Xem mẫu
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP TRONG CHẨN ĐOÁN TEMBUSU VIRUS
TRÊN VỊT Ở HÀ NỘI
Mai Thị Ngân1*, Đặng Hữu Anh1, Nguyễn Văn Giáp1,
Phạm Thị Lan Hương1, Phan Thị Hạnh1, Lê Khắc Duy1,
Nguyễn Hữu Huân1,2, Huỳnh Thị Mỹ Lệ1 và Wataru Yamazaki3
Tóm tắt
Gần đây, nhiều địa phương đã xuất hiện vịt có biểu hiện nghi ngờ do Tembusu virus gây ra như giảm đẻ đột ngột,
bại liệt, tiêu chảy. Nghiên cứu mới nhất đã phát hiện sự có mặt của Tembusu virus ở đàn vịt bệnh tại Hà Nội bằng
phương pháp PCR. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu máy luân nhiệt với độ chính xác cao mà ít được trang
bị trong các phòng thí nghiệm nhỏ tại Việt Nam. Do vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng phương pháp
RT-LAMP cho chẩn đoán nhanh Tembusu virus. Việc bổ sung thêm enzym sao chép ngược trong thành phần phản
ứng RT-LAMP có thể khuếch đại trực tiếp khuôn mẫu là RNA với hiệu quả cao mà không cần quá trình phiên
mã ngược. Đồng thời, sử dụng thêm cặp mồi vòng lặp đã làm tăng tốc độ phản ứng. Hơn nữa với chỉ thị màu, kết
quả của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường. Xét nghiệm 32 mẫu thực địa đối chiếu với RT-PCR cho thấy,
RT-LAMP là một phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và kết quả có thể dễ
dàng quan sát bằng mắt thường. Do đó, kết quả nghiên cứu của chúng tôi có tính ứng dụng cao trong công tác chẩn
đoán nhanh Tembusu virus cũng như các tác nhân gây bệnh khác.
Từ khóa: Mồi vòng lặp, RT-LAMP, RT-PCR, TMUV.
APPLICATION OF RT-LAMP METHOD FOR THE DETECTION OF TEMBUSU
VIRUS IN DUCKS IN HANOI
Abstract
Recently, some farms have ducks with suspected symptoms caused by the Tembusu virus (TMUV) such as
decreased egg production, paralysis, diarrhea. A recent study has shown the presence of the TMUV in infected
ducks in Hanoi by the reversed transcription polymerase chain reaction (RT- PCR) method. However, this method
requires high-precision thermal cyclers that are not equipped in small laboratories in Vietnam. Therefore, in this
study, we introduce the reversed transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method for
the rapid diagnosis of the Tembusu virus. Adding reverse transcriptase enzyme in the reaction components of
RT-LAMP can directly amplify the RNA template with high efficiency without reverse transcription process. In
addition, using loop primers increased the reaction speed. Furthermore, with the color indicator, the results of
the reaction can be observed with the naked eye. In comparison with RT-PCR, results of testing 32 field samples
showed that RT-LAMP is a fast, simple diagnostic method with high sensitivity and specificity and the results can
be easily observed with the naked eye. Therefore, our research results are highly applicable to the rapid detection
of the TMUV as well as other pathogens.
Keywords: Loop primers, RT-LAMP, RT-PCR, TMUV.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Tembusu virus (TMUV), thuộc chi lần đầu tiên vào năm 1955 ở loài muỗi Culex
Flavivirus, họ Flaviviridae được phân lập tritaeniorhynchus tại Malaysia, là một ARN
1
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam;
2
Công ty Cổ phần thuốc thú y Trung ương Navetco;
3
Trung tâm Nghiên cứu Đông Nam Á, Đại học Kyoto, Nhật Bản;
*
Tác giả liên hệ: Mai Thị Ngân; Email: mtngan@vnua.edu.vn; ĐT: 0988922656
149
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
virus có độ dài khoảng 11 kilobases với một tính cho quá trình khuếch đại (Nagamine và
khung đọc mở (ORF) duy nhất mã hóa cho cs., 2001). Đặc biệt khi kết hợp với enzyme
3 protein cấu trúc cùng với 7 protein không sao chép ngược, LAMP cũng có thể khuếch
cấu trúc (Zhang và cs., 2017). Virus không đại trực tiếp chuỗi RNA với hiệu quả cao mà
chỉ tác động đến vịt đẻ mà còn có thể lây không cần quá trình phiên mã (Whiting và
nhiễm cho vịt thịt, gà, ngỗng và chuột (Sun Champoux, 1998). Khuếch đại và phát hiện
và cs., 2019). TMUV là nhóm virus truyền gene có thể được hoàn thành chỉ trong 1 bước
lây thông qua muỗi, đe dọa cả chăn nuôi gia đơn giản bằng cách ủ hỗn hợp phản ứng ở
cầm và sức khỏe cộng đồng. Hiện tại người ta nhiệt độ cố định khoảng 600C đến 65°C. Vì
đã phát hiện ra TMUV có thể truyền lây theo thế, LAMP có thể được thực hiện bằng cách
những đường khác mà không cần thông qua sử dụng tủ ấm hay bể ủ nhiệt mà các thiết
véc-tơ truyền bệnh (Yan và cs., 2018). Chăn bị này đươc trang bị ở hầu hết các phòng thí
nuôi vịt tại Việt Nam đang phát triển mạnh nghiệm nhỏ tại Việt Nam. Mặc dù, LAMP
tuy nhiên hiện tại lịch tiêm phòng vắc-xin đã được phát triển và ứng dụng trong chẩn
cho đàn vịt nuôi chỉ tập trung vào bệnh viêm đoán một số bệnh như tiêu chảy cấp ở lợn, hội
gan vịt, dịch tả vịt và cúm gia cầm. Thời gian chứng rối loạn hô hấp và sinh sản, bệnh do
gần đây ở nhiều địa phương đã xuất hiện vịt Salmonella,… (Mai Thị Ngân và cs., 2021;
có biểu hiện bệnh nghi ngờ do TMUV gây Phạm Minh Hằng và cs., 2020). Tuy nhiên,
ra như tỷ lệ đẻ giảm mạnh đột ngột, bại liệt, các nghiên cứu ứng dụng LAMP trong chẩn
và buồng trứng xuất huyết. Nghiên cứu của đoán bệnh do virus, vi khuẩn gây ra tại Việt
Đặng Hữu Anh và cs. (2020) đã chỉ ra sự có Nam vẫn còn hạn chế. Do vậy trong nghiên
mặt của TMUV gây bệnh ở đàn vịt tại khu cứu này chúng tôi đề cập đến việc ứng dụng
vực Hà Nội bằng phương pháp khuếch đại phương pháp LAMP trong chẩn đoán nhanh
nucleic acid RT-PCR (Đặng Hữu Anh và cs., TMUV.
2020).
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Khuếch đại nucleic acid được ứng dụng
NGHIÊN CỨU
rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh học như
nhận biết các đặc điểm di truyền, phát hiện 2.1. Vật liệu
các bệnh di truyền hay chẩn đoán bệnh truyền - Mẫu bệnh phẩm được lấy từ vịt bị bệnh
nhiễm (Moore, 2005). PCR là phương pháp bao gồm: não, tim, phổi, gan, lách, buồng trứng
khuếch đại DNA được sử dụng rộng rãi nhất được thu thập từ các đàn vịt nghi nhiễm TMUV
thông qua quá trình luân nhiệt làm biến tính tại các tỉnh Bắc Ninh, Hà Nội, Hưng Yên.
sợi đôi DNA tạo khuôn cho quá trình sinh
- Hóa chất dùng tách và tinh sạch ARN
tổng hợp DNA. Tuy nhiên, phương pháp này
tổng số gồm: TRIzol reagent (Invitrogen,
đòi hỏi một máy luân nhiệt với độ chính xác
Thermo Fischer Scientific, USA); chloroform
cao, mà hầu như không được trang bị trong
(Merck KGaA, Darmstadt, Germany);
các phòng thí nghiệm nhỏ tại Việt Nam. Gần
2-Propanol (Merck KGaA, Darmstadt,
đây, với sự phát triển trong sinh học phân tử
Germany); cồn 70%; nước cất đã xử lý
đã chứng minh khả năng khuếch đại ADN
bằng 0,1% diethylpyrocarbonate (iNtRON
trong điều kiện đẳng nhiệt mà không cần thiết
Biotechnology, Inc. Burlington, MA, USA).
bị luân nhiệt. LAMP (Loop-mediated Isother-
mal Amplification) là phương pháp khuếch - Tổng hợp cDNA được thực hiện
đại nucleic acid đẳng nhiệt thông qua cấu trúc bằng: random hexamers (Invitrogen, Thermo
vòng lặp đặc hiệu, đơn giản, nhanh chóng và Fischer Scientific, USA) và kit M-MLV
tiết kiệm; phương pháp này đã được mô tả Reverse Transcriptase (Invitrogen, Thermo
lần đầu tiên vào năm 2000 (Notomi và cs., Fischer Scientific, USA)
2000). Một trong những ưu điểm của LAMP - Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản
là không yêu cầu khuôn mẫu là DNA biến ứng PCR: 2X PCR Master mix solution (iN-
150
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
tRON Biotechnology, Inc. Burlington, MA, nghiên cứu đã công bố (Liu và cs., 2012), với
USA); cặp mồi từ gen NS5 của virus theo thông tin ở Bảng 1.
Bảng 1. Trình tự mồi dùng cho phản ứng RT- PCR
Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’) Kích thước (bp)
NS5-F TTTGGTACATGTGGCTCG
350
NS5-R ACTGTTTTCCCATCACGTCC
- Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản hydroxynaphthol blue - HNB (Wako Pure
ứng RT-LAMP: Tris-HCl (Wako Pure Chemicals, Missouri, USA), GelGreen
Chemicals, Missouri, USA), KCl, Betaine (10.000X Sol, Biotium, Fremont, California,
và (NH4)2SO4 (Sigma - Aldrich, Missouri, USA); mồi dùng cho quá trình khuếch đại
USA), MgSO4 (New England Biolabs, RNA của TMUV theo các nghiên cứu
Massachusetts, USA), Bst DNA polymerase đã công bố (Tang và cs., 2016; Yan và cs.,
(New England Biolabs, Massachusetts, 2012). Trình tự nucleotide của các cặp mồi
USA), enzyme sao chép ngược AMV Reverse được liệt kê trong Bảng 2.
Transcriptase (Invitrogen, California, USA),
Bảng 2. Trình tự nucleotide của các cặp mồi LAMP để chẩn đoán TMUV
Nguồn tham
Tên mồi Trình tự nucleotide (5′ to 3′) Ví trí
khảo
F3 GGGAGCATACAGACATGTGC 331 - 350
B3 CCTCCATCTCAGCGGTGTA 526 - 544
FLP TGGACGTTTTCCTTCTGCAC 388 - 407
BLP AAACATGCCGCCAGATTCGTT 484 - 504
(Tang và cs.,
FIP CTCGCTTCCGTGGAACCATGTA- 428 - 449 2016)
(F1c-F2) AGAAAGCAGAAGGCAGGAT 368 - 386
BIP TATTCAGCCCAGCAGTCGCTG- 463 - 483
(B1c-B2) CGGGACTTTTGGGCGTTA 506 - 523
F3 CCACGAGCTGCAAATGAAAG 9.808 - 9.827
B3 GGCGTTTGCCATTAGTCTGA 9.984 - 10.003
FIP AGACCCTGGAGAGAGCCTGG- 9.882 - 9.901
(Yan và cs.,
(F1c-F2) TTGTGGTTCCATGTCGAGAC 9.840 - 9.859 2012)
BIP ACAGAAACAGCATGCCTGAGCA- 9.914 - 9.935
(B1c-B2) GTCCCTCCTGTGGAAGTACA 9.963 - 9.982
2.2. Phương pháp nghiên cứu ARN bằng 1ml cồn 75%. Các bước từ (ii) đến
2.2.1. Phương pháp chiết tách ARN tổng số (iv) được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10
phút ở 4oC. Hòa tan tủa ARN bằng 30 µl nước
ARN tổng số được tách bằng TRIzol
(đã xử lý Dnase/Rnase) và bảo quản ở -80oC.
reagent (theo hướng dẫn của nhà sản xuất),
Nồng độ ARN tổng số được đo bằng máy
với các bước sau: (i) thêm 750 µl TRIzol vào
quang phổ NanoDrop 8000 (Thermo Fisher
250 µl huyễn dịch mẫu 10% để giải phóng
Scientific, Waltham, Wilmington, USA).
ARN, vortex để đồng nhất; (ii) tách pha ARN
bằng 200 µl chloroform, vortex để đồng nhất; 2.2.2. Phương pháp RT-PCR
(iii) tủa ARN thu được ở bước (ii) bằng 500 µl ARN tổng số được chuyển thành
2-propanol, giữ ở -20oC/10 phút; (iv) rửa tủa cDNA bằng random hexamers, sử dụng bộ kit
151
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
M-MLV Reverse Transcriptase với các thành 2.2.3. Phương pháp RT-LAMP
phần được phối trộn theo hướng dẫn của nhà Thành phần trong 25 µl của phản ứng
sản xuất. Phản ứng tổng hợp cDNA được thực RT-LAMP được liệt kê trong bảng 3. Hỗn
hiện ở 37oC trong 60 phút.
hợp phản ứng được ủ bằng bể ổn nhiệt ở 63oC
Phản ứng PCR phát hiện Tembusu trong 60 phút sau đó tăng lên 80oC trong
virus được thực hiện bằng cặp mồi NS5f/
5 phút để dừng phản ứng. Kết quả của phản
NS5r, theo quy trình đã công bố trước đây
(Liu và cs, 2012). Phân tích sản phẩm PCR ứng RT-LAMP được đánh giá trực tiếp bằng
bằng điện di trong thạch agarose 2% có bổ mắt thường thông qua sự đổi màu của chỉ thị
sung thuốc nhuộm ADN (RedSafe) 1x. có trong thành phần của phản ứng.
Bảng 3. Thành phần phản ứng RT-LAMP
Nồng độ trong 25 µl Thể tích
Thành phần Nồng độ gốc Loại hóa chất
thể tích phản ứng (µl)
KCl 1M 10mM
(NH4)2SO4 1M 10mM
Tris - HCl (pH= 8,8) 1M 20mM 10X hỗn hợp
dung dịch 12,5
MgSO4 100mM 4mM đệm
Betain 5M 1M
dNTP 100mM 1.6mM
FIP/BIP 100mM 1.6 µM
10X hỗn hợp
F3/B3 100mM 0.2 µM 1,3
mồi
LF/LB 100mM 0.8 µM
Bst polymerase 2.0 8u/ µl 8u
10X hỗn hợp
AMV Reverse 1
15u/µl 0.15 u enzym
Transcriptase
HNB 100mM 3mM 10X chỉ thị
1
GelGreen 10.000x 0,35% màu
H2O 7,2
RNA 2
Bên cạnh đó, phản ứng được thực hiện < 0,4: mức độ đồng thuận yếu.
bằng hệ thống real time PCR LightCycler 96, 0,4 - 0,6: mức độ đồng thuận trung bình.
(Roche, Thụy Sỹ) để so sánh thời gian khuếch
0,61 - 0,8: mức độ đồng thuận tốt.
đại thực của các cặp mồi khác nhau. Chu kỳ
nhiệt cho RT-LAMP tiến hành như sau: 60 > 0,8: mức độ đồng thuận rất tốt.
chu kỳ ở 63oC trong 30 giây và 63oC trong 30 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
giây. Các tín hiệu huỳnh quang được thu thập
3.1. Phương pháp RT-LAMP kết hợp chỉ
ở cuối mỗi chu kỳ. Sử dụng kênh FAM để đo
tín hiệu huỳnh quang. thị màu trong chẩn đoán Tembusu virus
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Trong nghiên cứu này chúng tôi sử
Để so sánh hiệu quả giữa hai phương dụng enzym Bst DNA polymerase cho phản
pháp RT-PCR và RT-LAMP, hệ số Kappa đã ứng LAMP và enzym này hoạt động tốt trong
được sử dụng để đánh giá mức độ đồng thuận khoảng nhiệt độ từ 60 đến 65oC, bị bất hoạt ở
giữa hai phương pháp này trong chẩn đoán 80oC. Do đó, nhiệt độ chúng tôi lựa chọn cho
bệnh. Giá trị của hệ số Kappa dao động từ 0 phản ứng RT-LAMP trong nghiên cứu này là
đến 1 và được phân loại như sau: 63oC như đã được sử dụng trong nghiên cứu
152
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
trước (Tang và cs., 2016). Phản ứng được thực thay đổi màu của chỉ thị màu kim loại HNB,
hiện trong bể ổn nhiệt ở 63oC trong 60 phút, sau phản ứng ống chuyển màu xanh lam là
sau đó tăng lên 80oC trong 5 phút để dừng phản ứng dương tính do nồng độ Mg2+ giảm
phản ứng Kết quả được đánh giá trực tiếp trong quá trình khuếch đại, phản ứng âm tính
bằng mắt thông qua sự đổi màu của chỉ thị là vẫn giữ nguyên màu tím của HNB giống
màu kim loại HNB có trong thành phần của như trước phản ứng (Hình 1A). Sự thay đổi
phản ứng như đã được miêu tả trong nghiên màu sắc có thể thấy rõ bằng mắt thường. Việc
cứu trước đây (Mai Thị Ngân và cs., 2021; bổ sung HNB vào dung dịch LAMP trước
Mai và cs., 2020). Kết quả của phương pháp phản ứng đã được chứng minh là không làm
RT-LAMP (Hình 1B) cho kết quả giống với ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại, giúp
phương pháp RT-PCR (Hình 1C). Bằng sự giảm nguy cơ gây tạp nhiễm.
A. Phương pháp RT-LAMP (trước B. Phương pháp RT-LAMP (sau C. Phương pháp RT-PCR
phản ứng) phản ứng)
Các giếng theo thứ tự từ trái
Các giếng theo thứ tự từ trái sang Các giếng theo thứ tự từ trái sang sang phải: Marker, đối chứng
phải: đối chứng dương và đối phải: đối chứng dương và đối dương và đối chứng âm của
chứng âm của TMUV chứng âm của TMUV TMUV
Hình 1. Kết quả chẩn đoán TMUV
Enzym DNA polymerase có hoạt tính mồi phía ngoài (F3 và B3) đều được sử dụng,
thay thế mạch, tự thay thế và giải phóng DNA nhưng sau khi đã hình thành cấu trúc vòng
mạch đơn. Vì vậy, ưu điểm của phương pháp lặp thì chỉ cặp mồi phía trong được sử dụng
LAMP là không cấn biến tính nhiệt đoạn để tổng hợp DNA (Notomi và cs, 2000). Do
DNA mạch đôi thành mạch đơn (Nagamine vậy, nồng độ mồi của hai cặp mồi phía ngoài
và cs, 2001). Bên cạnh đó thông qua hoạt là thấp (Bảng 3).
tính của enzyme sao chép ngược, cDNA được
3.2. RT-LAMP BAO GỒM CẶP MỒI
tổng hợp trực tiếp từ RNA từ đầu 3’ bắt đầu
bởi hoạt động của mồi BIP mà không cần quá VÒNG LẶP
trình phiên mã như phương pháp RT-PCR Nghiên cứu của Nagamine và cs, 2002
(Whiting và Champoux, 1998). Vì đoạn bổ cho thấy việc bổ sung thêm cặp mồi vòng lặp
sung gắn FIP (F1c-F2) thay thế có chứa các (LF và LB) vào thành phần phản ứng đã làm
trình tự bổ sung ở cả hai đầu nên tự tạo thành tăng tốc độ phản ứng LAMP. Vị trí của mồi
cấu trúc vòng lặp ở mỗi đầu - cấu trúc quả tạ. vòng lặp là vùng giữa F2 và F1 (hoặc B1 và
Đây là cấu trúc khởi đầu cho vòng khuếch B2) theo hướng F1 đến F2 (hoặc B1 đến B2)
đại trong phương pháp LAMP. Cấu trúc này (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.
nhanh chóng chuyển thành DNA mạch vòng html). Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi
do tổng hợp DNA tự mồi. Trong các bước ban đã sử dụng hai bộ mồi khác nhau, bộ mồi 1
đầu của phản ứng LAMP, tất cả bốn mồi bao bao gồm cặp mồi vòng lặp, bộ mồi 2 không
gồm cặp mồi phía trong (FIP và BIP) và cặp bao gồm cặp mồi vòng lặp. Quá trình khuếch
153
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
đại thực bộ gen của TMUV được thực hiện nhuộm DNA là GelGreen có trong chỉ thị
bằng hệ thống real time PCR LightCycler 96 màu thành phần của phản ứng (Bảng 3). Kết
với tín hiệu huỳnh quang (Flourescence) thu quả được thể hiện ở hình 2.
được từ kênh FAM với sự có mặt của thuốc
Hình 2. Quá trình khuếch đại của RT-LAMP TMUV có cặp mồi vòng lặp
Việc bổ sung cặp mồi vòng lặp đã làm 32 mẫu bệnh phẩm bằng cả hai phản ứng RT-
tăng số lượng điểm khởi đầu cho quá trình PCR và RT-LAMP để chẩn đoán sự có mặt
tổng hợp DNA trong phản ứng LAMP. Với của TMUV. Kết quả chẩn đoán TMUV từ các
phương pháp LAMP không có vòng lặp, bốn mẫu thực địa được trình bày ở Bảng 4.
trong 6 vòng được tạo ra sẽ không được sử Kết quả Bảng 4 cho thấy có 4 mẫu dương
dụng. Nhưng thông qua việc sử dụng cặp mồi
tính với TMUV bằng phương pháp RT-PCR
vòng lặp, tất cả các vòng lặp đều có thể được
đều cho kết quả dương tính với RT-LAMP, 28
sử dụng làm điểm khởi đầu cho quá trình
mẫu âm tính với TMUV bằng RT-PCR cũng
tổng hợp DNA. Trong phản ứng RT-LAMP
với khuôn mẫu là RNA của TMUV, quá trình cho kết quả âm tính bằng phương pháp RT-
khuếch đại của bộ mồi không có cặp mồi LAMP. Hệ số Kappa là 1,0 cho thấy mức độ
vòng lặp là ở 37 phút (đường khuếch đại màu đồng thuận giữa hai phương pháp là rất cao.
xám), và của bộ mồi có thêm cặp mồi vòng RT-LAMP sử dụng 4 hoặc 6 mồi khác
lặp là 19 phút (đường khuếch đại màu xanh) nhau được thiết kế đặc biệt nhận ra 6 đến 8
(Hình 2). Như vậy, phương pháp LAMP sử đoạn riêng biệt trên gen đích (Notomi và cs.,
dụng 6 mồi (có cặp mồi vòng lặp) thời gian 2000; Nagamine và cs., 2002; Nagamine và
phản ứng giảm đi gần một nửa so với phương cs., 2001) nên tính đặc hiệu là rất cao. Bên
pháp LAMP 4 mồi (không có mồi vòng lặp). cạnh đó, hiệu quả khuếch đại cao, với lượng
Do đó, chúng tôi đã sử dụng bộ mồi có thêm ADN được khuếch đại đến 109 lần trong vòng
cặp mồi vòng lặp để làm tăng tốc độ khuếch một giờ (Nagamine và cs., 2002), có thể gây
đại của phản ứng RT-LAMP. Điều này sẽ giúp ra tạp nhiễm khi thực hiện điện di để kiểm tra
cho quá trình chẩn đoán nhanh tác nhân gây
sản phẩm khuếch đại. Việc bổ sụng thêm chỉ
bệnh, hỗ trợ cho công tác phòng chống bệnh
thị màu (gồm HNB và GelGreen) giúp cho
có hiệu quả.
quá trình đọc kết quả phản ứng trực tiếp bằng
3.3. Chẩn đoán TMUV từ các mẫu thực địa mắt thường hoặc bằng đèn tím, hạn chế sự tạp
Để kiểm tra hiệu quả của phương pháp nhiễm gây ra do quá trình điện di. Hơn nữa
RT-LAMP, chúng tôi đã tiến hành xét nghiệm GelGreen là một thuốc nhuộm DNA huỳnh
154
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
quang màu xanh lá cây nhạy hơn nhiều so đèn LED (Mai Thị Ngân và cs., 2021). Kết
với các loại thuốc nhuộm DNA khác, an toàn quả của chúng tôi cho thấy, phương pháp RT-
với môi trường, dễ sử dụng, tín hiệu huỳnh LAMP có thể được ứng dụng rộng rãi để chẩn
quang có thể quan sát dưới đèn cực tím hoặc đoán nhanh sự có mặt của TMUV.
Bảng 4. Kết quả chẩn đoán TMUV từ các mẫu thực địa
RT-PCR
Dương tính Âm tính Tổng
RT-LAMP
Dương tính 0 4
4
Âm tính 0 28 28
Tổng 4 28 32
Hệ số Kappa: 1,0
4. KẾT LUẬN Satoshi Sekiguchi (2021). Phát triển
phương pháp LAMP kết hợp sử dụng chỉ
Việc sử dụng thêm cặp mồi vòng lặp thị màu kép trong chẩn đoán phát hiện
(LF và LB) đã làm tăng điểm khởi đầu giúp virus gây tiêu chảy cấp ở lợn. Tạp chí
tăng tốc độ phản ứng khuếch đại của phương KHKT Thú y, Tập XXVIII, số 1.
pháp RT-LAMP. Đồng thời với việc bổ sung
Liu, M., S. Chen, Y. Chen, C. Liu, S. Chen, X.
thêm chỉ thị màu vào thành phần phản ứng
Yin, G. Li and Y. Zhang (2012). Adapted
RT-LAMP trước khi khuếch đại giúp cho
Tembusu-like virus in chickens and geese
việc đọc kết quả trực tiếp bằng mắt thường.
in China. J Clin Microbiol. 50(8):2807-
Phương pháp RT-LAMP cho kết quả chẩn
2809.
đoán TMUV với mức độ đồng thuận là rất
cao với phương pháp RT-PCR từ các mẫu Moore, P. (2005). PCR: replicating success.
thực địa. Như vậy, RT-LAMP có thể được ứng Nature, 435(7039):235-238.
dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm nhỏ Notomi, T., H. Okayama, H. Masubuchi, T.
ít được trang bị với các ưu việt như nhanh, Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino and T.
đơn giản và chính xác trong chẩn đoán nhanh Hase (2000). Loop-mediated isothermal
TMUV. amplification of DNA. Nucleic Acids
Res. 28(12):E63.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tang, Yi, Hao Chen and Youxiang Diao
Đặng Hữu Anh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn (2016). Advanced uracil DNA
Văn Giáp (2020). Một số kết quả nghiên glycosylase-supplemented real-time
cứu bước đầu về Tembusu virus ở vịt reverse transcription loop-mediated
bệnh tại Hà Nội Tạp chí KHKT Thú y, isothermal amplification (UDG-rRT-
Tập XXVII, số 1. LAMP) method for universal and specific
Phạm Minh Hằng, Phan Thanh Hương, detection of Tembusu virus. Scientific
Phạm Thị Thu Thúy và Nguyễn Viết reports. 6:27605-27605.
Không (2020). Phát triển và đánh giá Whiting, S. H. and J. J. Champoux (1998).
kỹ thuật LAMP trong phát hiện virus Properties of strand displacement
PRRS,CSF,PED và PCV2. Tạp chí khoa synthesis by Moloney murine leukemia
học kỹ thuật Thú y, Tập XXVII, số 1. virus reverse transcriptase: mechanistic
Mai Thị Ngân, Nguyễn Văn Giáp, Cao Thị implications. J Mol Biol, 278(3):
Bích Phượng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và 559-577.
155
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 149-156
Yan, D., Y. Shi, H. Wang, G. Li, X. Li, B. Nagamine, K., T. Hase and T. Notomi (2002).
Wang, X. Su, J. Wang, Q. Teng, J. Yang, Accelerated reaction by loop-mediated
H. Chen, Q. Liu, W. Ma and Z. Li (2018). isothermal amplification using loop
A Single Mutation at Position 156 in the primers. Molecular and Cellular Probes.
Envelope Protein of Tembusu Virus Is 16(3):223-229.
Responsible for Virus Tissue Tropism Nagamine, K., K. Watanabe, K. Ohtsuka,
and Transmissibility in Ducks. J Virol. T. Hase and T. Notomi (2001). Loop-
92(17). mediated isothermal amplification
Yan, L., S. Peng, P. Yan, J. Zhou, Q. Teng, G. reaction using a nondenatured template.
Li, X. Li and Z. Li (2012). Comparison Clinical Chemistry. 47(9):1742-1743.
of real-time reverse transcription loop- Sun, Xuejing, Enxue Liu, Adeela Iqbal,
mediated isothermal amplification Taozhi Wang, Xindong Wang, Abdul
and real-time reverse transcription Haseeb, Nisar Ahmed, Ping Yang and
polymerase chain reaction for duck Qiusheng Chen (2019). The dynamic
Tembusu virus. J Virol Methods. 182(1- distribution of duck Tembusu virus in
2):50-55. the spleen of infected shelducks. BMC
Mai, TN., Yamazaki W, Bui TP, Nguyen veterinary research. 15(1):112.
VG, Huynh TML, Mitoma S, Hala ED, Zhang, Wei, Shun Chen, Suresh Mahalingam,
Emmanuel Kabali, Norimine J and Mingshu Wang and Anchun Cheng
Sekiguchi S. (2020). A descriptive survey (2017). An updated review of avian-
of porcine epidemic diarrhea in pig origin Tembusu virus: a newly emerging
populations in northern Vietnam. Trop avian Flavivirus. Journal of General
Anim Health Prod. 52(6): 3781-3788. Virology. 98(10):2413-2420.
156
nguon tai.lieu . vn
