1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sinh trùng truyền lây qua cá

Ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sinh trùng truyền lây qua cá

Công nghệ sinh học được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản nói chung và trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh thủy sản nói riêng. Bài viết này giới thiệu ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sinh trùng truyền lây qua cá, cụ thể là sán lá ruột nhỏ Haplorchis thường ký sinh ở ruột non của người và động vật ăn cá nhiễm ấu trùng sán chưa được xử lý triệt để. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG TRUYỀN LÂY QUA CÁ Kim Văn Vạ

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 9

Ngày tạo 12/29/2020 11:32:22 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.45 M

Tên tệp

Tải Ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sin... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG TRUYỀN LÂY QUA CÁ Kim Văn Vạn1* TÓM TẮT Công nghệ sinh học được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản nói chung và trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh thủy sản nói riêng. Bài viết này giới thiệu ứng dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán ký sinh trùng truyền lây qua cá, cụ thể là sán lá ruột nhỏ Haplorchis thường ký sinh ở ruột non của người và động vật ăn cá nhiễm ấu trùng sán chưa được xử lý triệt để. Do trứng, ấu trùng và sán trưởng thành có kích thước nhỏ, hình dạng giống một số loài sán lá khác nên dễ chẩn đoán và nhận dạng nhầm. Một phương pháp sinh học phân tử lần đầu tiên được áp dụng ở Việt Nam nhằm xác định sán lá ruột nhỏ bao gồm H. taichui và H. pumilio dựa trên phản ứng PCR gen ITS-2 với mồi xuôi là 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ và mồi ngược BD2R: 5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3’), sử dụng chung cho các loài sán lá ở nhiệt độ bám mồi là 50oC, và giải trình trình tự phân tích gen. Nguồn mẫu được dùng cho nghiên cứu gồm sán trưởng thành ký sinh trên người và ấu trùng metacercaria ký sinh trên cá được thu ở Nam Định (Việt Nam) và Bangkok (Thái Lan). Chuỗi gen ITS-2 thu được có độ dài 290 bp là của H. pumilio và 446 bp là của H. taichui. Trình tự sắp xếp nucleotide trong gen ITS-2 của H. taichui chênh lệch so với H. pumilio do một đoạn gen có độ dài 154 nucleotide được chèn vào từ nucleotide thứ 198 đến 352. Có sự tương đồng cao (99- 100%) trong gen ITS-2 giữa mẫu sán Việt Nam và mẫu sán Thái Lan trong nghiên cứu. Từ khóa: Haplorchis spp, H. pumilio, H. taichui, PCR, tương đồng. I. ĐẶT VẤN ĐỀ qua cá, bệnh do sán lá gan nhỏ rất nguy hiểm Nuôi trồng thủy sản thâm canh phát triển đối với người và gia súc, chúng gây tổn hại kéo theo nhiều dịch bệnh xảy ra, nhiều bệnh trong gan và ống mật thậm chí gây ung thư rất khó chẩn đoán. Đặc biệt các phương pháp gan. Trong khi đó bệnh do sán lá ruột nhỏ gây chẩn đoán bệnh nhanh và chính xác là rất cần ra ít nguy hiểm hơn nhiều. Nhưng trong các thiết. Ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt phương pháp chẩn đoán bệnh truyền thống để ứng dụng PCR cho kết quả chẩn đoán nhanh phân biệt sán lá ruột nhỏ và sán lá gan nhỏ ở và chính xác tác nhân gây bệnh cho động vật các giai đoạn phát triển trong vòng đời như thủy sản đang là một xu hướng mới (Kim Văn trứng, ấu trùng (redia, cercaria, metacercaria), Vạn và ctv., 2007a, Kim Văn Vạn và ctv., sán trưởng thành chủ yếu phân biệt bằng hình 2007b, Kim Văn Vạn và ctv., 2007c; Kim Van thái. Rất nhiều giai đoạn trong vòng đời hình Van và Dinh Thi Thuy, 2008; Kim Văn Vạn và thái của các loài sán lá là rất giống nhau và khó ctv., 2009). phân biệt cụ thể bằng phương pháp hình thái Trong các bệnh ký sinh trùng truyền lây học (Tesana và ctv., 1991). 1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam *Email: kvvan@vnua.edu.vn 56 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  2. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Trong một tế bào của cơ thể động vật hiện xác định, thẩm định loài và phân biệt luôn tồn tại 2 hệ gen: hệ gen nhân tế bào và chúng với các loài sán lá khác. hệ gen ty thể, hai hệ gen này hoạt động có tính Trong bài báo này, chúng tôi chủ yếu chất vừa độc lập vừa tương tác và hệ gen ty tập trung vào gen ITS-2 nhằm mục đích giám thể chịu ảnh hưởng điều hòa của hệ gen nhân định phân tử 2 loài sán lá ruột nhỏ nói trên, so tế bào. Hệ gen nhân tế bào có hệ số đột biến sánh đặc điểm của gen này trong các loài sán thấp hơn hệ gen ty thể. Bất kể sự thay đổi nào lá truyền lây giữa cá - động vật trên cạn và xây của các gen cũng có thể dẫn đến sự biến đổi dựng cây phả hệ tìm mối liên quan giữa sán lá hệ gen có tính chất đặc trưng của loài. Hệ gen ruột nhỏ Haplorchis với các loài sán lá truyền nhân chiều hướng bảo tồn rất cao và có giá lây khác. trị trong giám định. Trong nhân tế bào có một II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP nhóm gen quan trọng là 5,8S; 18S; 28S và vùng nucleotide nối giữa các gen đó là ITS- 2.1. Mẫu và nguồn gốc mẫu 1 và ITS-2 (Internal transcribed spacer) được Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành và ấu dùng trong phân tích phân loại (Le Thanh Hoa trùng (metacercariae) của Haplorchis được các và ctv., 2002) (Hình 1). đối tác tham gia dự án FIBOZOPA cung cấp: Nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung đối với các bệnh ký sinh trùng truyền lây nhằm ương (NIMPE), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng khắc phục những tồn tại của các phương pháp Thủy sản 1 (RIA1). Nguồn mẫu này được thu nghiên cứu cổ truyền là hướng mới được quan từ người nhiễm sán lá ruột nhỏ và cá nhiễm ấu tâm trong nhiều năm qua ở nước ta. Mặc dù trùng sán lá ruột nhỏ vùng Nam Định (Bảng 1). có một số nghiên cứu sinh học phân tử trong Mẫu sán (cả ấu trùng và sán trưởng thành giám định phân loại phả hệ và dịch tễ học phân của sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H. tử một số sán lá, sán dây ở Việt Nam, nhưng pumilio) đã được xác định hình thái chuẩn do đối với sán lá ruột nhỏ Haplorchis, cho đến khoa Ký sinh trùng, trường Đại học Mahidol, nay, rất ít nghiên cứu đề cập đến. Với sự giúp Bangkok, Thái Lan (TS. Jitra Waikagul) cung đỡ của dự án FIBOZOPA (Fishborne Zoonotic cấp. Parasites: Dự án ký sinh trùng truyền lây giữa Mẫu sán và ấu trùng sán được lưu giữ động vật thủy sinh, động vật trên cạn kể cả trong cồn 70o và bảo quản lạnh cho đến khi người) đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực sử dụng. Hình 1. Vùng gen ribosom của hệ gen nhân tế bào (18S-5,8S-28S) và điểm bám mồi (3SF-BD2R) nhân đoạn gen ITS-2. TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 57
  3. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Bảng 1. Danh sách mẫu, nguồn gốc của mẫu trong nghiên cứu và nguồn gen tham khảo Loài sán Ký hiệu mẫu Loại mẫu Nguồn mẫu Ký chủ Nguồn gen ITS-2 (ADN) H. pumilio Hpu (TL1) Sán trưởng Thái Lan Người Ando và ctv., 2001 thành H. pumilio HpM (TL) Metacercaria Thái Lan Cá Nghiên cứu này Haplorchis sp. HspMND (VN) Metacercaria Việt Nam Cá Nghiên cứu này H. pumilio Hpu Dzikowski và ctv., (AY245706) 2004; AY245706 Haplorchis sp. HspND(VN) Sán trưởng Việt Nam Người Nghiên cứu này thành Haplorchis sp. HspNDV(VN) Sán trưởng Việt Nam Người Nghiên cứu này thành H. taichui Hta(TL1) Sán trưởng Thái Lan Người Ando và ctv., 2001 thành Haplorchis sp. HspMND2(VN) Metacercaria Việt Nam Cá Nghiên cứu này H. taichui Hta(AY245705) Dzikowski và ctv., 2004; AY245705 O. viverrini Ovi(AY584735) Sanath và ctv., 2004; AY584735 O. viverrini Ovi(TL1) Sán + ấu trùng Thái Lan Người Ando và ctv., 2001 C. sinensis Csi(SKR) Lee và ctv., 1999; AF217095 2.2. Phân tích ITS-2 Mồi để thực hiện phản ứng: mồi xuôi Quá trình phân tích sinh học phân tử 3SF (5’-GGTACCGGTGGATCACTCG- được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của GCTCGTG-3') và mồi ngược BD2R (5'-TAT- Phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ Sinh GCTTAAATTCAGCGGGT-3'). Đây là mồi học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam chung cho phân tích gen ITS-2 của các loài (Hà Nội). sán lá (Bowles và ctv., 1995). Sơ đồ hệ gen Mẫu sán lá ruột nhỏ trưởng thành và ấu nhân, điểm bám mồi và mồi dùng được mô trùng sán được tách chiết ADN tổng số bằng phỏng ở Hình 1. QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc., USA). Phản ứng PCR tiến hành với dung tích là Sau khi thu được ADN tổng số tiến hành 50 ml (25 ml PCR master mix, 2 ml primer (10 thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt: pmol/ ml), 4 ml khuôn và 17 ml nước) và kiểm Nhiệt độ để bung liên kết là 94oC trong 1 phút, tra sản phẩm trên thạch agarose 1%. nhiệt độ bám mồi là 50oC trong 1 phút, nhiệt Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ độ cung cấp cho quá trình tổng hợp chuỗi QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) và ADN là 72oC trong vòng 2 phút. Toàn bộ quá được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (TA- trình thực hiện phản ứng PCR là 35 chu kỳ (Le cloning kit, hãng Invitrogen). Sau khi tách Thanh Hoa và ctv., 2002). dòng, ADN plasmid tái tổ hợp được giải trình trình tự trên máy ABI-3100 Avant Genetic 58 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  4. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Analyzer tại Viện Công nghệ sinh học. Chuỗi khảo (Ando và ctv., 2001) và so sánh với gen nucleotide được xử lý bằng chương trình ITS-2 của một số loại sán lá truyền lây khác SeqEd1.03, sau đó so sánh sử dụng chương (Bảng 1). Các chương trình GENEDOC2.5 và trình AssemblyLIGN v1.9c và MacVector8.2 MEGA3.1 được sử dụng để phân tích và so (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. So sánh về thành phần nucleotide (Nicholas và sánh trình tự chuỗi ITS-2 của mẫu nghiên Nicholas, 1999; Kumar và ctv., 2004). cứu với trình tự gen ITS-2 của H. taichui và III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU H. pumilio từ ngân hàng gen, từ tài liệu tham 3.1. Sản phẩm PCR vùng ITS-2 Hình 2. Sản phẩm PCR vùng gen ITS-2 trên thạch agarose 1% M: chỉ thị ADN (Lamda cắt bằng HindIII); 1: Hta (TL), mẫu H. taichui của Thái Lan; 2: HpM (TL), mẫu metacercaria H. pumilio của Thái Lan; 3: HspMND (VN), mẫu metacercaria Haplorchis sp. thứ nhất của Việt Nam; 4: HspND (VN), mẫu Haplorchis sp. của Việt Nam; 5: HspMND2 (VN), mẫu metacercaria Haplorchis sp. thứ 2 của Việt Nam Kết quả cho thấy có sự sai khác về 2 giữa H. taichui và H. pumilio. Gen ITS-2 chiều dài của vùng gen ITS-2 giữa các mẫu của H. taichui dài hơn H. pumilio do có một Haplorchis sp. thu được ở Việt Nam và giữa đoạn 154 nucleotide từ nucleotide thứ 198 đến mẫu H. taichui và H. pumilio của Thái Lan nucleotide 352 được chèn vào (Hình 3). Các (mẫu đã được xác định hình thái học). Độ dài mẫu sán ruột nhỏ và ấu trùng của chúng thu của vùng gen ITS-2 giới hạn giữa cặp mồi (3SF được từ người và cá ở Việt Nam bao gồm mẫu và BDR) của H. taichui khoảng 0,6 kb và của HspMND2 (VN) có độ dài gen ITS-2 là 446 H. pumilio khoảng 0,4 kb. Mẫu sán Haplorchis bp và mẫu HspMND (VN) có độ dài gen ITS- sp. của Việt Nam cũng có độ dài vùng gen ITS- 2 là 290 bp. 2 tương tự như mẫu sán của Thái Lan (Hình 2). 3.3. Sự tương đồng của nucleotide trong gen 3.2. Trình tự vùng gen ITS-2 ITS-2 Trình tự nucleotide các mẫu nghiên cứu Mức độ tương đồng các nucleotide được thể được trình bày ở Hình 3. Kết quả giải trình hiện trong Bảng 2. tự cho thấy có sự sai khác về độ dài gen ITS- TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 59
  5. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Hình 3. So sánh trình tự nucleotide gen ITS-2 của các mẫu sán lá ruột nhỏ Haplorchis Việt Nam, Thái Lan và sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini). Ghi chú: Sai khác trình tự của các chủng so với Hpu (TL1) biểu thị bằng chính ký hiệu nucleotide của chúng; dấu (.) biểu thị sự giống nhau; dấu (-) không có nucleotide tương ứng. 60 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  6. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Bảng 2. Sự tương đồng nucleotide trong gen ITS-2 ở một số loài sán lá truyền lây qua cá Ghi chú: 1: Hpu (TL1); 2: HpuM (TL); 3: Hpu (AY245706); 4: HspMND (VN); 5: HspND (VN); 6: HspNDV (VN); 7: Hta (TL1); 8: Hta (TL); 9: HspMND2 (VN); 10: Hta (AY245705); 11: Ovi (AY584735); 12: Ovi (TL1); 13: Csi (SKR) IV. THẢO LUẬN (VN) có độ dài gen ITS-2 là 446 bp, tương Từ kết quả giải trình tự gen cho thấy có đương ITS-2 của H. taichui; và mẫu HspMND sự sai khác về độ dài gen ITS-2 giữa H. taichui (VN) có độ dài gen ITS-2 là 290 bp, tương và H. pumilio. Đối với H. taichui, gen ITS- đương gen ITS-2 của H. pumilio. 2 có độ dài là 445-446 bp còn đối với mẫu So sánh giữa các mẫu sán và ấu trùng sán H. pumilio là 290 bp. Gen ITS-2 của H. thu được ở Việt Nam với H. taichui và H. taichui dài hơn H. pumilio do có một đoạn pumilio của Thái Lan và so sánh với một số 154 nucleotide từ nucleotide thứ 198 đến sán lá truyền lây khác như sán lá gan nhỏ (C. nucleotide 352 được chèn vào. Sự sai khác sinensis và O. viverrini) về mức độ tương nhiều về trình tự sắp xếp các nucleotide giữa đồng các nucleotide cho thấy mẫu H. pumilio H. taichui và H. pumilio chủ yếu xảy ra ở các ((HpuM (TL) nguồn gốc từ Thái Lan) phân vị trí sau đoạn chèn, còn các vị trí trước đoạn tích ở nghiên cứu này và mẫu của Ando và chèn có sự tương đồng lớn. Các mẫu sán ruột ctv., (2001) (từ Thái Lan) có sự tương đồng nhỏ và ấu trùng của chúng thu được từ người nucleotide của gen ITS-2 là 96% và giữa và cá ở Việt Nam bao gồm mẫu HspMND2 mẫu HspMND (VN) với mẫu H. pumilio của TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 61
  7. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Thái Lan trong nghiên cứu này HpuM (TL) V. KẾT LUẬN và mẫu phân tích của Ando và ctv., (2001) có Kết quả giải trình tự gen ITS2 sán lá ruột sự tương đồng nucleotide tương ứng là 99 và nhỏ Haplorchis spp. ở các giai đoạn cercariae, 96%. Trong khi đó sự tương đồng nucleotide metacercariae và sán trưởng thành được thu trong các mẫu H. pumilio của Thái Lan và cả từ ốc, cá, chó mèo, người ở Nam Định, Nghệ mẫu HspMND (VN) so với Hpu (AY245706) An Việt Nam và vùng Đông Bắc Thái Lan từ Ngân hàng gen chỉ đạt 94%. Mức độ tương cho thấy có sự sai khác về độ dài đoạn gen đồng nucleotide giữa các mẫu (1-4) đạt tỷ lệ ITS2 giữa sán lá ruột nhỏ loài H. taichui và tương đối cao (94-99%) tỷ lệ này phản ánh H. pumilio. Đối với H. taichui, gen ITS2 có tương đồng thường thấy ở trong một loài. Như độ dài là 445 - 446 bp còn đối với mẫu sán H. vậy có thể kết luận mẫu HspMND (VN) của pumilio là 290 bp. Việt Nam là H. pumilio. Giữa 2 loài sán lá ruột nhỏ H. taichui Đối với mẫu H. taichui có nguồn gốc Thái và H. pumilio có sự sai khác về độ dài và trật Lan trong nghiên cứu này Hta (TL) với mẫu tự gen ITS-2 được thể hiện ở sự chèn đoạn Hta (TL1) trong nghiên cứu của Ando và ctv., gen 154 nucleotide, làm cho đoạn gen ITS-2 (2001) cho thấy có sự tương đồng nucleotide của H. taichui dài hơn đoạn gen ITS-2 của H. là 99%. Trong khi đó mẫu HspMND2 (VN) pumilio. có sự tương đồng rất cao từ 99-100% so với Có rất ít sự sai khác về trình tự nucleotide mẫu H. taichui của Thái Lan và có sự tương trong gen ITS-2 của H. pumilio giữa mẫu sán đồng rất thấp với các mẫu H. pumilio chỉ đạt của Việt Nam và mẫu sán của Thái Lan trong từ 52-54%, và đây là mức độ tương đồng nghiên cứu này (tương đồng đạt 99%) và có sự thường thấy ở 2 loài khác nhau. Vì vậy có thể sai khác không đáng kể giữa mẫu sán của Thái kết luận mẫu HspMND2 (VN) của Việt Nam Lan trong nghiên cứu này với mẫu sán Thái là H. taichui. Lan trong nghiên cứu của các tác giả khác. Đối với mẫu ký hiệu HspNDV (VN) khi Có sự giống nhau hoàn toàn về trình tự phân tích sự tương đồng nucleotide vùng gen sắp xếp nucleotide trong gen ITS-2 của H. ITS-2 cho thấy tương đồng tuyệt đối 100% so taichui giữa mẫu sán Việt Nam và mẫu sán với O. viverrini từ Ngân hàng gen. Le Thanh Thái Lan trong nghiên cứu này và giống nhau Hoa và ctv., (2003) cho rằng sán lá gan nhỏ O. gần như tuyệt đối với mẫu sán Thái Lan của viverrini chủ yếu phân bố ở vùng Nam Trung tác giả Ando và ctv., (2001). bộ và phía Nam, nhưng mẫu HspNDV (VN) chúng tôi phân tích ở đây lại được tìm thấy ở Nghiên cứu này giúp rút ngắn trong vùng Nam Định. Điều này cho thấy cần thiết nghiên cứu vòng đời của sán lá ruột nhỏ nói có nghiên cứu bổ sung về nguồn gốc để có kết riêng và sán lá song chủ nói chung. luận chắc chắn hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Trình tự gen ITS-2 của Hta (AY245705) Tài liệu tiếng Việt thu thập từ Ngân hàng gen đem so sánh với Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích mẫu nghiên cứu của chúng tôi và các mẫu Nga, Nguyễn Thị Tuyết Nhung và Anders tham khảo khác cho thấy có tỷ lệ tương đồng Dalgaard, 2007a. Phân biệt sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H. pumilio với các loài rất thấp (45%) với nhóm H. taichui và 54-68% sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (internal với nhóm H. pumilio. Vậy chắc chắn trình tự transcribed spacer). Tạp chí Khoa học kỹ này trong Ngân hàng gen là không đúng với thuật nông nghiệp, Trường Đại học Nông H. taichui. nghiệp 1. Tập V số 1/2007. NXB Nông nghiệp, Trang 36-43. ISSN: 1895-0004. 62 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  8. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề, Kim Van Van, Anders Dalgaard, David Blair and Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Thị Tuyết Thanh Hoa Le, 2009. Haplorchis pumilio & Nhung và Anders Dalgaard, 2007b. Giám H. taichui in Vietnam discriminated using định sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và ITS-2 DNA Se quence data from adults and H. pumilio sử dụng chỉ thị ITS-2 (internal larvae. Experimental Parasitology 123 Issue transcribed spacer). Y học thành phố Hồ Chí 2, October, 2009. Pages 141-151. ISSN Minh. Chuyên đề ký sinh trùng, Trường Đại 0014-4894 học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Tập 11 *Phụ Kumar, S., Tamura, K., Nei, M., 2004. MEGA3: bản của số 2* 2007. Trang 104-110. Integrated Software for Molecular Kim Văn Vạn, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề và Evolutionary Genetics Analysis and Anders Dalgaard, 2007c. Ứng dụng sinh học Sequence Alignment. Briefings in phân tử xác định các giai đoạn phát triển của Bioinformatics 5, 150-163. sán lá truyền lây qua cá từ các ký chủ trong Le, T.H., N.V., Chuong, N.V., De, P. Sithitharworn, vòng đời. Hội nghị chuyên đề chào mừng N.B., Nga, T.N., Trung, L.K., Thuan, 2003. 105 năm thành lập trường ĐH Y Hà Nội: Report on molecular analysis of Opisthorchis “Y-sinh học phân tử ứng dụng trong ngành viverrini collected from Phu Yen province. ký sinh trùng”. Trường Đại học Y Hà Nội. Proceedings of National Conference on Trang 84-91. Molecular Biology and Biochemistry, Hanoi Tài liệu tiếng Anh (22-24.10.2003). Ando, K., Sathithaworn, P., Nuchjungreed, C., Le, T.H., Blair, D., and McManus, D.P., 2002. Tesana, S., Srisawangwong, T., Limviroj, W., Mitochondrial genomes of parasitic and Chinzei, Y., 2001. Nucleotide sequence flatworms. Trends Parasitol, 18: 206-213. of mitochondrial CO I and ribosomal ITS-2 Nicholas, K.B., and H.B., Nicholas, 1999. genes of Opisthochis viverrini in Northeast GeneDoc: a tool for editting and annotating Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public multiple sequence alignments. Distributed Health 2001; 32: 17-22. by authors. Bowles, J., Blair, D., McManus, D.P., 1995. Tesana, S., Srisawangwonk, T., Kaekes, S., A molecular phylogeny of the human Sithithaworn, P., Kanla, P., Arunyanart, C., schistosomes. Mol Phylogenet Evol 4: 103- 1991. Egg shell morphology of the small 109. eggs of human trematodes in Thailand. Dzikowski, R., Levy, M.G., Poore, M. F., Southeast Asian J Trop Med Public Health Flowers, J. R., and Paperna, I., 2004. Use 1991; 22: 631-6. of rDNA polymorphism for identification of Heterophyidae infecting freshwater fishes. LỜI CẢM ƠN Dis Aquat Org 2004; 59: 35-41. Tác giả gửi lời cảm ơn Tổ chức DANIDA và Kim Van Van and Dinh Thi Thuy, 2008. dự án FIBOZOPA đã cung cấp kinh phí và tạo Comparison of Diagnostic Methods for the mọi điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu này. Detection of Parasites in Fish. Journal of Science and Development. Hanoi University of Agriculture. Special Issue April 2008. Agricultural Publishing House, Pages 136- 144. ISSN: 1895-0004. TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 63
  9. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 APPLIED BIOLOGY TECHNOLOGY IN DIAGNOSIS PARASITE TRANSMIT VIA FISH Kim Van Van1* ABSTRACT Biotechnology was applied in general aquaculture and special diagnostic aquaculture pathogents. This paper will introduce applying biotechnology in zoonotic parasitological diagnostics as small intestine fluke: Haplorchis spp are tiny trematodes to be found in the small intestines of various definitive hosts such as human, birds, cats, dogs and rats. Human and other definitive hosts are infected by eating raw freshwater fishes containing encysted metacercariae. Haplorchis spp. is not easy to discriminate from other trematodes due to their minute size, similar morphology of eggs, cercaria, metacercaria and adult worm. A molecular method, for the first time in Vietnam, was applied to identify H. pumilio and H. taichui based on amplification of ITS-2 using forward primer, 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ and reverse primer BD2R: 5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3-BD2R) with annealing at 50oC in the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing for analyzing the nucleotide composition. Samples including adult worm and metacercariae were collected on human and fish in Nam Dinh (Vietnam) and Bangkok (Thailand). Length of ITS- 2 specific for H. taichui is 446bp; and for H. pumilio is 290bp. ITS-2 sequence in H. taichui longer than that in H. pumilio is due to the insertion of 154 nucleotides between nucleotide 198 and 352. There was high identity rate of nucleotides (99- 100%) in the ITS-2 gene between Vietnamese and Thai H. taichui or H. pumilii respectively. Keywords: Haplorchis spp, H. taichui, H. pumilio, PCR, identity. Người phản biện: TS. Đinh Thị Thủy Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 1 Vietnam National University of Agriculture *Email: kvvan@vnua.edu.vn 64 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng