1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản

Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản

Vibrio Cholerae là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua đường nước và thực phẩm. Việc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử, phương pháp PCR, là cần thiết nhằm đáp ứng nhanh cho công tác phát hiện sớm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, giúp phát hiện kịp thời bệnh tiêu chảy do Vibrio cholerae gây ra thông qua thực phẩm. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE TRONG

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 5

Ngày tạo 10/18/2019 12:16:44 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.48 M

Tên tệp

Tải Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR để phát h... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIBRIO CHOLERAE TRONG MẪU THỦY HẢI SẢN Nguyễn Đỗ Phúc* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Vibrio Cholerae là một trong những tác nhân gây bệnh tiêu chảy nguy hiểm lây truyền qua đường nước và thực phẩm. Việc xác định bằng kỹ thuật sinh học phân tử, phương pháp PCR, là cần thiết nhằm đáp ứng nhanh cho công tác phát hiện sớm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, giúp phát hiện kịp thời bệnh tiêu chảy do Vibrio cholerae gây ra thông qua thực phẩm. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR phát hiện Vibrio choleare trong thủy hải sản. Phương pháp: Khảo sát độ chọn lọc và độ đặc hiệu của phương pháp PCR. Đánh giá các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009). Kết quả: Giới hạn phát hiện 50% (LOD50) của phương pháp PCR trên các nền mẫu (nghêu: 1-3 CFU/25g, sò: 0-1 CFU/25g và hến: 4- 6 CFU/25g). Riêng mẫu hàu chưa đạt yêu cầu (>9 CFU/25g). Các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR: Độ chính xác (AC), độ đặc hiệu (SP), độ chọn lọc (SE) trên 3 nền mẫu nghêu, sò và hến với tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN) đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ISO/TS 16140 (2003) và NordVal (2009). Kết luận: Phương pháp PCR có thể ứng dụng để phát hiện Vibrio cholerae trong mẫu thủy hải sản với nền mẫu nghêu, sò và hến. Từ khóa: PCR, Vibrio cholerae, thủy hải sản ABSTRACT VALIDATION OF PCR METHOD FOR DETECTION OF VIBRIO CHOLERAE IN SEAFOOD Nguyen Do Phuc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 5 - 2016: 369 - 373 Background: Vibrio cholerae is one of the dangerous diarrheal pathogen transmitted through water and food. Applying a molecular method, polymerase chain reaction (PCR), is necessary for early detection of Vibrio cholerae infection through foods. Objectives: To assess validation of PCR method for detection of Vibrio cholera in seafood. Methods: Identify selectivity and validation of PCR method for detection of Vibrio cholerae in seafood with parameters: Limit detection 50 (LOD50), Sensitivity (SE), Specificity (SP), Accuracy (AC) False Positive (FP) and False Negative (FN) according to ISO/TS 16140 (2003) and NordVal (2009). Results: Limit of detection 50 (LOD50) were for clam (1-3 CFU/25 g), mussel (0-1 CFU/25g), baby clam (4- 6 CFU/25g), but oyster did not meet the requirement (>9 CFU/25g). Technical parameters: Accuracy (AC); Specificity (SP); Sensitivity (SE) False Positive (FP) and False Negative (FN) of PCR method on the three samples met the standard requirements. Conclusion: PCR is an applicable method for detection of Vibrio cholerae in seafood, especially in clam, mussel and baby clam. * Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đỗ Phúc ĐT: 0907669008 Email: nguyendophucihph@gmail.com Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 369
  2. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Key words: PCR, Vibrio cholerae, seafood. ĐẶT VẤN ĐỀ áp dụng tại nhiều phòng thí nghiệm như AOAC 988-20:2010, FDA (chương 9), TCVN 7905-1:2008 Bệnh tả là một bệnh truyền nhiễm cấp tính [ISO 21872-1:2007(E)]. Tuy nhiên, phương pháp đường tiêu hoá do phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) nuôi cấy đòi hỏi nhiều ngày, chưa đáp ứng gây nên. Bệnh thường biểu hiện với những triệu nhanh cho công tác tìm nguyên nhân tiêu chảy chứng lâm sàng đột ngột, nhanh và nặng. Nếu do tả. không được điều trị kịp thời sẽ dẫn tới tử vong PCR là phương pháp được lựa chọn để trong vài giờ và được xếp vào loại bệnh “cực kỳ phát hiện nhanh V. cholerae trên cơ sở phát nguy hiểm”. hiện đoạn gen ctxAB gây ra bệnh tả với thời Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới gian nhanh trong vòng 24 giờ. Để có cơ sở (WHO), hiện nay vẫn còn khoảng hơn 30 nước chứng minh được năng lực của phòng thí có bệnh tả đang lưu hành, chủ yếu là ở Châu Á nghiệm có thể áp dụng phương pháp PCR và Châu Phi. Mỗi năm ước tính trung bình có phát hiện V. cholerae hay không, việc xác nhận một triệu trường hợp mắc bệnh tả, số tử vong giá trị sử dụng phương pháp là yêu cầu bắt khoảng 200.000 ở Châu Phi và 100.000 ở Châu Á, buộc hiện nay theo ISO 17025. Do đó đề tài trong đó 1/3 là trẻ em dưới 5 tuổi và 1/4 là trẻ em tiến hành với các mục tiêu sau (1,3). từ 5-14 tuổi, số còn lại là người lớn (2). Mục tiêu nghiên cứu Ở Việt Nam, bệnh tả do V. cholerae O1 ElTor xuất hiện năm 1964, ước tính có hàng trăm Sử dụng chủng chuẩn Vibrio cholerae để kiểm ngàn người mắc bệnh. Dịch tả lưu hành chủ yếu chứng qui trình nuôi cấy theo TCVN 7905-1:2008 ở miền Nam, miền Trung, còn miền Bắc thì lẻ tẻ [ISO 21872-1:2007(E)] (4). do du nhập từ miền Nam ra. Từ những năm sau Đánh giá các thông số của phương pháp đó, vẫn có các ca lẻ tẻ xảy ra nhưng không bùng PCR phát hiện V. cholerae và nuôi cấy phát hiện phát thành dịch lớn. V. cholerae theo BAM-FDA, chương 28 so với Cuối năm 2007 và đầu năm 2008, dịch tả đã phương pháp nuôi cấy truyền thống theo TCVN quay trở lại nước ta và xuất hiện ở nhiều tỉnh 7905-1:2008 [ISO 21872-1:2007 (E)], gồm các thành trong cả nước. Những năm sau đó cho thông số sau: LOD50, Độ chọn lọc, Độ nhạy, Độ đến nay, hàng năm nước ta vẫn phải đối mặt với đặc hiệu, Tỷ lệ dương tính giả, Tỷ lệ âm tính giả các vụ dịch tả lẻ tẻ xuất hiện trên cả nước và xảy và Độ chính xác. ra ở nhiều tỉnh thành. Việc phòng và chống bệnh ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU tả trong nước luôn được tuyên truyền rộng rãi Đối tượng nghiên cứu trên các phương tiện thông tin đại chúng. Chủng vi khuẩn Gần đây các vụ dịch tả đã xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới. Việt Nam cũng là một quốc gia chịu Chủng chứng dương (chủng đích): ảnh hưởng lớn bởi dịch tả với nhiều vụ dịch đã Vibrio choleraee - Ogawa ATCC 17803; Inaba xảy ra đặc biệt là ở các vùng nông thôn và vùng ATCC 17804 sông nước. Do vậy việc giám sát dịch tễ học vi Chủng chứng âm (chủng không đích): khuẩn V. cholerae là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết nhằm phát hiện và xử lý dịch kịp thời. Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802, E. coli Việc áp dụng phương pháp nhanh và dễ áp ATCC 25923, Salmonella paratyphi ATCC 9150, dụng để phát hiện V.cholerae, đặc biệt là trong Shigella sonnei ATCC 9290, Proteus ATCC 17258, nước và thực phẩm là hết sức cần thiết. Phương Klebsiella ATCC 27489. pháp nuôi cấy truyền thống hiện nay đang được 370 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng
  3. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Thực phẩm Khảo sát độ nhạy tương đối (Se), độ đặc hiệu Nghêu, sò, hến và hàu. tương đối (Sp), độ chính xác tương đối (AC), tỷ lệ dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN). Trên Phương pháp nghiên cứu các nền mẫu: nghêu, sò và hến, mỗi nền mẫu Phương pháp PCR chọn 60 mẫu, trong đó 30 mẫu nhiễm chủng Theo FDA, chương 18 (5) Vibrio cholerae với mật độ vi khuẩn bằng Quy trình PCR: ly trích DNA bằng nhiệt 10xLOD50 và 30 mẫu không nhiễm chủng. Các 100 C/10 phút, làm lạnh ngay sau khi đun trong 0 mẫu được đánh số theo thứ tự, mù mẫu và cho một khay có đá trong 10 phút. Ly tâm 15.000 các kiểm nghiệm viên thực hiện trên một mẫu vòng/5 phút, hút 1µl dịch chiết DNA cho vào với cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy. Kết 24µl master mix PCR và khuếch đại DNA theo quả được tổng hợp và xử lý số liệu theo ISO/TS chu kỳ nhiệt. Chu kỳ nhiệt: biến tính ban đầu 16140 (2003) và NordVal (2009). 95oC/15 phút và lặp lại 35 chu kỳ: 95oC/1 phút, 55 Phương pháp nuôi cấy oC/1 phút, và kết thúc kéo dài 72oC/10 phút. Sản Theo TCVN 7905-1:2008 [ISO 21872- phẩm sau phản ứng PCR được điện di trên gel 1:2007(E)] (4) agarose 2,5% có bổ sung Gelred. Điện di trong 30 phút. Sau đó quan sát kết quả trên máy chụp KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN hình điện di bằng tia UV có bước sóng 312nm. Khảo sát tính chọn lọc của phương pháp Kết quả kích thước sản phẩm PCR là 777bp. multiplex- PCR Phương pháp khảo sát giá trị sử dụng phương Các chủng đích Vibrio cholera Ogawa và pháp Inaba tăng sinh trên peptone kiềm và các chủng Theo ISO/TS 16140 (2003) và NordVal không đích (Vibrio parahaemolyticus, E. coli, (2009) (1,3). Salmonella paratyphi, Shigella sonnei, Proteus, Khảo sát độ chọn lọc của phương pháp PCR Klebsiella) được tăng sinh trên canh thang BHI, ủ dùng cho phát hiện các gene ctx của Vibrio 37oC/24h. Chủng đích được trộn chung để sử cholerae bằng các chủng vi khuẩn không đích dụng làm chứng dương. Từ canh khuẩn này, tách chiết DNA và tiến hành thực hiện phản ứng Chủng Vibrio cholerae được tăng sinh trên PCR với chủng chứng dương, chứng âm là peptone kiềm và các chủng không đích khác Nuclease – free H2O và DNA của các chủng tăng sinh trên BHI ở 37oC/20 giờ sau đó tách không đích, sau đó tiến hành điện di. chiết DNA để thực hiện PCR. Kết quả điện di được trình bày trong hình 1, Khảo sát các thông số kỹ thuật của qui trình cho thấy duy nhất ở giếng với các chủng PCR chứng dương mới xuất hiện các vạch tương Giới hạn phát hiện (LOD50), mức chấp nhận ≤ ứng với kích thước của các gene ctx gây bệnh 9 CFU/25g thực phẩm: Chủng Vibrio cholerae của Vibrio cholerae, còn tất cả các giếng còn lại được tăng sinh trên peptone kiềm ở 37oC/20 giờ, (các vi khuẩn không đích) đều không xuất pha loãng chủng về các nồng độ để đạt yêu cầu hiện vạch đặc trưng với chứng dương. Điều ≤9 CFU/25 g mẫu thực phẩm và gây nhiễm vào đó thể hiện khả năng đặc hiệu của phương các nền mẫu và tăng sinh trên peptone kiềm pháp PCR đối với các gene ctx cho Vibrio (khoảng 3 nồng độ, các nồng độ pha loãng được choleare. xác nhận số vi khuẩn thực tế được kiểm tra trên Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương TSA 1% muối). Ủ ở 37oC/20 giờ, tách chiết DNA pháp PCR: giới hạn phát hiện, độ nhạy tương và chạy PCR. đối, độ chính xác tương đối, độ đặc hiệu tương Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 371
  4. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 đối, tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả theo nghiệm 1 lần; còn 3 mức nhiễm khác La1, La2, La3 ISO/TS 16140 (2003). được thực hiện 6 lần. Kết quả PCR được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1: Giới hạn phát hiện của phương pháp PCR trên các nền mẫu Nền mẫu Vibrio cholerae Ogawa Vibrio cholerae Inaba Nghêu 1-3 CFU/25g 1-3 CFU/25g Sò 0-1 CFU/25g 0-1 CFU/25g Hến 4-6 CFU/25g 4-6 CFU/25g Hàu > 9 CFU/25g > 9 CFU/25g Các mẫu nghêu, sò và hến đạt yêu cầu về giới hạn phát hiện. Riêng mẫu hàu LOD50 là: > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 CFU/25g vẫn chưa đáp ứng được về giới hạn Hình 1: Kết quả khảo sát tính chọn lọc của phương phát hiện theo ISO/TS 16140 (2003). Do đó pháp PCR mẫu hàu không tiếp tục khảo sát các thông số Chú thích: Giếng 10. MK: Thang DNA chuẩn 100bp; 9, (-): tiếp theo. chứng âm; 8. (+): Chứng dương V. cholerae Inaba (777bp); Xác định độ đúng (accuracy-AC), độ đặc 7. (+): Chứng dương V. cholerae Ogawa; 6: Salmonella; 5: hiệu (specificity-SP), độ nhạy (sensitivity- Shigella; 4: Klebsiella, 3: E. coli; 2: Proteus, 1: Vibrio paraheamolyticus SE) theo ISO/TS 16140 (2003) Tiến hành thử nghiệm với 60 mẫu đối với Giới hạn phát hiện (LOD50) mỗi nền mẫu (nghêu, sò và hến), trong đó 30 Khảo sát giới hạn phát hiện của phương mẫu được gây nhiễm với nồng độ 10xLOD50 và pháp PCR bằng việc sử dụng các chủng đích với 30 mẫu không gây nhiễm. Sau khi gây nhiễm, 5 mức gây nhiễm khác nhau: Lo- Không gây tăng sinh trong pepton kiềm, tiến hành thực hiện nhiễm; La1, La2, La3- có mức nhiễm dưới 10 phản ứng multiplex-PCR, và thu được kết quả CFU/25g và mức nhiễm L50 với khoảng 10-50 theo bảng 2. Từ kết quả ở bảng 2, tiến hành tính CFU/25g. Các mức gây nhiễm này được nhiễm toán và thu được các giá trị thông số của phương vào các nền mẫu thực phẩm (nghêu, sò, hến và pháp PCR (bảng 3). hàu) được tăng sinh trong canh thang peptone kiềm, ủ 37oC/20h. Tiến hành thử nghiệm phản ứng PCR, với mức nhiễm Lo và L50 được thử Bảng 2: Kết quả xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Kết quả phương pháp nuôi cấy (TCVN 7905-1:2008) Kết quả của phương pháp Nghêu Sò Hến PCR(FDA-Chương 18) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) Âm tính (-) Dương tính (+) 28/29 1/30 28/30 0/30 27/29 2/30 Âm tính (-) 1/29 29/30 2/30 30/30 2/29 28/30 Bảng 3: Kết quả xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên 3 nền mẫu khảo sát Tỷ lệ âm tính giả ND Tỷ lệ dương tính giả Độ chính xác tương Độ nhạy tương đối Độ đặc hiệu tương Nền mẫu (%) PD (%) đối AC (%) SE (%) đối SP (%) Nghêu 3,45 3,33 96,6 96,55 96,67 Sò 6,67 0 96,67 93,33 100 Hến 6,9 6,67 93,22 93,1 93,33 Tiêu chí ≤ 10 ≤ 10 ≥ 90% ≥ 90% ≥ 90% 372 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng
  5. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 5 * 2016 Nghiên cứu Y học Giá trị sử dụng phương pháp PCR phát hiện các giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên 3 Vibrio cholerae với các thông số: độ chính xác nền mẫu (nghêu, sò và hến) đều đạt theo qui (AC), độ đặc hiệu (SP), độ chính xác (SE), tỷ lệ định ISO/TS 16140 (2003). dương tính giả (FP) và tỷ lệ âm tính giả (FN) đều Áp dụng phương pháp PCR phát hiện Vibrio đạt theo qui định ISO/TS 16140 (2003) trên 3 nền cholerae để khảo sát tiếp tục trên các nền mẫu hải mẫu nghêu, sò và hến. sản để có số liệu thực tế. KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. International Standard (2003). ISO/TS 16140- Microbiology of Tính chọn lọc của phương pháp PCR bằng food and animal feeding stuffs –Protocol for the validation of các chủng không đích: Phương pháp PCR đặc alternative methods, pp. 1-64. hiệu đối với gene ctx của Vibrio choleare. 2. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention (2004) - Detection of Giới hạn phát hiện (LOD50) của phương Cholera Toxin, pp. 64-88. pháp PCR trên các nền mẫu (nghêu, sò và hến): 3. NordVal (2009). Protocol for validation of alternative microbiological methods, pp 1-16. Nghêu: vào khoảng 0-3 CFU/25g. 4. TCVN 7905-1(2008) [ISO 21872-1:2007(E)]. Phương pháp phát hiện Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus, trang 1-13. Sò: vào khoảng 0-1 CFU/25g. 5. Walter HK, William LP, Thomas AC (2001). Chapter 28: Hến: vào khoảng 4-6 CFU/25g. Detection of Enterotoxigenic Vibrio cholerae in Foods by the Polymerase Chain Reaction. Bacteriological Analytical Manual, Mẫu hàu không đạt được LOD50 theo quy FDA, pp 1-6. định: tiếp tục nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng của nền mẫu hàu lên phản ứng PCR. Ngày nhận bài báo: 22/4/2016 Giá trị sử dụng của phương pháp PCR trên Ngày phản biện nhận xét bài báo: 19/7/2016 các nền mẫu nghêu, sò và hến đều đạt các tiêu Ngày bài báo được đăng: 05/10/2016 chí về độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả.Kết quả của Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 373
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng