1. Trang Chủ
  2. Nông - Lâm - Ngư
  3. Tiểu luận:Chuẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm SIEC bằng kỹ thuật gen

Tiểu luận:Chuẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm SIEC bằng kỹ thuật gen

Escherichia coli (E. coli) là một trong những vi khuẩn phổ biến trong đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng. Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nhất là khi sinh lý cơ thể thay đổi, stress, loạn khuẩn xảy ra, thì một số dòng E. coli độc có thể gây bệnh trên người và một số loài động vật. Sinh vieân : Löông Theá Thònh MSSV : 05126112 I. ÑAËT VAÁN ÑEÀ Vi sinh vaät noùi chung vaø vi khuaån noùi rieâng

Thể loại Tài liệu miễn phí Nông - Lâm - Ngư

Số trang 18

Ngày tạo 8/30/2018 1:56:55 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.64 M

Tên tệp

Tải Tiểu luận:Chuẩn đoán vi khuẩn E.Coli nhóm SIEC bằn... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Sinh vieân : Löông Theá Thònh MSSV : 05126112
  2. I. ÑAËT VAÁN ÑEÀ Vi sinh vaät noùi chung vaø vi khuaån noùi rieâng giöõ vai troø raát quan troïng trong moïi heä sinh thaùi. Chuùng toàn taïi khaép nôi ngay caû trong cô theå cuûa caùc sinh vaät khaùc. Ña soá caùc loaøi vi khuaån coù lôïi ñöôïc öùng duïng trong saûn xuaát caùc cheá phaåm phuïc vuï cho vaät nuoâi vaø con ngöôøi. Moät soá ít laïi laø nguyeân nhaân gaây beänh. Ñieàu naøy thuùc ñaåy caùc kyõ thuaät chaån ñoaùn vi khuaån ra ñôøi. Thoâng thöôøng trong chaån ñoaùn vi khuaån thöôøng aùp duïng kyõ thuaät nuoâi caáy phaân laäp treân moät soá moâi tröôøng chuyeân bieät vaø xaùc ñònh vi khuaån thoâng qua caùc phaûn öùng sinh hoùa… Quy trình chaån ñoaùn xeùt nghieäm naøy coù öu ñieåm laø ñôn giaûn nhöng laïi khoâng ñaûm baûo tính chính xaùc cuûa keát quaû cuõng nhö khoâng cho thaáy nhöõng moái lieân heä veà maët di truyeàn, söï bieán chuûng cuûa vi khuaån theo thôøi gian. Caùc kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû, kyõ thuaät gen, kyõ thuaät chaån ñoaùn döïa treân caáu truùc gen cuûa vi khuaån nhö kyõ thuaät PCR, Real-time PCR, PCR-RFLP… vôùi nhöõng öu ñieåm noåi troäi nhö nhanh, nhaïy, chính xaùc ñaõ thay theá raát toát cho caùc phöông phaùp chaån ñoaùn coå ñieån trong caùc tröôøng hôïp xaûy ra oå dòch, nhaát laø ñoái vôùi caùc loaïi vi khuaån khoù nuoâi caáy vaø chaån ñoaùn nhö vi khuaån lao, Leptospira… hoaëc nhöõng vi khuaån gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm nhö Salmonella, E. Coli nhoùm STEC. 1
  3. II. TOÅNG QUAN II.1. Tröïc khuaån Escherichia coli: Escherichia coli laø moät loaïi tröïc khuaån soáng thöôøng xuyeân trong ruoät ngöôøi vaø moät soá ñoäng vaät ñöôïc Eschrich phaùt hieän ra töø naêm 1885. Chuùng chieám tôùi 80% vi khuaån hieáu khí soáng ôû ruoät. Bình thöôøng chuùng khoâng gaây beänh, khi cô theå suy yeáu moät soá chuûng coù khaû naêng gaây beänh. Vi khuaån E. Coli thuoäc hoï tröïc truøng ñöôøng ruoät (Enterobacteriacae). ÔÛ trong ruoät chuùng soáng ñoái khaùng vôùi moät soá vi khuaån khaùc nhö Salmonella vaø Shigella (Thöông haøn vaø lî) nhôø coù khaû naêng taïo ra moät loaïi chaát öùc cheá coù teân laø Colixin. Chuùng coøn coù khaû naêng toång hôïp moät soá vitamin thuoäc nhoùm B, E vaø K. Vì theá khi khoâng gaây beänh chuùng coù lôïi cho ñöôøng ruoät nhôø haïn cheá ñöôïc moät soá vi khuaån gaây beänh khaùc, giöõ theá caân baèng sinh thaùi trong ruoät vaø sinh toång hôïp moät soávitamin. E. Coli ñöôïc thaûi ra moâi tröôøng theo phaân, do chieám tôùi 80% vi khuaån hieáu khí trong ruoät vaø luoân giöõ theá caân baèng sinh thaùi neân E. Coli ñöôïc choïn laøm vi sinh vaät chæ thò oâ nhieãm. 2
  4. II.1.1 Ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa E. Coli: a) Ñaëc ñieåm hình thaùi & caáu taïo: E. Coli coù hình que, hai ñaàu troøn, kích thöôùc daøi ngaén khaùc nhau, thöôøng töø 2 – 3 micromet x 0,5 micromet. Thöôøng ñöùng rieâng reõ töøng teá baøo, cuõng coù khi gheùp töøng ñoâi moät, coù khi keát vôùi nhau thaønh töøng ñaùm hoaëc moät chuoãi ngaén. Thöôøng coù tieâm mao moïc khaép beà maët,coù khaû naêng di ñoäng. Khoâng coù khaû naêng hình thaønh baøo töû, coù khaû naêng hình thaønh giaùp maïc (voû nhaøy) khi gaëp moâi tröôøng dinh döôõng toát. Nhuoäm gram aâm. b) Tính chaát nuoâi caáy: Deã nuoâi caáy, pH thích hôïp 7 – 7,2, nhieät ñoä thích hôïp 37oC. E. Coli coù phaûn öùng ñoû Methyl döông tính. E. Coli coù khaû naêng sinh Indol. c) Söùc ñeà khaùng: E. Coli deã bò tieâu dieät bôûi caùc thuoác saùt truøng thoâng thöôøng, söùc ñeà khaùng yeáu. E. Coli thöôøng bò tieâu dieät ôû nhieät ñoä 60oC trong 30 phuùt. Deã bò tieâu dieät bôûi caùc thuoác saùt truøng thoâng thöôøng. 3
  5. II.1.2 Khaû naêng gaây beänh: Bình thöôøng E. Coli soáng trong ruoät ngöôøi khoâng gaây beänh. Khi cô theå suy yeáu moät soá chuûng trôû neân gaây beänh. E. Coli khoâng nhöõng chæ gaây beänh ñöôøng ruoät nhö tieâu chaûy, kieát lî maø coøn coù theå gaây moät soá beänh khaùc nhö vieâm ñöôøng tieát nieäu, vieâm gan, vieâm pheá quaûn, vieâm maøng phoåi, v…v… Ñoäc toá cuûa E. Coli thuoäc loaïi noäi ñoäc toá, coù khaû naêng chòu nhieät. Ñaëc bieät coù moät soá chuûng ñoät bieán coù khaû naêng sinh ngoaïi ñoäc toá, coù khaû naêng taùc ñoäng leân teá baøo thaàn kinh. Caùi teân EHEC ñöôïc aùp duïng ñoái vôùi Vi khuaån Verotoxigenic E. Coli (VTEC), coù lieân quan ñeán beänh vieâm thaønh ruoät keát ôû ngöôøi. Verotoxin laø ñoäc toá cuûa E. Coli gaây cheát teá baøo Vero. Nhöõng ñoäc toá naøy gaàn gioáng vôùi ñoäc toá Shiga, ñöôïc taïo ra töø Shigella dysenteriae, vaø vì vaäy chuùng cuõng ñöôïc goïi laø ñoäc toá gioáng Shiga (Shiga-like toxin). Ñoäc toá Verotoxin chöùa 2 nhoùm: VT-1 (Shiga-like toxin I [SLT-I]) vaø VT-2 (Shiga-like toxin II [SLT-II]). 4
  6. Yeáu toá ñoäc löïc cuûa nhoùm STEC bao goàm enzyme haemolysin phaù huûy hoàng caàu (gen Hly), yeáu toá keát baùm Intimin (gen eae), ñoäc toá SLT-I hay VT1 hoaëc stx1 (gen stx1), ñoäc toá SLT-II hay VT2 hoaëc stx2 (gen stx2), ñoäc toá SLT- Iie hay VT2e hoaëc stx2e (gen stx2e)… caùc loaïi ñoäc toá cuûa STEC coù tính chaát sinh hoïc töông ñoái gioáng nhau, ñeàu cuøng coù khaû naêng phaù huûy teá baøo Vero vì vaäy vieäc phaân bieät ñöôïc chuùng cuõng khoâng ñôn giaûn, ñoøi hoûi caùc phöông tieän chaån ñoaùn hieän ñaïi: Nuoâi caáy teá baøo hoaëc ELISA xaùc ñònh ñoäc toá stx; PCR, lai xaùc ñònh gen eae, VT1, VT2…; RFLP, PFGE phaân bieät kieåu gen… II.1.3 Caùc phöông phaùp chaån ñoaùn E. Coli: Cuõng gioáng nhö vi khuaån Salmonella, söï phaân loaïi vaø chaån ñoaùn vi khuaån E. Coli theo type khaùng nguyeân laø khaù phöùc taïp,döïa theo 3 loaïi khaùng nguyeân beà maët chính laø: Khaùng nguyeân thaân O, khaùng nguyeân loâng roi H vaø khaùng nguyeân capsul K. Trong phaân laäp vi khuaån STEC, ngöôøi ta thöôøng söû duïng moâi tröôøng sorbito-MacConkey agar (SMAC) hoaëc moâi tröôøng SMAC boå sung cefixime vaø potassium tellurite (CT-SMAC). Tuy nhieân vieäc phaân laäp vi khuaån treân 2 moâi tröôøng naøy cho pheùp phaùt hieän chuû yeáu vi khuaån STEC thuoäc serotype O157, trong khi ñoù coøn khoâng ít STEC khoâng thuoäc serotype O17 vaø coù tính chaát leân men ñöôøng sorbitol raát bieán ñoåi. Keát quaû phaân laäp STEC treân 2 moâi 5
  7. tröôøng SMAC vaø CT-SMAC chæ phuø hôïp töø 30-80% keát quaû chaån ñoaùn ñoäc toá stx treân moâi tröôøng teá baøo Vero. Xeùt veà tính chaát sinh hoùa, vi khuaån O157:H7 STEC phaàn lôùn khoâng saûn sinh ñöôïc enzyme β-D-glucuronidase, do vaäy coù theå duøng tính chaát naøy ñeå sô boä ñaùnh giaù söï nhieãm O157:H7 STEC. Coù theå chaån ñoaùn E. Coli O157 baèng kyõ thuaät mieãn dòch huyønh quang tröïc tieáp vôùi vieäc söû duïng khaùng theå ña doøng khaùng O157 gaén fluorescein isothiocyanate vôùi thôøi gian xeùt nghieäm chæ caàn khoaûng 2 giôø. Kyõ thuaät ELISA tröïc tieáp cuõng cho pheùp phaùt hieän vi khuaån E. Coli O157 trong maãu vôùi thôøi gian raát ngaén, chæ trong voøng 1 giôø. Tuy caû 2 kyõ thuaät: Kyõ thuaät mieãn dòch huyønh quang tröïc tieáp vaø ELISA tröïc tieáp ñeàu coù ñoä nhaïy töông ñöông vôùi vieäc phaân laäp treân moâi tröôøng SMAC vaø CT-SMAC nhöng caàn phaûi khaúng ñònh söï hieän dieän cuûa ñoäc toá stx trong maãu. Ñieàu naøy ñöôïc thöïc hieän qua kyõ thuaät PCR-RFLP. 6
  8. II.2 Phöông phaùp: II.2.1 Nhaän dieän STEC (VTEC) baèng kyõ thuaät PCR: a) Xöû lyù maãu: Maãu phaân ñöôïc loïc nöôùc vaø xöû lyù vôùi phosphate-buffered saline (PBS) vaø ñöôïc kieåm tra ñoä loaõng ñeå ñaûm baûo hoaït tính cuûa ñoäc toá coù taùc duïng treân lôùp ñôn teá baøo Vero. b) Quaù trình thöïc hieän: Primers Qua vieäc xaùc ñònh gen ñoäc löïc cuûa nhoùm STEC (gen stx), ngöôøi ta coù theå nhaän dieän ñöôïc chuùng. Kyõ thuaät naøy söû duïng 2 caëp moài töông öùng khuyeách ñaïi cho 2 gen VT-1 vaø VT-2: Theo baùo caùo cuûa Karam Ramotar vaø coäng söï naêm1995: GAAGAGTCCGTGGGATTACG VT-1 Primer AGCGATGCAGCTATTAATAA TTAACCACACCCACGGCAGT VT-2 Primer GCTCTGGATGCATCTCTGGT Trong ñoù: VT-1 Primers duøng khuyeách ñaïi 130 caëp Nu (Töø Nu 1191 – 1320 cuûa gen VT-1) VT-2 Primers duøng khuyeách ñaïi 346 caëp Nu (Töø Nu 426 – 771 cuûa gen VT-2) 7
  9. Theo baùo caùo cuûa L. Mansouri-Najand vaø M. Khalili naêm 2007: Vaät lieäu: Hoãn hôïp thöïc hieän PCR chöùa: -5 μl Buffer - 50 mM KCL - 0,01 % gelatin - 10 mM Tris-HCL (pH 8.3) - 2,5 mM MgCl2 - 0,2 mM töøng loaïi dNTP - 0,001 mM từng loại Primers - 1 μl ADN khuoân - Phaûn öùng PCR baét ñaàu vôùi 2.5 U Tag polymerase 8
  10. Phaûn öùng: - Khôûi ñaàu laø bieán tính ADN ôû 95oC trong 5 phuùt - 40 chu kì sau dieãn ra vôùi chu trình nhieät: 94oC trong 1 phuùt, 55oC trong 1 phuùt, 72oC trong 1 phuùt - Chu kì cuoái giöõ 72 oC trong 7 phuùt Saûn phaåm khuyeách ñaïi töø phaûn öùng PCR sau ñoù ñöôïc ñieän di treân gel Agarose 2% vaø ñöôïc nhuoäm vôùi Ethidium bromide. 9
  11. II.2.2 ÖÙng duïng kyõ thuaät PCR-RFLP trong chaån ñoaùn vi khuaån E.Coli nhoùm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli): Saûn phaåm khueách ñaïi cuûa phaûn öùng PCR coù theå ñöôïc söû duïng ñeå duøng trong kyõ thuaät RFLP ñeå xaùc ñònh caùc chuûng trong nhoùm STEC. Kyõ thuaät RFLP tieán haønh treân cô sôû söû duïng caùc enzyme caét khaùc nhau keát hôïp vôùi caùc trình töï ADN ñöôïc caét cuõng khaùc nhau (trình töï ADN khaùc nhau laø saûn phaåm cuûa phaûn öùng PCR tröôùc ñoù). Keát quaû laø thu nhaän ñöôïc saûn phaåm caét khaùc nhau (mang tính ña hình). Vaø nhö vaäy cho pheùp phaân bieät ñöôïc caùc caù theå vôùi nhau. Thoâng thöôøng trong kyõ thuaät PCR ñeå chaån ñoaùn vi khuaån nhoùm STEC ngöôøi ta söû duïng caùc caëp moài xaùc ñònh gen stx1 vaø stx2, tuy nhieân ñeå chaån ñoaùn moät soá vi khuaån ñaëc bieät thuoäc nhoùm STEC ngöôøi ta söû duïng theâm nhöõng caëp moài cho pheùp xaùc ñònh caùc gen eae, stx2e … vaø caùc bieán theå cuûa chuùng. Những dòng E. Coli được tìm thấy đều tạo độc tố verotoxin (VT) hoặc Shiga-like toxin (SLT). Có 3 loại riêng biệt: VT-1 (SLT-1), VT-2 (SLT-2), và Vte (là biến thể của VT-2: SLT-IIv). Dòng E. Coli O91:H21 được nghiên cứu là sản xuất ra độc tố này. Sau khi giải trình tự và dòng hóa dòng vi khuẩn này, ta xác định được 2 gen riêng biệt mã hóa cho 2 độc tố đặc tính tương tự như VT-2. Gen thứ nhất gọi là vtx2ha mã hóa cho độc tố VT2v-a, gen thứ hai gọi là vtx2hb mã hóa cho độc tố VT2v-b 10
  12. Caùch thöïc hieän: Chẩn đoán gen tiểu phần B biến thể của Verotoxin loại 2 (VT2v-b): B1: Chọn dòng vi khuẩn trong bảng sau: 11
  13. B2: Thực hiện phản ứng PCR như trình bày ở trên thêm một số cặp mồi: Trong ñoù: VT2-c & VT2-d laø primers ñaëc tröng cho VT2 vaø bieán theå VT2; VT2v-1 & VT2v-2 laø primers ñaëc tröng cho bieát theå VT2 B3: Sử dụng Enzyme cắt giới hạn: Ñoái vôùi chuûng O157 coù theå duøng caùc RE: XbaI, AvrII, SpeI. 12
  14. B4: Ñieän di: Nhöõng trình töï ADN ñöôïc khuyeách ñaïi sau phaûn öùng PCR sau khi ñöôïc caét bôûi enzyme caét giôùi haïn seõ taïo ra nhieàu trình töï ADN nhoû ñaëc tröng cho töøng loaïi vaø ñöôïc xaùc ñònh qua phöông phaùp ñieän di gel agarose 2%. RFLP cuûa saûn phaåm PCR chaån ñoaùn gen VT2 (stx2) (A) Duøng enzyme caét HaeIII (B) Duøng enzyme caét RsaI (C) Duøng enzyme caét Nci a: Thang chuaånI b, c, d, e, f, g: caùc chuûng E.Coli 13
  15. B5: Nhuoäm baïc theo phöông phaùp cuûa Sambrook vaø coäng söï thu nhaän keát quaû. Öu ñieåm cuûa kyõ thuaät PCR-RFLP: - Do tính chaát chuyeân bieät raát cao cuûa enzyme caét neân kyõ thuaät naøy cho pheùp xaùc ñònh söï töông ñoàng hoaëc khaùc bieät raát nhoû giöõa caùc doøng vi khuaån hoaëc virus. - Coù theå xaùc ñònh nguoàn goác caên beänh ôû caùc oå dòch khoâng chæ trong phaïm vi moät vuøng maø caû toaøn theá giôùi. - Coù theå keát hôïp vôùi kyõ thuaät lai trong chaån ñoaùn caùc taùc nhaân gaây beänh. Khuyeát ñieåm: - Kyõ thuaät naøy khoâng cho pheùp phaân bieät caùc chuûng vi sinh vaät neáu söï bieán ñoåi gen cuûa chuùng xaûy ra ngoaøi vò trí caét ñaëc hieäu. 14
  16. III. KEÁT LUAÄN: Chaån ñoaùn ñöôïc vi khuaån E.Coli nhoùm STEC baèng kyõ thuaät PCR-RFLP thoâng qua gen ñoäc toá cuûa töøng chuûng. Xaùc ñònh ñöôïc caùc bieán theå ñoäc toá cuûa vi khuaån nhoùm STEC 15
  17. IV. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Coâng ngheä Sinh hoïc trong thuù y (Nguyeãn Ngoïc Haûi) Giaùo trình Vi sinh vaät hoïc moâi tröôøng (Traàn Caåm Vaân) Identification of Verotoxin Type 2 Variant B Subunit gens in E.Coli by PCR and RFLP (S.D Styler vaø coäng söï - Taäp 29, soá 7) Direct Detection of Verotoxin-Producing Escherichia coli in Stool Samples by PCR (KaRam Ramotar vaø coäng söï – Taäp 33, soá 3) Typing of Bovine Attaching and Effacing Escherichia coli by Multiplex in vitro amplification of Virulence-Associated genes (Bernard China et al – Taäp 62, soá 9) http://www.scribd.com/doc/17465542/Phan-loi-vi-sinh-bng-Sinh-Hc-Phan-T http://www.ncbi.nlm.nih.gov 16
  18. I. ÑAËT VAÁN ÑEÀ II. TOÅNG QUAN II.1 Tröïc khuaån Escherichia coli E. Coli ...................................................3 II.1.1 Ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa E. Coli.......................................................4 II.1.2 Khaû naêng gaây beänh ........................................................................5 II.1.3 Caùc phöông phaùp chaån ñoaùn E. Coli..............................................6 II.2 Phöông phaùp .........................................................................................7 II.2.1 Nhaän dieän STEC (VTEC) baèng kyõ thuaät PCR...............................8 II.2.2 ÖÙng duïng kyõ thuaät PCR-RFLP trong chaån ñoaùn vi khuaån E.Coli nhoùm STEC (Shiga-like toxin Escherichia coli)....................................11 III. KEÁT LUAÄN IV. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 17
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược