- Trang Chủ
- Nông nghiệp
- Thu nhận và khảo sát hoạt tính sinh học của sắc tố prodigiosin từ vi khuẩn Serratia marcescens
Xem mẫu
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 57
THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ
VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS
(PRODUCTION AND STUDY ON BIOLOGICAL ACTIVITIES OF RED PIGMENT
PRODIGIOSIN FROM SERRATIA MARCESCENS)
Đinh Minh Châu, Hồ Thị Bích Phương, Nguyễn Hoàng Anh Kha, Trần Lâm Tú Quyên
Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Thành phố
Hồ Chí Minh
SUMMARY
Bacterial strain SH1 was isolated from entomopathogenic nematodes (EPN)
Heterorhabditis indica CP 16. Their identification by API 20E Kit as well as by 16S rDNA
sequencing showed that it belongs to the species Serratia marcescens. The red pigment
produced by the isolate SH1 was confirmed to be its secondary metabolite prodigiosin.
Prodigiosin displayed its antibacterial activity against both Gram positive and Gram negative
bacteria, as well as its insecticidal activity against Spodoptera litura and S. exigua at a dose of
27,66 ng/cm2 and24, 40 ng/cm2 respectively,killingapproximately 80 - 90 % insects after 120
h of treatment.
Keywords: bioefficacy, bioinsecticides, entomopathogenic nematodes (EPN), ESI-MS,
insecticidal activity, prodigiosin, Serratia marcescens
ĐẶT VẤN ĐỀ
Prodigiosin là một hợp chất thứ cấp vi Nghiên cứu này bao gồm SH1 phân lập tuyến
khuẩn. Prodigiosin thu hút được nhiều quan trùng EPN H. indica CP16 và tìm hiểu khả
tâm do khả năng sử dụng làm màu tự nhiên, năng sản xuất chế phẩm sinh học diệt sâu từ
khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, cũng như hợp chất này.
hoạt chất kháng ức chế miễn dịch và chống
khối u (Tsuji et al., 1990).
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Tuyến trùng Heterorhabditis indica CP 16 do Phân lập vi khuẩntừ tuyến trùng
TS. Nguyễn Ngọc Châu, Viện Sinh thái Tài Heterorhabditis indica CP 16được tiến hành
nguyên Sinh vật Việt Nam cung cấp. Vi khuẩn dựa vào phương pháp của Akhurst (1980) trên
chỉ thị Bacillus subtilis, Staphylococcus môi trường MacConkey và NBTA. Chủng
aureus, Escherichia coli, Salmonella sp., sâu phân lập được khảo sát hình thái, sinh lý và
khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng sinh hóa bằng phương pháp vi sinh thông
Spodoptera exiguado Phòng thí nghiệm Đại thường và sử dụng Kit API 20E (Biomerieux),
học Công nghệ TP.HCM cung cấp. giải trình tự gene 16S rRNA (Công ty
Phương pháp nghiên cứu Namkhoa Biotek). Kết quả giải trình tự được
Phân lập và định danh tra cứu trên ngân hàng Gene sử dụng phần
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 58
mềm BLAST Để khảo sát ảnh hưởng của oxy lên tổng hợp
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). sắc tố, thực hiện như trên trong điều kiện kỵ
Trích ly và phân tích sắc tố khí, không lắc, lắc 150 vòng/phút và lắc 180
Tăng sinh vi khuẩn phân lập tổng hợp vòng/phút 48 giờ. Để khảo sát ảnh hưởng pH
sắc tố trong môi trường NB 24 giờ, lắc 150 dùng NaOH hoặc HCl điều chỉnh pH môi
vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Thử nghiệm trích trường ban đầu. Để chọn môi trường tổng hợp
ly sắc tố từ tế bào và canh trường bằng các hệ prodigiosin cao nhất các môi trường môi
dung môi: chloroform 100% và ether dầu hỏa trường NB, PG, môi trường dịch chiết protein
100%, choloroform 100% và ether dầu hạt đậu phộng và môi trường dịch chiết
hỏa:nước muối bão hoà (1:1; v/v), protein hạt mè được sử dụng. Xác định hàm
methanol:HCl 1N (95:5; v/v) và ether dầu hỏa lượng sắc tố vi khuẩn tổng hợp được trong mỗi
100% (1:1, v/v), methanol: HCl 1N (95:5; v/v) nghiệm thức của mỗi thí nghiệm.
và Ether dầu hỏa : nước muối bão hoà (1:1; Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của sắc
v/v). Quan sát sự tách pha để lựa chọn hệ dung tố
môi trích ly sắc tố. Vi khuẩn chỉ thị được tăng sinh trong
Phân tích sắc tố bằng phương pháp quét môi trường NB, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ
phổ hấp thụ trong khoảng 400 – 700 nm để xác phòng, 24 giờ, điều chỉnh mật mật độ tế bào
định λmax, sắc ký bản mỏng TLC trong ethyl về 4 x 107 cfu/ml.
acetate 100%; ether dầu hỏa : acetone (7:3; Khảo sát hoạt tính diệt sâu của sắc tố
v:v), khối lượng phân tử bằng phương pháp Sâu khoang Spodoptera litura
khối phổ ion hoá phun điện tử (ESI – MS). vàSpodoptera exigua được đưa vào thí
Khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 1- nghiệm. Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu tuổi
14 đến phổ hấp thụ của sắc tố và độ bền nhiệt 3 và 3 lá thầu dầu, quét lên bề mặt mỗi lá 200
của sắc tố ở nhiệt độ phòng, 37 oC, 50 oC, 65 μl sắc tố ở các nồng độ pha loãng. Mẫu đối
oC, 85 oC và 100 oC trong 15 phút. chứng thay prodigiosin bằng 200 μl dung dịch
Khảo sát quá trình tổng hợp sinh khối và sắc pha loãng PBS. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3
tố của vi khuẩn lần và theo dõi sâu chết theo thời gian đến khi
Tăng sinh chủng vi khuẩn được chọn hộp đối chứng chuyển sang nhộng.
trong môi trường NB, cấy giống 1 %, lắc 150 Xử lý số liệu
vòng/phút ở nhiệt độ phòng 72 giờ. Theo dõi Phân tích ANOVA bằng phần mềm
mật độ tế bào và nồng độ sắc tố tổng hợp được. Statgraphics Centurion XV.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập, định danh vi khuẩn từ tuyến trùng là Serratia marcescens SH1 và có thể truy cập
Heterorhabditis indica CP 16 trên ngân hàng gene NCBI với mã số truy cập
Sau khi phân lập trên môi trường NBTA là KF534508.
và MacConkey, chủng vi khuẩn phân lập được Tách chiết và phân tích sắc tố
đặt tên chủng SH1. Quan sát hình thái, sinh lý, Dung môi trích ly: methanol: HCl 1N
sinh hóa cho phép nghi ngờ đây là Serratia (95:5; v:v) và ether dầu hỏa: nước muối bão
marcescens. Kết quả thử nghiệm API 20E Kit hoà (1:1; v:v) trích ly sắc tố từ tế bào vi sinh
cho kết quả định danh là Serratia marcescens vật tỏ ra thích hợp cho tách pha tốt, màu nằm
với tỉ lệ tương đồng 97,4 %. Giải trình tự gene hoàn toàn trong pha hữu cơ.
16S rRNA của chủng vi khuẩn phân lập được Phổ hấp thụ của sắc tốtừ 400 nm đến 700 nm
và so sánh với các trình tự trên Genbank của cho thấy trong dung môi ethanol: HCl bước
NCBI cho thấy tỷ lệ tương đồng của SH1 với sóng hấp thụ cực đại là 535 nm, phù hợp báo
các chủng thuộc loài Serratia marcescens 99,7 cáo của Giri và đồng tác giả (2004).
- 100%. Như vậy, chủng phân lập được gọi tên
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 59
Sắc ký bản mỏng sắc tố trong hai hệ Động học tổng hợp sinh khối và sắc tố
dung môi ether dầu hỏa: acetone (7:3; v/v) và được trình bày trên hình 1A. Có thể thu nhận
ethyl acetate chỉ thu 1 vạch sắc tố hồng với Rf sắc tố từ 40-60 giờ. Hình 1B cho thấy vận tốc
lần lượt là 0,68 và 0,84. lắc tối thiểu là 150 vòng/phút để bảo đảm oxy
Kết quả phân tích khối phổ cho thấy [M + H]+ cho sinh tổng hợp prodigiosin. Hình 1C cho
= 324,8 Da. Các peak tiếp theo là thấy S. marcescens tổng hợp sắc tố
[M+2H+H]+=326,8 Da, [M+4H+H]+=328,8 prodigiosin tốt nhất ở pH 7,5. Trong số các
Da và [M+6H+H]+=330,8 Da có thể do sự môi trường thử nghiệm, môi trường protein
hydro hóa 1,2 hoặc 3 vòng pyrrole tạo thành hạt đậu phộng và hạt mè làm tăng tổng hợp
các pyrrolidine. Các kết quả trên đây chứng prodigiosin lên thêm 68,9 % và 122,0 % tương
minh sắc tố màu đỏ do S. marcescens SH1 ứng so với môi trường NB, phù hợp nghiên
tổng hợp là prodigiosin. cứu trước đó (Giri et al., 2004). Môi trường
Sự bền nhiệt của sắc tốthể hiện ở 100 oC peptone glycerol (PG) cho nồng độ sắc tổ tổng
15 phút thì sắc tố vẫn không đổi màu và định hợp cao nhất, vượt môi trường NB 163,0 %,
lượng cho thấy không giảm. cao hơn môi trường protein đậu phộng và mè
Các yếu tố ảnh hưởng lên sinh tổng hợp tương ứng 55,7 % và 18,5 % và đạt nồng độ
sắc tố 10,575 mg/ml sắc tố (Hình 1D)
.
Hình 1. A) Đường cong tăng trường và tổng hợp săc tố của SH1. B) Ảnh hưởng của oxy
đến quá trình tổng hợp sắc tố. C) Ảnh hưởng của pH môi trường lên quá trình tổng hợp sắc tố.
D) Ảnh hưởng của môi trường lên quá trình tổng hợp sắc tố.
Hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố Salmonella sp. của prodigiosin phụ thuộc vào
Khả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis, nồng độ, kết quả được trình bày trong Hình 2
Staphylococcus aureus, Escherichia coli và
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 60
.
Hình 2. Khả năng kháng khuẩn của prodigiosin.
Khả năng kháng khuẩn của sắc tố đối với vi S. exigua, thể hiện hiệu lực diệt sâu mạnh nhất
khuẩn Gram dương Bacillus subtilis và (Hình 3). Đặc biệt đây chỉ là các liều lượng
Staphylococcus aureus và vi khuẩn Gram âm trung bình trong thí nghiệm, điều này có thể
Escherichia coli và Salmonella sp. là tương tự liên quan đến tính kị nước của prodigiosin.
nhau, không hoàn toàn khớp với báo cáo của Sâu sống sót hóa nhộng và hóa bướm, tuy
Chandni và đồng tác giả (2012) cho rằng nhiên 60% nhộng không thể hóa bướm và chết
prodigiosin có khả năng kháng vi khuẩn Gram ở giai đoạn đó, số nhộng hóa bướm bị dị tật ở
dương mạnh hơn so với vi khuẩn Gram âm. cánh và bụng không thể bay và sinh sản.
Hiệu lực diệt sâu của prodigiosin LC¬50 của Cry 1C protein đối với Spodoptera
Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura mới nở từ 2 – 5 ng/cm2, Spodoptera
litura litura tuổi 2 là 70 ng/cm2 thử nghiệm trong 5
Sau 120 giờ cho ăn, liều lượng 27,66 ngày (Lereclus et al., 2005), chứng tỏ
ng/cm2 và 24,40 ng/cm2 gây chết gần 90 % prodigiosin trong thí nghiệm này có hiệu lực
sâu khoang S. litura và 80 % sâu xanh da láng diệt sâu khoang mạnh hơn Cry 1C protein.
Hình 3. Tỷ lệ chết của sâu khoang Spodoptera litura A) và sâu xanh da láng Spodoptera
exigua B) khi cho ăn lá thầu dầu tẩm prodigiosin.
Như vậy sắc tố prodigiosin của vi khuẩn việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm trừ sâu
S. marcescens SH1 có nhiều tiềm năng trong sinh học.
KẾT LUẬN
Tóm lại, kết quả nghiên cứu trên cho kháng khuẩn Gram dương và Gram âm, đặc
thấy prodigiosin tổng hợp bởi vi khuẩn SH1 biệt diệt sâu rất mạnh khi cho ăn. Prodigiosin
phân lập từ tuyến trùng diệt sâu hứa hẹn trở thành tác nhân kiểm soát sinh học
Heterorhabditis indica CP16 có hoạt tính mới.
- Bản tin Khoa học Trẻ số 2(1),2016 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Akhurst R. J., 1980. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus, bacteria
symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and
Heterorhabditis. Microbiology, 121: 303-309.
2. Chadni G., Sourav B. và Arijit D., 2012. Assessment pf process parameters influencing
the enhanced production of prodigiosin form Serratia marcescens and evaluation of its
antimicrobial, antiozidant and dyeing potentials, Malaysian Journal of Microblology,
vol 8: 116-122.
3. Giri A.V., Anandkumar N., Muthukumaran G. and Pennathur G., 2004. A novel medium
for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia
marcescens isolated from soil, BMC Microbiology, 4: 11.
4. Bravo A., Lereclus D., Agaisse H., Salamitou S., Sanchis V (2000). Strains of Bacillus
thuringiensis and pesticide composition containing them. US 6096306 A.
5. Tsuji R.F., Yamamoto M., Nakamura A., Kataoka T., Magae J., Nagai K., Yamasaki M.,
1990. Selective immunosuppression of prodigiosin 25-C and FK506 in the murine
immune system, J Antibiot, 43: 1293-1301.
nguon tai.lieu . vn
