- Trang Chủ
- Nông nghiệp
- Xác định vị trí phân loại của họ limnocharitaceae bằng dữ liệu phân tử dựa trên dna tổng từ quy trình tách chiết nhanh
Xem mẫu
- Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018
XÁC ĐỊNH VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CỦA HỌ LIMNOCHARITACEAE
BẰNG DỮ LIỆU PHÂN TỬ DỰA TRÊN DNA TỔNG
TỪ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT NHANH
Huỳnh Nữ Băng Thùy, Nguyễn Anh Đức, Trình Trung Hiếu,
Võ Tuấn Dũng, Văn Hồng Thiện*
Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm – Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM
*Tác giả liên lạc: vanhongthien@iuh.edu.vn
(Ngày nhận bài: 22/12/2017; Ngày duyệt đăng: 22/3/2018)
TÓM TẮT
Nghiên cứu này giới thiệu một quy trình tách chiết DNA nhanh và hiệu quả từ phương
pháp CTAB cải tiến, từ đó, áp dụng vào phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự matK
của loài Limnocharis flava nhằm xác định vị trí phân loại của họ Limnocharitaceae.
Kết quả cho thấy, trình tự của sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA tổng được tách
chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến cho kết quả có độ tin cậy cao. Ngoài ra, phân
tích phả hệ cũng cho thấy, các loài thuộc họ Limnocharitaceae đều xếp gọn bên trong
các loài thuộc họ Alismataceae, từ đó đã khẳng định lại vị trí phân loại của họ
Limnocharitaceae.
Từ khóa: Tách chiết DNA, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae.
TAXONOMIC IDENTITY OF LIMNOCHARITACEAE BASED ON
MOLECULAR DATA FROM A RAPID DNA EXTRACTION PROTOCOL
Huynh Nu Bang Thuy, Nguyen Anh Duc, Trinh Trung Hieu,
Vo Tuan Dung, Van Hong Thien*
Institute of Biotechnology and Food Technology – Industrial University of
Ho Chi Minh City
*Corresponding Author: vanhongthien@iuh.edu.vn
ABSTRACT
In this study, we used a rapid and effective DNA extraction protocol which are modified
from CTAB method to amplify matK sequence of Limnocharis flava for determination
of taxonomic position of Limnocharitaceae family. The data demonstrated that the matK
sequence amplified by this protocol had high reliability. Furthermore, phylogenetic
analysis revealed that species of Limnocharitaceae nested in Alismataceae family, and
thus taxonomic position of Limnocharitaceae family was re-classified.
Keywords: DNA extraction, limnocharis flava, limnocharitaceae, alismataceae.
TỔNG QUAN Limnocharitaceae vào họ Alismataceae
Limnocharitaceae là một họ thực vật với (www.theplantlist.org). Tuy nhiên, ở Việt
số lượng loài khá ít (Phạm Hoàng Hộ, Nam, Phạm Hoàng Hộ (2000) cho rằng,
2000). Theo các bằng chứng về phôi, sinh Limnocharitaceae là một họ riêng biệt và
hóa và cả phân tử đã cho thấy, họ chỉ gồm 2 loài là Limnocharis flava và
Limnocharitaceae có mối quan hệ rất gần Tenagocharis latifolia. Do đó, đề tài
với họ Alismataceae (Donald and nghiên cứu này sẽ cung cấp thêm dữ liệu
Nicholas, 2013) và hiện nay, trên hệ thống phân tử (vùng trình tự matK của gen lục
thông tin về thực vật của Vườn thực vật lạp) nhằm góp phần xác định vị trí phân
Hoàng gia Anh (Kew) đã nhập họ loài của họ Limnocharitaceae (với đại diện
76
- Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018
là loài L. flava). phút (3 phút đảo đều); (3) Bổ sung 800 µl
Hiện nay, việc ứng dụng các chỉ thị phân chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), đảo
tử trong nghiên cứu phân loại học ở thực đều; (4) Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút
vật trở nên rất phổ biến trên thế giới ở 4ºC, thu dịch nổi trên cùng sang 1
(Palmer et al., 2004) và Việt Nam (Văn eppendorf khác; (5) Thêm 800 µl
Hồng Thiện, 2017). Để thành công trong isopropanol, đảo nhẹ, để ủ ở tủ -20ºC trong
các phản ứng PCR thì một phần công việc 30 phút; (6) Ly tâm 13000 vòng trong 10
hết sức quan trọng là tách chiết DNA tổng phút ở 4ºC, loại bỏ dịch nổi và thu tủa; (7)
số. Hiện tại, hầu hết các nghiên cứu có liên Thêm 800 µl ethanol 70%, ly tâm 13000
quan đến quá trình tách chiết DNA đều tập vòng trong 10 phút ở 4ºC thu tủa; (8) Để
trung vào 2 phương pháp: (1) sử dụng các khô tủa 15-25 phút, thêm 50 µl dung dịch
bộ kít chuyên dụng và (2) phương pháp TE và bảo quản ở -20ºC.
CTAB. Phương pháp đầu tiên có ưu điểm Phương pháp PCR
là cho kết quả nhanh, DNA khá tinh sạch, Vùng trình tự matK của gen lục lạp được
tuy nhiên chi phí lại khá cao. Ngược lại, khuếch đại bằng cặp mồi theo Fazekas et
phương pháp CTAB ít tốn kém hơn nhưng al. (2012). Phản ứng PCR được thực hiện
quy trình thực hiện phức tạp và thường mất trên máy Mastercycler (hãng Eppendorf,
thời gian. Do vậy, trong khuôn khổ bài báo Đức) với các thành phần như sau: 12,5 µl
này, chúng tôi giới thiệu 1 quy trình tách Go Taq Green Master Mix (hãng Promega,
chiết DNA nhanh từ phương pháp CTAB Mỹ), 1,25µl mỗi mồi xuôi và ngược (10
có cải tiến cũng như quy trình chuẩn dung µM), 9 µl nước khử ion và 1 µl DNA mẫu.
cho phản ứng PCR từ phương pháp này. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR gồm: 5
Sản phẩm DNA tổng số sau khi được tách phút ở 95°C; 35 chu kỳ gồm: biến tính (1
chiết sẽ được đưa ngay vào thực hiện phản phút ở 94°C), bắt cặp (1 phút 30 giây ở
ứng PCR mà không cần phải qua các bước 55oC) và kéo dài (1 phút 30 giây ở 72°C);
định tính hay định lượng. kéo dài ở 72°C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được tin sạch và giải trình
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG tự tại Công ty Nam Khoa, quận 7,
PHÁP NGHIÊN CỨU TP.HCM.
Nguyên vật liệu Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài
Mẫu Limnocharis flava được thu tại huyện Kết quả giải trình tự 2 chiều được kiểm tra
Bến Lức, tỉnh Long An với 3 cá thể (ký độ chính xác bằng mắt với sự hỗ trợ của
hiệu mẫu là L1, L2, L3). phần mềm FinchTV và Seaview. Các trình
Phương pháp nghiên cứu tự được sắp gióng bằng phần mềm
Phương pháp tách chiết DNA tổng số ClustalX2.1 (Thompson et al., 1994), ghi
(1) Khử mẫu lá với cồn 70% ; (2) Nghiền nhận khoảng cách di truyền và xây dựng
200mg mẫu lá trong 1000 µl dung dịch cây phả phát sinh loài của mẫu nghiên cứu
đệm tách chiết (NaCl 1.5M, Tris-HCl (pH và các trình tự từ Genbank (Bảng 1). bằng
8,0) 100 mM; EDTA (pH 8,0) 20 mM, phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013)
CTAB 4%) (tăng hiệu quả thành công nếu theo phương pháp Neighbor Joning với
mẫu được chuyển thành dạng bột với Nitơ nhóm ngoại là loài Limnobium spongia
lỏng), vortex mạnh và ủ 60ºC trong 15 (Donald and Nicholas, 2013).
Bảng 1. Trình tự của các taxa từ dữ liệu GenBank được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên loài Mã số STT Tên loài Mã số
GenBank GenBank
1 Albidella EF088125 14 Echinodorus EF088117
nymphaeifolia decumbens
77
- Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018
2 Alisma gramineum KX526478 15 Helanthium KF632794
bolivianum
3 Alisma lanceolatum HM850585 16 Helanthium EF088120
zombiense
4 Alisma nanum JF781066 17 Hydrocleys AB002580
nymphoides
5 Baldellia HM850587 18 Limnocharis flava HQ456464
ranunculoides
6 Butomopsis latifolia HQ456459 19 Limnophyton JF781076
angolense
7 Burnatia enneandra JN547814 20 Luronium natans JN894192
8 Caldesia grandis JF781068 21 Ranalisma humile HQ456466
9 Caldesia oligococca KF632791 22 Ranalisma JF781078
rostratum
10 Damasonium alisma JF781070 23 Sagittaria JF781084
graminea
11 Damasonium minus JF781069 24 Sagittaria JF781081
guayanensis
12 Echinodorus EF088134 25 Wiesneria HQ535983
berteroi triandra
13 Echinodorus KF632792 26 Limnobium HQ456471
cordifolius spongia
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 900 bp so với thang chuẩn. Kết quả này
Kết quả khuếch đại trình tự vùng matK phù hợp với kích thước lý thuyết của cặp
Kết quả thể hiện ở Hình 1 cho thấy, sản mồi do Fazekas et al., (2012) thiết kế mà
phẩm PCR của 3 cá thể nghiên cứu đều chúng tôi sử dụng cho đề tài nghiên cứu
sáng rõ, kích thước nằm giữa vạch 800 và này.
Hình 1. Kết quả PCR của 3 cá thể loài L. flava
Như vậy, 3 phản ứng PCR được thực hiện chính xác của sản phẩm PCR cũng như cho
dựa trên các mẫu DNA tổng số vừa được các phân tích tiếp theo, chúng tôi cho ngẫu
thực hiện theo quy trình tách nhanh mà nhiên 1 sản phẩm để giải trình tự (mẫu L2).
chúng tôi cải tiến từ phương pháp CTAB Trình tự DNA của mẫu nghiên cứu sau khi
đã cho kết quả tốt. Để khẳng định tính hiệu chỉnh sẽ được kết hợp với bộ dữ liệu
78
- Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018
từ GenBank để xây dựng cây phát sinh loài đến 769 bp. Các trình tự sau khi sắp gióng
nhằm xác định mối tương quan giữa họ có chiều dài 704 đến 742 bp. Trình tự
Limnocharitaceae và Alismataceae. matK của mẫu nghiên cứu (L2) có tỉ lệ A
Kết quả xây dựng cây phả hệ + T là 68%, có 9 vị trí thêm đoạn
Kết quả phân tích đặc điểm trình tự của các (insertion) so với nhóm ngoại ở các vị trí
taxa nghiên cứu cho thấy, trình tự vùng từ 52 đến 60.
matK của các taxa dao động khoảng từ 750
Hình 2. Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ di truyền giữa họ Limnocharitaceae
và Alismataceae dựa trên vùng trình tự matK được xây dựng dựa trên mẫu nghiên cứu
(L2) và các taxa từ dữ liệu GenBank bằng phần mềm MEGA6, phương pháp Neighbor
Joning, bootstrap 1.000 lần lặp lại
Cây phát sinh loài thể hiện ở Hình 2 cho L. flava (HQ456464) không có sự khác
thấy, mẫu nghiên cứu (L2) xếp chung biệt và do đó, giữa chúng có khoảng cách
nhóm với loài Limnocharis flava (mã số di truyền bằng 0 (Bảng 2). Như vậy, từ kết
GenBanK là HQ456464) với bootstrap là quả trên đây đã chứng minh rằng, mẫu
100%. Ngoài ra, xét trên toàn bộ trình tự nghiên cứu được PCR từ DNA tổng số là
vùng matK cũng cho thấy mẫu L2 và loài hoàn toàn chính xác.
79
- Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018
Bảng 2. Khoảng cách di truyền giữa mẫu nghiên cứu (L2) và các taxa
thuộc họ Alismataceae
1 2 3 4 5 6 7
1. Albidella nymphaeifolia
2. Burnatia enneandra 0.052
3. Limnocharis flava 0.082 0.081
(HQ456464)
4. Limnocharis flava (L2) 0.082 0.081 0.000
5. Hydrocleys nymphoides 0.049 0.049 0.054 0.054
6. Butomopsis latifolia 0.071 0.077 0.074 0.074 0.049
7. Caldesia grandis 0.065 0.074 0.079 0.079 0.060 0.074
8. Limnophyton angolense 0.084 0.082 0.104 0.104 0.077 0.084 0.087
Ngoài ra, cây phát sinh loài (Hình 2) cũng gần về mặt di truyền so với các taxa thuộc
cho thấy, các loài thuộc họ họ Alismataceae. Chẳng hạn, Donald and
Limnocharitaceae gồm (L. flava, H. maryke (1997) xây dựng cây phát sinh loài
nymphoides và B. latifolia) xếp cùng nhau dựa trên vùng mã hóa (coding) của gen lục
và xếp gọn bên trong các loài thuộc họ lạp cho các loài thủy sinh đã cho thấy rằng,
Alismataceae. Theo đó, khoảng cách di các loài thuộc họ Limnocharitaceae (gồm
truyền giữa loài L. flava, H. nymphoides và L. flava và H. nymphoides) có mối quan hệ
B. latifolia so với các loài thuộc họ di truyền rất gần với họ Alismataceae.
Alismataceae còn thấp hơn khoảng cách Tương tự, Donald and Nicholas (2013) đã
giữa các loài trong họ Alismataceae với kết hợp 2 vùng gen lục lạp (matK và rbcL)
nhau, chẳng hạn, L. flava, H. nymphoides và nhân (nrITS) cũng cho thấy, các loài
và B. latifolia có khoảng cách di truyền so thuộc họ Limnocharitaceae xếp gọn bên
với loài Caldesia grandis lần lượt là 0,079 trong họ Alismataceae trên cây phát sinh
và 0,060 và 0.74. Trong khi đó, loài loài.
Limnophyton angolense có khoảng cách di
truyền so với Caldesia grandis lên đến KẾT LUẬN
0,087 (Bảng 2). Kết quả nghiên cứu đã giới thiệu 1 quy
Kết quả trên đây phù hợp với các nghiên trình tách chiết DNA nhanh và ít tốn chi
cứu gần đây về chỉ thị phân tử trên họ phí so với các phương pháp hiện tại. Ngoài
Alismataceae, các kết quả các nghiên cứu ra bằng dữ liệu phân tử, nghiên cứu này
cho thấy, loài L. flava (họ cũng góp phần xác định lại vị trí phân loại
Limnocharitaceae) luôn có mối quan hệ rất của họ Limnocharitaceae.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DONALD, H. L., & MARYKE, A. C. (1997). Phylogenentic studies in Alismatideae,
II: Evulution of Marine Angiosperms (Seagrasses) and Hydrophily. Systematic
Botany, 22(3), 443-463.
FAZEKAS, A. J., KUZMINA, L., NEWMASTER, S. G., & HOLLINGSWORTH, P.
M. (2012). DNA Barcoding methods for land plants. In: W.J. Kree, D.L. Erickson
(ed) DNA Barcodes: Method and Protocols. Meth. Mol. Biol, 858, 223-252.
PHẠM HOÀNG HỘ (2000). Cây cỏ Việt Nam, tập 3. NXB Trẻ.
VĂN HỒNG THIỆN, NGUYỄN PHIA NGÀ, LƯU HỒNG TRƯỜNG (2015).
Homalomena cochinchinensis (họ Araceae): Thử nghiệm marker phân tử và phân
tích một số thành phần hóa học. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(4A), 1329-1334.
80
nguon tai.lieu . vn
