình y = 6854,4x + 7144,4 với hệ số xác định R2 = 0,997. Giới hạn phát
hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 2 và 6,6 μg/mL. Phương pháp đảm bảo tính
đặc hiệu với dioscin, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 4%, độ
lệch chuẩn tương đối của độ lặp lại ≤ 1,69%, độ lệch chuẩn tương đối của độ chính
xác trung gian ≤ 1,85%.
Từ khóa: sắc ký lỏng, hoa thốt nốt, độ chính xác, độ đúng, dioscin.
191
- 1. Mở đầu
Trong y học dân gian Việt Nam, hoa thốt nốt đực (Borassus flabellifer) được sử
dụng để chữa sốt và lợi tiểu. Qua nhiều nghiên cứu của các tác giả ngoài nước cho
thấy hoa thốt nốt đực có chứa nhóm saponin steroid, chủ yếu là spirostan và dioscin.
Trong đó dioscin đã được nghiên cứu có tác dụng chống ung thư và chống viêm rất
mạnh trên mô hình thử in vitro (tế bào) và mô hình in vivo. Các kết quả này gợi ý rằng
chất dioscin là hoạt chất chính mang lại các tác dụng đã được đề cập của hoa thốt nốt
đực nên có thể sử dụng làm chất đánh dấu trong các tiêu chí định tính và định lượng
(Zhao et al., 2016; Wang et al., 2018). Dioscin là một hợp chất steroid, được hình
thành khi diosgenin và glucoside liên kết với nhau thông qua liên kết - 1,3 glycosidic.
Đây là hợp chất được tìm thấy chủ yếu trong thực vật thuộc chi củ Nâu (tên khoa học
là Dioscora zingiberensis). Liên kết thủy phân dioscin-diosgenin rất quan trọng, là nền
tảng cơ bản trong việc sản sinh nội tiết tố có tác dụng điều trị hiệu quả việc chống
nhiễm trùng, các bệnh do virus, bệnh khớp, các bệnh về tim mạch, da liễu. Bên cạnh
đó, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng dioscin có tác dụng chống ung thư. Cơ chế
chống ung thư bằng hệ ROS của diosin cũng được nghiên cứu bởi Wang et al. (2012).
Nhóm tác giả kết luận rằng dioscin, một saponin glucoside được phân lập từ một loại
củ nâu (tên khoa học là Dioscora panthaica) có tác dụng bảo vệ gan và chống ung thư
ở người thông qua cơ chế ―apoptosis‖- một quá trình kiểm soát bao gồm nhiều bước,
nhằm loại bỏ các tế bào không mong muốn trong một hệ thống sinh học. Nghiên cứu
đã khẳng định Dioscin ức chế tế bào ung thư do gây ra dây chuyền phản ứng oxy hóa
khử (ROS). Song song đó, Zhao et al. (2016) cũng tiến hành nghiên cứu và đưa ra cơ
chế chống ung thư cổ tử cung. Đồng thời, nghiên cứu của Wang et al (2018) chứng
minh được khả năng chống ung thư phổi của dioscin. Cho đến thời điểm hiện tại, trong
nước chưa có nghiên cứu nào về dioscin được công bố. Như vậy, phát triển các nghiên
cứu về dioscin là một hướng mới tại Việt Nam, tạo điều kiện cho bệnh nhân có thêm
một lựa chọn thuốc trong điều trị. Xây dựng phương pháp định lượng dioscin theo tiêu
chuẩn quốc tế là công việc hết sức cần thiết nhằm kiểm soát chất lượng thuốc đồng
thời tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo như bào chế, đánh giá tương đương sinh
học, theo dõi dược động học của thuốc.
(a) (b)
Hình 1. Cấu trúc hóa học của dioscin (a) và hoa Thốt nốt (b).
2. Vật Liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu hoa Thốt nốt (Borassus flabellifer L.) được thu
hái tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang. hoa Thốt nốt sau khi thu hái từ các nhà vườn
được vận chuyển về phòng thí nghiệm của Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang.
192
- Thiết bị và hóa chất: hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), cân phân tích
(Shimadzu, Nhật Bản), màng lọc 0,45µm (Merck, Đức), methanol (Merck, Đức),
Dioscin (Merck, Đức), Acetonitril (Merck, Đức),… hóa chất và thiết bị cần thiết khác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Chuẩn bị mẫu chuẩn
Cân chính xác 6mg chất chuẩn Dioscin (độ tinh khiết 95% - Sigma). Hòa tan
chuẩn với trong 10 mL methanol, được dung dịch chuẩn nồng độ 600µg/mL. Xây
dựng đường chuẩn với các nồng độ dioscin là 60 µg/mL; 120 µg/mL; 180 µg/mL; 240
µg/mL; 300 µg/mL.
Chuẩn bị mẫu thử
Lấy 10 gam bột nguyên liệu, cho vào túi giấy lọc, chiết Soxhlet với 300 ml cồn
96% (16 giờ). Dịch chiết được cô áp suất thấp thu được cắn. Hòa cắn trong 20 ml nước
cất, chuyển vào bình lắng gạn 100 mL. Chiết dịch nước với diethyl ether 4 lần, mỗi lần
20 mL. Dịch nước tiếp tục chiết với n-butanol bão hòa nước 4 lần, mỗi lần 20 mL. Tập
trung phần dịch n-butanol lại rồi cô đến cắn. Pha loãng mẫu 250 lần với methanol và
lọc qua màng 0,45 µm và tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC. Ghi nhận diện tích peak,
hàm lượng dioscin được tính dựa trên đường chuẩn.
Hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), gồm: Bơm LC-20AT, bộ tiêm mẫu tự
động SIL20AHT, detector UV-vis, phần mềm Labsolution để truy xuất hình ảnh và số
liệu trên máy HPLC. Phần mềm Excel (Microsoft Office) được sử dụng để tính toán
kết quả.
Điều kiện sắc ký
- Detector: SPD-M20A; pump: LC-30AD 15.
- Cột sắc ký: Merck C18 (15cm x 4,6 mm x 5µm).
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.
- Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút.
- Pha động: Acetonitril: H2O = 60: 40 (v/v).
- Bước sóng: 209 nm.
Thẩm định quy trình định lƣợng dioscin
Quy trình được đánh giá theo hướng dẫn của các tài liệu tham khảo (Trần Cao
Sơn và cs., 2010), bằng việc khảo sát các chỉ tiêu sau đây: độ đặc hiệu, độ tương thích
hệ thống, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định
lượng (LOQ) của phương pháp.
Khảo sát hàm lƣợng dƣợc chất hiện diện ở từng phần của hoa thốt nốt
Hai bộ phận của phát hoa (hoa và cuống) sau khi được tách riêng để xử lý. Lấy
10 gam mỗi loại, cho vào túi giấy lọc, chiết Soxhlet với 300 mL cồn 96% (16 giờ).
Dịch chiết được cô áp suất thấp thu được cắn. Hòa cắn trong 20 mL nước cất, chuyển
vào bình lắng gạn 100 mL. Chiết dịch nước với diethyl ether 4 lần, mỗi lần 20 mL.
Dịch nước tiếp tục chiết với n-butanol bão hòa nước 4 lần, mỗi lần 20 mL. Tập trung
193
- phần dịch n-butanol lại rồi cô đến cắn. Pha loãng mẫu 250 lần với methanol và lọc qua
màng 0,45µm và tiêm dịch lọc vào hệ thống HPLC, ghi nhận lại diện tích peak.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Thẩm định quy trình phân tích
Thẩm định quá trình phân tích là một quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các
thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu
cầu phân tích dự kiến (Trần Cao Sơn và cs., 2010).
3.1.1. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu hay còn gọi là tính chọn lọc của một quy trình phân tích là khả năng
của quy trình cho phép xác định chính xác và đặc hiệu các chất cần phân tích mà
không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử (Trần Cao Sơn
và cs., 2010).
Hình 2. (a) Sắc ký đồ mẫu blank; (b) Sắc ký đồ dioscin chuẩn;
(c) Sắc ký đồ mẫu hoa Thốt nốt.
Tiến hành phân tích mẫu blank (methanol), mẫu chuẩn dioscin, mẫu hoa thốt
nốt theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Các sắc ký đồ thu được trình bày trong Hình 2.
Kết quả thu được cho thấy tín hiều peak của chất dioscin xuất hiện tại thời gian lưu
(tR ~ 5,0 phút). Trên sắc ký đồ mẫu blank, không thấy xuất hiện tín hiệu peak tại thời
gian lưu này và trên sắc ký đồ các mẫu thử hoa thốt nốt có xuất hiện tín hiệu peak
này, tín hiệu này tách khỏi các tín hiệu khác hiện trên sắc ký đồ. Điều này chứng tỏ,
phương pháp có tính đặc hiệu chọn lọc phù hợp cho phân tích dioscin trong nguyên
liệu thốt nốt.
3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống
Để đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tiến hành pha 01 mẫu đối chiếu
có nồng độ 150 µg/mL. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện đã lựa chọn, kết
quả được trình bày trong Bảng 1.
194
- Bảng 1. Kết quả định lƣợng 1 mẫu với 6 lần lặp lại.
RSD
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 TB
(%)
Thời gian 5,24 5,06 5,013 5,008 4,96 4,91 5,0242 1,96
lƣu (phút)
Speak 707.254 713.959 707.348 709.825 710.842 712.549 710.296 0,349
(AU.s)
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian và diện tích peak lần lượt là 1,96% và
0,349% (đều < 2%). Kết quả cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống
HPLC sử dụng là phù hợp và đảm bảo sự ổn định của phép phân tích định lượng
chất dioscin.
3.1.3. Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính của phƣơng pháp định lƣợng
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của
phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự tương quan tỷ lệ giữa đại lượng đo được y
và nồng độ x. Cả hai trường hợp điều yêu cầu giữa đại lương đo được và nồng độ phải
có sự phụ thuộc tuyến tính (Trần Cao Sơn và cs., 2010).
Chuẩn bị một dãy gồm 05 dung dịch mẫu đối chiếu dioscin như trên rồi tiến hành
chạy phân tích sắc ký lỏng cao áp theo quy trình nghiên cứu. Kết quả phân tích định
lượng dioscin với các mức nồng độ khác nhau (60 - 300 µg/mL) được trình bày trong
Bảng 2. Dựa vào kết quả phân tích định lượng dioscin, tiến hành xây dựng phương
trình đường chuẩn dioscin và tình toán giá trị hệ số tương quan (Hình 3). Kết quả xây
dựng được phương trình đường chuẩn và giá trị hệ số tương quan có sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ của chất đối chiếu dioscin (x) và diện tích peak (y) với
phương trình hồi quy: y = 6854,4x + 7144,4 và hệ số tương quan R2 = 0,997.
Bảng 2. Kết quả định lƣợng mẫu dioscin chuẩn.
Nồng độ (µg/mL) 60 120 180 240 300
Diện tích peak (AU.s) 413.219 871.046 1.184.602 1.661.538 2.074.301
Hình 3. Phƣơng trình đƣờng chuẩn dioscin.
195
- 3.1.4. Khảo sát độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy với
giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng
nhất trong cùng điều kiện xác định (Trần Cao Sơn và cs., 2010).
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chất chuẩn,
tức là thêm vào mẫu M1 đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác chất
dioscin sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Cụ thể, pha dung dịch mẫu chuẩn dioscin có nồng độ 20 µg/mL và mẫu thử được pha
dung dịch thử như trên. Hút chính xác 1 mL dịch thử và 1 mL dung dịch chất đối chiếu
dioscin, lắc đều rồi tiến hành định lượng. Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức
sau: (%) = [(𝑆𝑐 + 𝑆𝑀) ∗ 100]/𝑆𝑇
Trong đó: SC: Diện tích peak chất chuẩn.
SM: Diện tích peak chuẩn; STH: Diện tích peak thu hồi
Bảng 3. Xác định độ đúng của phương pháp.
% Thu
TT Mẫu TR (phút) Diện tích peak (AU.s) RSD (%)
hồi
1 Đối chiếu 4,534 113.250
2 Mẫu 4,896 2.256.430
3 Thu hồi 1 4,55 1.141.758 96,36
4 Thu hồi 2 4,602 1.190.152 100,45
5 Thu hồi 3 5,194 1.196.070 100,95
1,69
6 Thu hồi 4 4,848 1.170.689 98,81
7 Thu hồi 5 4,883 1.165.151 98,34
8 Thu hồi 6 4,936 1.162.215 98,09
Trung bình 98,83
Độ đúng của phương pháp được xác định từ tỷ lệ (%) thu hồi của chất thu được
từ kết quả định lượng so với lượng chất chuẩn thêm vào. Kết quả phân tích cho thấy,
quy trình định lượng chất dioscin có khả năng thu hồi cao (>96%, RSD
- phân tích hàm lượng dioscin trong hoa Thốt nốt được trình bày trong Bảng 4. Hàm
lượng chất dioscin là 2,7326 và giá trị RSD = 1,846%. Như vậy, có thể áp dụng
chương trình đã lựa chọn để định lượng chất dioscin trong mẫu hoa thốt nốt.
Bảng 4. Kết quả xác định độ lặp lại của phƣơng pháp.
RSD
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
(%)
Khối lƣợng cao
0,2002 0,2002 0,2187 0,2015 0,2023 0,2241
định lƣợng (g)
1,846
Hàm lƣợng
2,7959 2,7136 2,7678 2,7352 2,7349 2,6483
dioscin (%)
Hàm lƣợng trung
2,7326
bình dioscin(%)
3.1.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của
chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết phải xác
định chính xác hàm lượng (Trần Cao Sơn và cs., 2010).
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của
chất cần thử trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác
thích hợp. Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp định lượng đối với
lượng thấp nhất của chất thử trong khuôn mẫu và được sử dụng đặc biệt trong việc xác
định các tạp chất và các sản phẩm phân hủy. Giới hạn định lượng có thể được biễu
diễn bằng sự cho phép có mặt của chất cần thử trong mẫu đem thử và nồng độ phần
tram, phần ngàn, phần triệu,.. (Trần Cao Sơn và cs., 2010)
Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ còn có xuất hiện tín hiệu của chất đối chiếu và
xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền.
S/N = 2H/h
Trong đó: H là chiều cao của peak ứng với chất cần thử trên sắc ký đồ.
h: Là khoảng dao động của nhiễu đường nền trên sắc ký đồ thu được với mẫu trắng.
Phân tích mẫu dioscin ở nồng độ 20 µg/mL, sau đó pha loãng dần đến khi dung
dịch chuẩn không còn xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Nồng độ dung dịch chuẩn là
2 µg/mL, thì tỷ số giữa chiều cao tín hiệu và nhiễu đường nền: S/N = 2H/h = 2 x 0,6/0,6
= 2, đạt trong khoảng từ 2-3. Như vậy, nồng độ 2 µg/mL được coi là giới hạn phát hiện
(LOD) của phương pháp. Giới hạn định lượng LOQ = 3,3 x LOD = 6,6 (µg/mL).
Bảng 5. Kết quả xác định LOD và LOQ.
Nồng độ chất dioscin
20 10 2 1
(µg/mL)
Speak (AU.s) 84.698 42.025 17.941 Không có tín hiệu
197
- 3.2. Khảo sát hàm lƣợng dƣợc chất hiện diện ở từng phần của hoa thốt nốt
Sau khi thẩm định quy trình nghiên cứu tiến hành định lượng hàm lượng dioscin
có trong hai mẫu nguyên liệu thu thập, đó là hoa và cuống hoa Thốt nốt.
Từ kết quả thẩm định phương pháp phân tích, xác định được phương trình hồi
quy: y = 6854,4 x + 7144,4 (R2 = 0,997).
Hàm lượng dioscin (%) trong nguyên liệu được tính theo công thức như sau:
X = (x x C% x d x 10-4)/p
Trong đó: X: là hàm lượng phần trăm dioscin trong mẫu (%).
x: nồng độ dioscin trong dung dịch phân tích sắc ký tính dựa theo đường chuẩn
(μg/mL).
d: độ pha loãng.
C%: độ tinh khiết của chất chuẩn (C%=0,95).
p: Khối lượng mẫu thử đã trừ ẩm (g).
Bảng 6. Kết quả phân tích hàm lƣợng diosin trong hoa và cuống hoa Thốt nốt.
Nồng độ
Khối Độ
Độ theo Hàm
lƣợng ẩm Trung bình
Mẫu Speak pha đƣờng lƣợng
mẫu cao (%)
loãng chuẩn (%)
khô (g) (%)
(µg/mL)
10 669.941 96,697 0,2491
Hoa 10 7,8 708.977 102,392 0,2638 0,2693 ± 0,023
10 792.177 114,530 0,295
250
10 153.514 21,3541 0,0523
0,0523 ±
Cuống 10 3,12 154.654 21,5204 0,0528
0,0004
10 152.305 21,1777 0,0519
Từ kết quả phân tích trên cho thấy, hàm lượng dioscin hiện diện trong phần hoa
thốt nốt (0,2693%) nhiều hơn khoảng 5 lần so với phần cuống hoa (0,0523%). Ngoài
ra, do phần cuống hoa chiếm tỷ lệ rất ít trong một phát hoa của cây Thốt nốt, nên hoa
Thốt nốt có thể sử dụng nghiên cứu và làm nguồn nguyên liệu cho quá trính sản xuất
các sản phẩm có khả năng hỗ trợ và điều trị bệnh.
4. Kết luận
Lần đầu tiên quy trình định lượng dioscin trong hoa Thốt nốt bằng kỹ thuật
HPLC cột pha đảo C18 với đầu dò UV-Vis đã được xây dựng và thẩm định. Pha tĩnh
được sử dụng là cột sắc ký pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 µm), pha động là hỗn
hợp acetonitril: nước (60:40, v/v), tốc độ dòng 0,8 mL/phút. Mẫu được tiêm với thể
tích 20 µL, thời gian sắc ký 5 phút, bước sóng phát hiện 209 nm. Thời gian lưu của
198
- dioscin là 5,02 phút. Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu,
độ lặp lại, độ đúng, khảo sát được tính tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng của phương pháp.
Lời cảm ơn
Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An
Giang và Sở Khoa học và Công nghệ An Giang đã tạo điều kiện và giúp đỡ thực hiện
nghiên cứu.
Tài liệu tham khảo
Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lệ Thị Hồng Hảo và Nguyễn Thành Chung. (2010).
Thẩm định phương pháp phân tích trong hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản
Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội, 102 trang.
Wang, Y.C., De-Wei, W., Tzu-Chin, W., Lee ,W., Chih-Yi, C. and Huei, L. (2018).
Dioscin overcome TKI resistance in EGFR-mutated lung adenocarcinoma cells
via down-regulation of tyrosine phosphatase SHP2 expression; Internatioanl
journal of biological sciences.
Wang, Z., Cheng, Y., Wang, N., Wang, D.M., Li, Y.W., Han, F., Shen, J.G., Yang,
D.P., Guan, X.Y. and Chen, J.P. (2012). Dioscin induces cancer cell apoptosis
through elevated oxidative stress mediated by downregulation of peroxiredoxins;
School of Chinese Medicine; The University of Hong Kong; Hong Kong, China.
Zhao, X., Xufeng, T., Lina, X., Lianhong, Y., Yan, Q., Youwei, X., Xu, H. and
Jinyong, P. (2016). Dioscin Induces Apoptosis in Human Cervical Carcinoma
HeLa and SiHa Cells through ROS-Mediated DNA Damage and the
Mitochondrial Signaling Pathway; College of Pharmacy, Dalian Medical
University, Western 9 Lvshunnan Road, Dalian 116044, China.
199
nguon tai.lieu . vn