Xem mẫu
- Tiềm năng và hạn chế của vaccine sống nhược 65-74 Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân từ moi 108-119
độc kháng bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra biển (Acetes sp.)
trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Production of hydrol sate protein powder from
Live vaccine against Edwardsiella ictaluri Acetes sp.
for catfish Pangasianodon hypophthalmus, LÊ HƯƠNG THỦY
potential and limit Quy trình công nghệ sản xuất alkyl glycerol 120-125
TRẦN HẠNH TRIẾT, NGUYỄN TRỌNG từ sinh vật biển dùng và tạo thực phẩm chức
BÌNH, LÊ VĂN HẬU, TRẦN KIM HOÀNG, năng akumarin
NGUYỄN QUỐC BÌNH Technological process for production of alkyl
Ứng dụng công nghệ biofloc nuôi thâm canh 75-83 glycerol from marine organisms for functional
tôm he chân trắng (Litopenaeus vannamei) vào foods akumarin
phát triển sản xuất CHU QUANG TRUYỀN, CẦM THỊ ÍNH,
Application of biofloc technology on intensive HOÀNG THANH HƯƠNG,
culture of white shrimp (Litopenaeus vannamei) S.P. KASIJANOV, N.A. LATYSHEV,
for production development PHẠM QUỐC LONG
NGUYỄN THỊ THU HIỀN, NGUYỄN VĂN Điều chế phức hợp kháng nguyên từ bán kháng 126-132
HUẤN, VŨ ANH TUẤN, NGUYỄN VĂN KHỎE nguyên domoic acid
Đa dạng thành phần loài động vật phù du khu 84-96 Making antigen from a hap ten domoic acid
vực vùng hạ Long An
Diversity on species composition of zooplankton ĐÀO VIỆT HÀ VÀ PHẠM XUÂN KỲ
in the lower area of Long An province
LÊ THỊ NGUYỆT NGA, PHAN DOÃN ĐĂNG
Đặc điểm sinh học sinh sản cá chim đen 97-107
Parastromateus niger (Bloch, 1795)
The reproductive biologyof black pomfret
Parastromateus niger (Bloch, 1795)
MAI VIẾT VĂN
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
DI TRUYỀN VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Trần Thị Thúy Hà*, Lưu Thị Hà Giang1
TÓM TẮT
Trong những năm trở lại đây, tiến bộ về di truyền và sinh học phân tử trên động vật thủy sản đã
cung cấp các thông tin hữu ích và đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản. Vai trò của thao
tác di truyền và sinh học phân tử trong nuôi trồng thủy sản ngày càng được biết đến rộng rãi. Bài
viết này điểm lại những nét chính về ứng dụng của di truyền trong chọn giống, lai tạo, nghiên cứu
nhiễm sắc thể, điều khiển giới tính, chuyển gen và vai trò của sinh học phân tử trong nuôi trồng
thủy sản ở Việt Nam.
Từ khóa: di truyền, nuôi trồng thủy sản, sinh học phân tử.
I. MỞ ĐẦU hệ tiếp theo. Việc chọn này chỉ có thể tiến hành
Thời gian qua, ứng dụng của di truyền và khi có đủ biến dị di truyền cho (những) tính
sinh học phân tử trong nuôi trồng thủy sản đã trạng quan tâm. Các phương pháp chọn lọc
đạt được những kết quả đáng ghi nhận. Chẳng khác nhau bao gồm chọn lọc cá thể (individual
hạn việc tạo ra những dòng cá rô phi có sức hoặc mass selection), chọn lọc giữa các gia
sinh trưởng tốt và khả năng chống chịu tốt đình (between family selection), chọn lọc
với nhiệt độ thấp hay việc chế tạo ra các kít trong từng gia đình (within family selection) và
chẩn đoán bệnh tôm. Để nâng cao chất lượng chọn lọc kết hợp (combined family selection).
di truyền cho các đối tượng thủy sản, có thể Mỗi phương pháp có những ưu điểm nhất định
kết hợp phương pháp truyền thống và phương tùy thuộc vào bản chất của những tính trạng
pháp hiện đại. Phương pháp truyền thống có chọn lọc và nguyên liệu ban đầu cho chương
thể kể đến là lai xa, hay điều khiển giới tính. trình chọn giống (Gjerde,1993; Falconer và
Cấy chuyển gen hay thao tác nhiễm sắc thể Mackay, 1996; Bourdon, 1999; Gjedrem,
và ứng dụng công nghệ sinh học nói chung, 2005). Chọn giống có thể trở nên phức tạp nếu
sinh học phân tử nói riêng được biết đến như mục đích chính là tạo ra các quần đàn cho năng
phương pháp hiện đại. Trong đó, chỉ thị phân suất cao ở nhiều môi trường nuôi. Thực tế, một
tử được dùng như một công cụ hữu hiệu trong số dòng/loài thủy sản có kiểu hình thể hiện tốt
các nghiên cứu về định danh loài, đánh giá đa hơn trong những điều kiện nhất định và tính
dạng di truyền, tìm hiểu quan hệ huyết thống, trạng khác tốt hơn trong điều kiện khác. Điều
lập bản đồ gen và trong các nghiên cứu về này được biết đến như là mối tương tác kiểu
bệnh trên động vật thủy sản phục vụ cho nghề gen - môi trường. Do đó việc chọn lọc ở những
nuôi. điều kiện cụ thể là cần thiết.
II. ỨNG DỤNG CỦA DI TRUYỀN TRONG Ở nước ta, trong những năm gần đây, các
NUÔI TRỒNG THỦY CHỌN GIỐNG chương trình chọn giống trong thủy sản được
Trong một chương trình chọn giống tập trung tập trung cho cá tra (Pangasianodon
truyền thống, những cá thể và các gia đình hypophthalmus), cá rô phi (Oreochromis
được chọn theo những tính trạng quan trọng niloticus), cá giò (Rachycentron canadum),
để cải thiện giá trị của quần thể trong (các) thế tôm thẻ chân trắng (Lipopenaeus vannamei),
1
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1.
*Email: thuyha@ria1.org
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 3
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
tôm sú (Penaeus monodon) và cua xanh được những kết quả khả quan. Chẳng hạn lai
(Scylla paramamosain). Việc sử dụng chỉ thị cá trê phi (Clarias gariepinus) đực và cá trê
phân tử để đánh giá nguồn vật liệu ban đầu vàng (Clarias macrocephalus) cái cho con lai
là rất cần thiết bởi sẽ cung cấp thông tin về vừa tăng trưởng nhanh giống bố, vừa thịt ngon
tính đa dạng kiểu gen cũng như mức độ thuần giống mẹ hay lai cá cái rô phi vằn Israel với cá
chủng của nguồn vật liệu ban đầu. Chỉ thị phân đực rô phi xanh Israel và cá cái rô phi vằn cho
tử microsatellite, dựa trên sự khác biệt độ dài tỷ lệ cá đực cao và có triển vọng trong thực tiễn
của các đoạn lặp khoảng 2 -5 cặp nucleotide, sản xuất. Bên cạnh đó, việc lai tạo khác loài
thường được sử dụng trong các chương trình trên cá biển cũng thu được những kết quả đáng
này. Các vị trí microsatellite thể hiện tính đa ghi nhận qua việc lai cá song vua (Epinephelus
hình cao, phong phú trong hệ gen và là chỉ thị lanceolatus) với cá song hổ (Epinephelus
đồng hợp trội. Phân tích đa hình microsatellite fuscoguttatus). Mặc dù vậy, nghiên cứu theo
được dựa vào kỹ thuật PCR, chỉ cần một lượng hướng này trên hàu (Crassostrea sp.) và các
nhỏ mô, ví dụ từ vẩy cá, là đủ lượng DNA cho cá có giá trị kinh tế khác cần được nghiên cứu
nghiên cứu (Goldstein và Schlotter, 1999; Liu và quan tâm hơn nữa nhằm tạo ra các con lai
và ctv., 2001; Zane và ctv., 2005; Alam và có ưu thế lai giúp năng cao năng suất và hiệu
Islam, 2005; Boris và ctv., 2011). quả kinh tế.
Mục đích của chọn giống là để cải thiện THAO TÁC NHIỄM SẮC THỂ
di truyền và cung cấp những con giống tốt Đối với nghiên cứu áp dụng thao tác
phục vụ nuôi trồng thủy sản. So với các động nhiễm sắc thể, các dòng thuần và các quần đàn
vật khác, chọn giống trên các đối tượng thủy đơn tính hoặc vô sinh trong nuôi trồng thủy
sản ở nước ta đã có những thành tựu đáng sản đã được sản xuất. Phương pháp can thiệp
ghi nhận trên cá chép (C. carpio), cá rô phi vào nhiễm sắc thể nhằm tạo dòng đơn tính đực
(O. niloticus), cá tra (P. hypophthalmus), hoặc đơn tính cái và tạo đa bội thể (tam bội
tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm sú (P. hoặc tứ bội thể) đã được ứng dụng cho nhiều
monodon). Trong tương lai, chọn giống vẫn loài cá và loài nhuyễn thể. Dòng đơn tính cái
còn nhiều tiềm năng trong việc nâng cao năng cũng có thể được sử dụng để sản suất quần
suất, khả năng chống bệnh, chất lượng sản đàn toàn cái trong loài với con cái chỉ mang
phẩm cho đối tượng nuôi trồng thủy sản. nhiễm sắc thể quy định tính cái và xác định
LAI XA nguyên lý hình thành giới tính trên cá. Dòng
Lai xa nhằm cải thiện hiệu suất so đơn tính đực có thể sản xuất quần đàn toàn đực
với loài bố mẹ. Lai giữa 2 loài khác nhau có giá trị thương mại trong nuôi trồng thủy
(hybridization) hoặc giữa các dòng khác biệt sản. Phương pháp này cũng còn được sử dụng
trong cùng một loài (crossbreeding) tạo nên trong việc tạo dòng thuần và phục hồi những
những tổ hợp allele mới tại mỗi locus. Đôi kiểu hình bị mất do quá trình bảo quản tinh
khi, những tổ hợp allele mới này có thể ngẫu đông lạnh. Những cá thể đơn tính đực đã được
nhiên gây ra sự tương tác để những tính trạng sản xuất trong một số loài thuộc họ cá chép
tốt được biểu hiện. Lai tạo là một phương (Cyprinidae), họ cá rô phi (Cichlidae) và họ
pháp chọn giống hiệu quả chỉ khi con lai thể cá hồi (Salominidae).
hiện dị hợp tử (Bourdon, 1999; Lakra, 2001; Tạo đa bội thể là việc sản xuất những
Gjedrem, 2005). cá thể với bộ nhiễm sắc thể nhiều hơn bình
Theo hướng này, nghiên cứu trên cá thường (2n). Cá thể đa bội được tạo ra bằng
nước ngọt ở nước ta đã được triển khai và thu cách xử lý hợp tử bằng các tác nhân gây đột
biến như áp suất thủy tĩnh, nhiệt độ hoặc hóa
4 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
chất. Ngay sau khi trứng được thụ tinh, nếu Ở nước ta, có thể kể đến cá rô phi (O.
dùng một trong các tác nhân này tác động vào niloticus) và cá hồi vân (O. mykiss), với các
giai đoạn trung kỳ của một trong hai lần giảm công nghệ sử dụng hormone để chuyển giới
phân có thể thu được các thể tam bội. Còn nếu tính, từ cá cái thành cá đực (cá rô phi) hoặc
tác động vào giai đoạn tiền kỳ nguyên phân ngược lại từ cá đực thành cá cái (cá hồi vân)
của hợp tử sẽ cho dạng tứ bội (Beaumont và để phục vụ nuôi trồng thủy sản cho năng suất
Hoare, 2003; Komen và Thorgaard, 2007). và hiệu quả cao. Thành công về điều khiển
Ở nước ta, việc thử nghiệm sản xuất cá giới tính hai đối tượng này đã đóng góp những
thể tam bội đối với đối tượng thủy sản đã được thành tựu lớn về năng suất, sản lượng cũng như
quan tâm. Cá thể tam bội thường vô sinh và hiệu quả kinh tế. Phương pháp di truyền cũng
trong nhiều trường hợp, có sức sinh trưởng đã giúp điều khiển giới tính trên tôm càng xanh
tốt hơn các thể lưỡng bội. Động vật thủy sản (Macrobrachium rosenbergii). Bằng phương
thân mềm như hàu cửa sông (Crassostrea pháp vi phẫu cắt bỏ tuyến androgenic, tôm cái
rivularis) đã được tập trung nghiên cứu tam giả đã được tạo ra và lai với tôm đực khác để
bội thể và có những dấu hiệu thành công bước tạo ra quần đàn tôm càng xanh toàn đực.
đầu. Bên cạnh đó, các đối tượng cá như cá tra CẤY CHUYỂN GEN
(P. hypophthalmus) và cá rô phi (O. niloticus) Kỹ thuật chuyển gen nhằm đưa một số
cũng đã được thử nghiệm tạo tam bội thể ở bản copy của gen tiềm năng vào trứng mới thụ
quy mô nhỏ. Việc phát triển đàn bố mẹ tứ bội tinh với mục đích hợp nhất DNA lạ với hệ gen
phục vụ cho việc lai tạo với đàn lưỡng bội để của phôi đang phát triển. Bằng việc đưa những
sản xuất tam bội thể cũng đã và đang được tính trạng di truyền mong muốn vào động
quan tâm. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng vật thủy sản, những đối tượng được chuyển
của quần đàn tam bội cần được quan tâm hơn gen tốt có thể được sản xuất trong nuôi trồng
nữa để giúp thúc đẩy phát triển các đối tượng thủy sản. Những tính trạng này bao gồm tốc
này theo hướng thương mại hóa. độ tăng trưởng nhanh, tiêu hóa thức ăn hiệu
ĐIỀU KHIỂN GIỚI TÍNH quả, chịu đựng nồng độ oxy hòa tan thấp và
Việc sử dụng kỹ thuật điều khiển giới nhiệt độ không tối ưu. Trong đó, tốc độ tăng
tính để tác động lên những loài có giá trị kinh trưởng là tính trạng được quan tâm nhiều nhất
tế cao đang trở thành một công cụ quan trọng do khả năng ứng dụng vào thực tiễn cao. Mặc
nhằm tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản. Công dù công nghệ cấy chuyển gen có tiềm năng rất
nghệ này cho phép sản xuất các quần đàn đơn lớn trong nuôi trồng thủy sản, ở Việt Nam các
tính và là công cụ tiềm năng cho những loài nghiên cứu theo hướng này còn nhiều hạn chế.
mà một giới tính có giá trị hơn giới tính còn Các nghiên cứu theo hướng này được biết đến
lại. Có hai phương pháp cơ bản của kỹ thuật là chuyển tổ hợp gen hormone sinh trưởng vào
điều khiển giới tính là sử dụng hormone và cá cảnh thuộc họ Cyprinidae và cá chạch bùn
thao tác di truyền. Sử dụng hormone hay điều (Misgurnus anguillicaudatus). Với một số kết
khiển nội tiết tố đồng nghĩa với việc tập trung quả bước đầu đã đạt được, việc nghiên cứu tạo
vào xử lý hợp chất steroid trong suốt giai đoạn cá chuyển gen cần được tiếp tục tiến hành. Để
đầu đời trước khi hình thành giới tính của đối phát triển và ứng dụng ở quy mô thương mại,
tượng thủy sản. Thao tác di truyền giúp can các đối tượng chuyển gen cần được kiểm tra
thiệp giới tính để sản xuất quần đàn toàn cái, và một số vấn đề xã hội và kinh tế cần được
toàn đực hoặc vô sinh được coi như phương giải trình cụ thể.
pháp đa bội. Việc xác định giới tính có thể Những phát triển gần đây trong sinh học
thông qua di truyền phân tử. phân tử ví dụ như PCR (Polymerase Chain
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 5
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
Reaction), giải trình tự tự động, dự án lập bản đa dạng di truyền của các quần thể cũng như
đồ gen để phục vụ cho những nghiên cứu phát đánh giá biến dị di truyền của các nguồn vật
triển xa hơn trong nghiên cứu chuyển gen đối liệu thuộc các chương trình chọn giống cá tra
với các loài thủy sản. (P. hypophthalmus), cá rô phi (O. niloticus),
III. VAI TRÒ CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ cá giò (R. canadum), tôm thẻ chân trắng (P.
TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN vannamei), tôm sú (P. monodon) và cua xanh
Với những kết quả khiêm tốn đã đạt (S. paramamosain).
được, vai trò của sinh học phân tử trong nuôi Những ứng dụng quan trọng khác của
trồng thủy sản dần được khẳng định. Trong đó, sinh học phân tử tới nuôi trồng thủy sản cũng
chỉ thị phân tử được coi là công cụ hữu hiệu liên quan đến sản xuất cá chuyển gen. Đánh
với nhiều ứng dụng. Chẳng hạn có thể dùng giá độ thích ứng, biểu hiện và sự cấy chuyển
chỉ thị phân tử để định danh cá thể giúp xác tế bào mầm của những gen đưa vào hoàn toàn
định đúng tên khoa học và phân loại chính xác phụ thuộc vào công nghệ DNA. Thêm vào đó,
đến loài. Trong các nghiên cứu này, DNA ty sinh học phân tử dựa trên kỹ thuật PCR được
thể đã cung cấp những thông tin có giá trị để sử dụng nhiều trong chuẩn đoán và kiểm soát
trả lời câu hỏi về phát sinh loài, tiến hóa và cấu bệnh trên động vật thủy sản. Ở nước ta, việc
trúc quần thể. Trong nghiên cứu về đa dạng di chế tạo các bộ kít thử dựa trên nền tảng công
truyền, phả hệ hoặc đánh giá chất lượng các nghệ sinh học cao cho phép xác định các nhân
quần đàn bố mẹ trong các chương trình chọn tố gây bệnh và kiểm soát bệnh ở mức độ chính
giống, chỉ thị phân tử đã thể hiện nhiều tính xác cao đã được thử nghiệm. Bên cạnh đó, việc
ưu việt (Wolfus và ctv., 1997; Valles- Jiménez nghiên cứu và sản xuất vắc xin để bảo vệ nhiều
và ctv., 2005; Perez-Enriquez và ctv., 2009; loài cá có giá trị kinh tế cao cũng đã được chú
Artiles và ctv., 2011). Bên cạnh đó, chỉ thị trọng. Tuy nhiên, để ứng dụng rộng rãi trong
phân tử giúp đánh dấu các cá thể trong quần thực tế, những nghiên cứu sâu với quy mô lớn
đàn nghiên cứu cũng như phân biệt cá thể giữa cần được quan tâm hơn nữa.
các gia đình. IV. KẾT LUẬN
Một ứng dụng mạnh mẽ của công nghệ Kỹ thuật di truyền đã đóng góp cho các
DNA là tìm ra mối liên kết giữa chỉ thị phân chương trình chọn giống và nâng cao năng
tử và gen liên quan đến các tính trạng quan suất và sản lượng đối tượng thủy sản cũng như
trọng (Quantitative Trait Loci hay QTLs). trợ giúp trong chuẩn đoán, điều trị và phòng
Khi những chỉ thị này được xác định, chương ngừa các bệnh ở động vật thủy sản. Ứng dụng
trình chọn giống sẽ được hỗ trợ đắc lực (Liu công nghệ sinh học đã đem lại cho các nhà
và Cordes, 2004; Chauhan và Rajiv, 2010). khoa học những kiến thức và công cụ mới để
Những nỗ lực trong suốt những năm vừa qua có thể đạt những kết quả nghiên cứu tốt hơn
đã được cống hiến cho việc phát triển chỉ thị và hiệu quả hơn. Ở nước ta, việc ứng dụng
phân tử cho nhiều loài thủy sản và hỗ trợ trực các công nghệ sinh học phân tử và các chiến
tiếp cho các nghiên cứu QTLs. Bên cạnh đó, lược chọn giống mới cho động vật thủy sản đã
chỉ thị phân tử cũng được sử dụng như một được quan tâm song còn thiếu những nghiên
công cụ mạnh, khẳng định sự thành công trong cứu dài hạn, thiếu cách hoạt động phù hợp, giá
can thiệp nhiễm sắc thể. Đối với nghiên cứu trị thương mại thấp và chưa lựa chọn được môi
theo các hướng này, ở nước ta đã và đang trường sản xuất phù hợp. Công nghệ mới đem
thực hiện các chương trình liên quan đến đến nhiều cơ hội để phát triển thủy sản nhưng
định danh loài bằng chỉ thị phân tử, tìm hiểu cũng tạo ra thách thức mới cho các lĩnh vực
nghiên cứu phục vụ nuôi trồng thủy sản.
6 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TÀI LIỆU THAM KHẢO Komen, H., and Thorgaard, G.H., 2007.
Alam, S., and Islam, S., 2005. Population genetic Androgenesis, gynogenesis and the
structure of Catla catla (Hamilton) revealed production of clones in fishes: a review.
by microsatellite DNA markers. Aquaculture Aquaculture 269, 150-173.
246, 151-160. Lakra, W.K., 2001. Genetics and Molecular
Artiles, A., Rodríguez, I., Pérez, A., Pérez, L., and Biology in Aquaculture - Review. Asian-
Espinosa, G., 2011. Low genetic variability Australasian Journal of Animal Sciences
in the fifth introduction of Litopenaeus 14(6), 894-898.
vannamei in Cuba, as estimated with Liu, Z.J. and Cordes, J.F., 2004. DNA marker
microsatellite markers. Biotecnologia technologies and their applications in
Aplicada. 28, 147-150. aquaculturegenetics. Aquaculture 242(1-4),
Beaumont, A.R., and Hoare, K., 2003. 735-736.
Biotechnology and Genetics in Fisheries and Liu, Z.J., Li, P., Kocabas, A., Ju, Z., Karsi, A., Cao,
Aquaculture. Oxford: Blackwell Science. D., and Patterson, A., 2001. Microsatellite
Boris, B., Xenia, C.O., and Marcel, S.V., 2011. containing genes from the channel catfish
Genetic diversity of six populations of red brain: evidence of trinucleotide repeat
hybrid tilapia, using Microsatellite genetic expansion in the coding region of nucleotide
Markers. Rev. MVZ Cordoba 16 (2), 2491- excision repair gene RAD23B. Biochem.
2498. Biophys. Res. Commun. 289, 317-324.
Bourdon, M. R., 1999. Understanding Animal Perez-Enríquez, R., Hernández-Martínez, F., and
Breeding, 2nd edition. Cruz, P., 2009. Genetic diversity status
Chauhan, T., and Rajiv, K., 2010. Molecular of White shrimp Penaeus (Litopenaeus)
markers and their applications in fisheries vannamei broodstock in Mexico. Aquaculture
and aquaculture. Advances in Bioscience 297, 44-50.
and Biotechnology1, 281-291. Wolfus, G.M., Garcia, O.K., and Alcivar-Warren,
Falconer, D.S., and Mackay, T.F.C., 1996. A., 1997. Application of the microsatellite
Introduction to Quantitative Genetics. technique for analyzing genetic diversity in
Longman, Essex, U.K., 4th ed. shrimp breeding programs. Aquaculture 152,
Gjedrem, T., 2005. Selection and breeding 35-47.
programs in aquaculture. Springer ISBN-10 Zane, L., Bargelloni, L., and Pataenello, T., 2002.
1-4020-3341-9. 364p. Strategies for microsatellite isolation: a
Gjerde, B., 1993. Breeding and Selection. In: review. Mol. Ecol. 11,1-16.
Salmon Aquaculture. Fishing News Books.p. Valles-Jiménez, R., Cruz, P., and Perez-Enriquez,
278 p. R., 2005. Population genetic structure of
Goldstein, D.B., and Schlotterer, C., 1999. Pacific White shrimp (Litopenaeus vannamei)
Microsatellites: Evolution and application. from Mexico to Panama: microsatellite ADN
Oxford uni. Press. variation. Mar. Biotechnol. 6, 475-484.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 7
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY IN AQUACULTURE
Tran Thi Thuy Ha1*, Luu Thi Ha Giang1
ABSTRACT
In recent years, the advance in genetics and molecular biology of aquatic animals has
provided useful information and has been applied in aquaculture. The roles of modern
genetic manipulations and biotechnological innovations to aquaculture have been realized.
This article reviews some points of the applications of genetics in breeding, hybridization,
chromosome engineering, sex control, gene transfer and molecular technologies for enhanced
aquaculture productivity in Vietnam.
Keywords: aquaculture, genetics, molecular biology.
Người phản biện: TS. Trịnh Quốc Trọng
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015
Ngày duyệt đăng: 07/8/2015
1
Research Institute for Aquaculture No 1
*Email: thuyha@ria1.org
8 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
LẮP RÁP, CHÚ GIẢI VÀ PHÂN TÍCH HỆ PHIÊN MÃ TÔM SÚ
Penaeus monodon
Nguyễn Cường1*, Phạm Quang Huy1, Nguyễn Văn Lâm1, Hà Thị Thu1, Phạm Thị Hoa1,
Nguyễn Hải Triều1, Đậu Huy Tùng1, Nguyễn Giang Thu2, Nguyễn Hữu Ninh3,
Đồng Văn Quyền1, Chu Hoàng Hà1, Đinh Duy Kháng1
TÓM TẮT
Tôm sú (Penaeus monodon) là loài thủy sản đem lại nguồn lợi lớn cho quốc gia trong những năm
gần đây. Tuy nhiên, các dữ liệu về hệ gene và hệ phiên mã của chúng còn hạn chế. Mặc dù công
việc gia hóa sử dụng các biện pháp di truyền chọn giống đã nâng cao chất lượng tôm sú. Tuy
nhiên, nhu cầu giải mã và phân tích hệ gene, hệ phiên mã của của tôm sú để tìm ra các chỉ thị phân
tử cũng như các dữ liệu quan trọng khác sẽ giúp tăng hiệu suất cho quá trình chọn giống. Trong
bài báo này, chúng tôi công bố kết quả giải trình tự hệ phiên mã của tôm sú bằng công nghệ đọc
trình tự thế hệ mới. Với 9 Gb dữ liệu thu được từ máy Illumina MiSeq, chúng tôi tiến hành lắp ráp
de novo để tạo ra ngân hàng với 51.638 transcript, từ đó thực hiện chú giải chức năng transcript,
phát hiện được 7.016 chỉ thị phân tử microsatellite và 17.783 SNP. Chúng tôi xây dựng hệ thống
website quản lý các ngân hàng transcript cũng như các công cụ phân tích cần thiết. Kết quả của
bài báo là tiền đề cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về loài tôm sú mang lại nguồn lợi lớn này.
Từ khóa: hệ phiên mã, lắp ráp de novo, giải trình tự thế hệ mới, chú giải, biểu hiện gene, microsat-
ellite, SNP.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ tử để nâng cao năng suất nuôi về tính trạng
Động vật giáp xác chiếm 10% tổng sản tăng trưởng và kháng bệnh là rất cần thiết.
lượng thủy sản của cả thế giới và là một trong Hiện nay, nguồn dữ liệu về tôm sú P.
những lĩnh vực nuôi trồng thủy sản tăng trưởng monodon còn khá khiêm tốn (Andriantahina và
nhanh nhất (trung bình 15% hằng năm từ năm ctv., 2013). Trên ngân hàng Genbank có tổng
1970 và đạt 5 triệu tấn vào năm 2008 (FAO, cộng 39.908 EST được ứng dụng vào tìm các
2010). Trong đó, tôm là sản phẩm thủy sản điểm đa hình (ví dụ như SNP) và có khoảng
có giá trị nhất trong nhóm này và được nuôi 600 trình tự microsatellite (cập nhật tháng 10
trồng ở Việt Nam hiện nay là tôm sú Penaeus năm 2013). Trong khi đó, P. monodon có 44
monodon. Mặc dù là ngành sản xuất nuôi trồng nhiễm sắc thể với kích thước hệ gene lớn là
thủy sản đem lại nguồn lợi lớn cho quốc gia ~2,17 Gb (You EM và ctv., 2010).
nhưng ngành sản xuất này vẫn bị ảnh hưởng Với sự ra đời và phát triển không ngừng
nặng nề bởi thiên nhiên nhất là dịch bệnh như của công nghệ đọc trình tự thế hệ mới Next
là dịch đốm trắng (WSSV). Do đó, nhu cầu Generation Sequencing (NGS), công suất đọc
nghiên cứu sâu hơn về hệ gene và các marker trình tự có thể lên tới từ 8 Gb cho đến 600 Gb,
phân tử hỗ trợ chọn giống dựa vào chỉ thị phân cho phép đọc trình tự nguyên bộ gene với mức
1
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam
*Email: cuongnguyen@ibt.ac.vn
2
Vụ Khoa học Công nghệ & Môi trường, Bộ NN&PTNT
3
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, Bộ NN&PTNT
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 9
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
độ lặp rất lớn lên tới cả 100x. Hơn nữa, chi phí trinityrnaseq.sourceforge.net/) (Grabherr và
đọc trình tự và thời gian đọc trình tự của cả hệ ctv., 2011) với các tham số mặc định. Để đánh
gene cũng đã giảm đi đáng kể và có thể thực giá chất lượng lắp ráp chúng tôi đưa ra 3 tiêu
hiện được ở các phòng thí nghiệm có quy mô chí: N50, phân bố độ dài của các transcript và
trung bình. Do đó, NGS là một công cụ mạnh số lượng trình tự đọc được ánh xạ ngược trở
để có thể giải trình tự toàn bộ hệ gene hoặc hệ lại hệ phiên mã tham chiếu.
phiên mã của một loài nào đó từ đó có thể ứng 2.2.2. Chú giải và phân loại transcript trong
dụng rất nhiều trong phân tích sinh học phân hệ phiên mã
tử như đánh giá biểu hiện gene, phát hiện chỉ Chú giải chức năng cho các transcript
thị phân tử, phân tích SNP/InDel,... hoặc ứng trong hệ phiên mã đòi hỏi phải sử dụng những
dụng trong chuẩn đoán bệnh. thuật toán tìm kiếm tương đồng trên các cơ sở
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đọc trình dữ liệu protein quan trọng. Trong nghiên cứu
tự hệ phiên mã của tôm sú Penaeus monodon, này, chúng tôi sử dụng công cụ BLAST+ với
tiến hành lắp ráp de novo để thu được ngân chế độ BLASTX để so sánh toàn bộ transcript
hàng các transcript. Từ đó, chúng tôi tiến hành lên các cơ sở dữ liệu NCBI non-redundant
chú giải các transcript thu được, phân tích protein (Nr, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),
biểu hiện gene, tìm kiếm các chỉ thị phân tử Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot) với
microsatellite và phát hiện các chỉ thị SNP. tham số E-value là 1e-6. Trong trường hợp kết
Chúng tôi cũng tiến hành xây dựng hệ thống quả chú giải trên các cơ sở dữ liệu là khác nhau
phần mềm quản lý ngân hàng các transcript thì thứ tự ưu tiên kết quả chú giải các vùng
cùng với các công cụ phân tích cần thiết. mã hóa protein là Nr, Swiss-Prot. Kết quả chú
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP giải từ ngân hàng Nr sau đó được phần mềm
NGHIÊN CỨU Blast2GO (Conesa và ctv., 2005) sử dụng để
2.1. Vật liệu lấy ra mã Gene Ontology (GO) riêng biệt cho
Một cá thể tôm sú Penaeus monodon được mỗi transcript. Toàn bộ transcript trong hệ phiên
lấy từ vùng nuôi trồng thủy sản Ninh Thuận, mã sẽ được ánh xạ vào các mã GO và phân loại
sau đó mô tim của cá thể này được đem đi tách dựa vào 3 hạng mục: quá trình sinh học, thành
chiết mRNA tổng số và đọc trình tự trên máy phần tế bào và phân tử chức năng. Hơn thế nữa,
giải trình tự thế hệ mới Illumina Miseq. từ số liệu gene ontology, mỗi một transcript
sau khi chú giải sẽ được gán các mã số enzyme
2.2. Phương pháp commission (EC code) tương đương.
2.2.1. Lắp ráp de novo hệ phiên mã 2.2.3. Phân tích biểu hiện gene trong mô tim
Dữ liệu trình tự đọc sau khi được giải Trình tự đọc đã tinh sạch từ thư viện mô
trình tự sẽ được tiền xử lý để loại bỏ adaptor và tim sẽ được ánh xạ ngược trở lại hệ phiên mã
trình tự xấu có chất lượng thấp và độ dài ngắn. vừa lắp ráp sử dụng Bowtie2 (http://bowtie-
Những trình tự đọc có chất lượng base thấp bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)
(chất lượng QC2%) hoặc bị dính adaptor mặc định. Tổng số lượng trình tự đọc ánh xạ
sẽ được loại bỏ bằng công cụ được đánh giá được vào mỗi transcript sẽ được đếm xem xuất
rất cao Trimmomatic (http://www.usadellab. hiện (biểu hiện) bao nhiêu lần trong mô tim bằng
org/cms/?page=trimmomatic). Những trình tự công cụ SAMtools (http://samtools.sourceforge.
đọc chất lượng tốt từ mô tim được lắp ráp để net/) (Li và ctv., 2009). Việc đếm những trình tự
tạo nên hệ phiên mã bao gồm các transcript đọc như thế này được tiêu chuẩn hóa theo đơn
của tôm sú bằng phần mềm Trinity (http://
10 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
vị RPKM (reads per kilobase of transcripts per mẫu nhiễm trình tự lạ chúng tôi áp dụng các
million fragments mapped). Toàn bộ các phần tham số sau: chỉ lấy những trình tự đọc có chất
mềm phân tích biểu hiện trên đều được tích hợp lượng ánh xạ lớn hơn 20, tần số alen của biến
với tham số mặc định trong chương trình viết bởi dị phải lớn hơn 0,1 và độ sâu tối thiểu của alen
ngôn ngữ Perlrun_RSEM_align_n_estimate.pl biến dị phải lớn hơn 10.
có trong gói phần mềm Trinity. III. KẾT QUẢ
2.2.4. Phát hiện microsatellite marker và 3.1. Lắp ráp de novo và đánh giá chất lượng
SNP marker trong ngân hàng transcript lắp ráp
Từ các transcript đã lắp ráp, phần Mẫu mô tim từ một cá thể tôm nuôi từ
mềm MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben. vùng nuôi trồng thủy sản Ninh Thuận. Tổng
de/misa/) (Thiel và ctv., 2003) sẽ tìm kiếm cộng 45.063.432 trình tự đọc thô được giải
các microsatellite tiềm năng có miền trong trình tự theo phương pháp paired-end từ máy
khoảng từ di- cho đến hexanucleotide. Giá giải trình tự Illumina MiSeq với độ dài từ 35-
trị lặp nhỏ nhất cho mỗi miền bao gồm: 8 đối 200 bp. Sau khi tiền xử lý thu được 40.313.722
với dinucleotide, sáu cho tri-, năm cho tetra-, trình tự có chất lượng tốt với độ dài trong
bốn cho penta- và ba cho hexanucleotide. Với khoảng 70-200 bp (đạt tỉ lệ 89,46%).
trường hợp microsatellite là mononucleotide Từ dữ liệu trình tự đọc đã được tiền xử
thì không được nghiên cứu vì rất khó để có lý, chúng tôi sử dụng phần mềm Trinity để lắp
thế phân biệt được mononucleotide thật sự ráp de novo hệ phiên mã và thu được 51.638
từ những vùng polyadenylation hay đó chỉ là transcript có độ dài trung bình 531,24 bp và
mononucleotideđược tạo ra do lỗi giải trình tự. N50 là 726 bp. Phân bố độ dài của các tran-
Các trình tự transcript bên cạnh đó cũng script được mô tả như trong (Hình 1) cho thấy
sẽ được khai phá các marker đa hình đơn phần lớn các transcript có kích thước nhỏ
nucleotide SNP. Chúng tôi ánh xạ các trình (73,94% contig có độ dài từ 200-500 bp). Tuy
tự đọc ngược trở lại vào hệ phiên mã tham nhiên có đến 93,66% số lượng read được sử
chiếu vừa lắp ráp bằng phần mềm Bowtie2. dụng cho lắp ráp de novo với độ sâu của toàn
Kết quả ánh xạ sẽ được 2 công cụ SAMtools bộ hệ phiên mã sau lắp ráp là 139X. Từ 3 tiêu
và VarScan (http://varscan.sourceforge.net/) chí là N50, số lượng trình tự đọc sử dụng cho
(Koboldt và ctv., 2012) xử lý để tìm ra các loci lắp ráp và phân bố độ dài cho thấy chất lượng
tiềm năng bị thay đổi nucleotide. Để sàng lọc lắp ráp de novo là tốt.
kết quả dương tính giả do lỗi giải trình tự hoặc
Bảng 1. Thống kê số liệu dữ liệu thô và sau khi tiền xử lý
Số lượng trình tự đọc Độ dài %GC % Tiền xử lý
Mô tim 45.063.432 35-200 59
Mô tim – tinh sạch 40.313.722 70-200 59 89,46%
Chú giải chức năng cho hệ phiên mã transcript được chú giải chức năng (Hình 2).
Sử dụng công cụ BLAST với chế độ Vì độ dài trung bình của transcript sau khi lắp
BLASTX tìm kiếm những transcript vừa lắp ráp khá ngắn (độ dài N50 dài 726 bp) và không
ráp trên cơ sở dữ liệu nr NCBI với tham số có hệ gene tham chiếu tôm sú nên sẽ có một
E-value 1e-6, chúng tôi đã tìm được 14.601 lượng lớn transcript không thể chú giải chức
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 11
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
năng. Phân bố E-value cho những kết quả tin chiếm 21,1%. Trong khi đó 99,9% transcript
cậy nhất thể hiện các transcript được chú giải có độ tương đồng lớn hơn 40% và 0,01% tran-
có độ tin cậy rất cao (E-value nhỏ hơn 1e- script có độ tương đồng từ 40% đến 15%.
15) và dải E-value phân bố từ 1e-15 đến 1e-5
Bảng 2. Thống kê chất lượng transcript sau khi lắp ráp de novo
Tổng số Transcript Transcript Average N50 N10 %GC Tổng số base % trình tự đọc sử
transcript ngắn nhất dài nhất dụng
Mô tim 51.638 201 15.659 531,24 726 3.273 49,81 27.432.242 37.760.643
(93,66%)
Hình 1. Phân bố độ dài của toàn bộ tran- Hình 2. Thống kê kết quả chú giải lên cơ
script sau khi lắp ráp sở dữ liệu NCBI
Hình 3. Thống kê loài từ kết quả
Tophit BLASTX
Phân bố kết quả có độ tương đồng cao tôm sú trên cây phân loài của NCBI trong khi
nhất từ cơ sở dữ liệu NR của NCBI được xây đó kết quả ứng với tôm sú Penaeus monodon
dựng thành cây phân loài, chỉ ra rằng loài đứng thứ 6 với 330 kết quả (Hình 3).
Daphnia pulex chiếm đa số và cũng đứng gần
12 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
3.2. Phân tích biểu hiện trong mô tim tính theo công thức như sau:
RPKM là một đơn vị biểu hiện thể hiện Số lượng read bám vào transcript
mức độ biểu hiện của từng transcript/contig RPKM =
(Độ dài transcript) x (Tổng số read)
đối với một hệ phiên mã hoàn chỉnh và được
Do đó, chúng tôi đưa ra sơ đồ phân bố transcript trong đó có 3.551 transcript có nhiều
biểu hiện cho toàn bộ các transcript của mô hơn một microsatellite và 2.759 microsatellite
tim trong Hình 4. Những transcript có mức ở dạng compound (Bảng 3). Trong số các
độ biểu hiện cao trong mô tim (6,22% toàn bộ microsatellite được tìm thấy chiếm số lượng
transcript) là những transcript tiềm năng đặc nhiều nhất là dinucleotide (42%) và trinucleotide
hiệu cho riêng mô tim và sẽ được nghiên cứu (52,8%), theo sau đó là tetra- (4,97%), hexa-
sâu hơn. (0,16%) và pentanucleotide (0,06%) (Bảng
3.3. Khai phá dữ liệu microsatellite và SNP 4). Trong dinucleotide microsatellite, miền lặp
Toàn bộ transcript trong hệ phiên mã mô nhiều nhất là AG/CT (45,6%), theo sau là miền
tim tôm sú được khai phá để tìm các locus đa lặp là AC/GT (35,52%). Còn với trinucleotide
hình bao gồm microsatellite và SNP, 18.838 microsatellite, miền lặp nhiều nhất là AGG/
microsatellite được tìm thấy trong 13.965 CCT (21,3%), theo sau là miền lặp AGC/CTG
(16,95%).
Bảng 3. Kết quả tìm kiếm microsatellite Bảng 4. Phân bố miền lặp microsatellite
Tổng số transcript thực hiện 51.638 Miền lặp Số lượng microsatellite
Độ dài tổng số của toàn bộ transcript 27.432.242 2 2.947
Tổng số microsatellite được phát hiện 7.016 3 3.705
Số lượng transcript có microsatellite 5.711
4 349
Số lượng transcript có nhiều hơn 1 micro- 883
satelltite
5 4
Số lượng microsatellite ở dạng compound 710 6 11
Hình 4. Thống kê mức độ biểu hiện giữa các Hình 5. Thống kê các miền lặp trong hệ phiên
transcript trong mô tim mã mô tim tôm sú
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 13
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
Hình 6. Tỉ lệ transition (AG hoặc CT)
và transversion (AT, CG) trong các Hình 7. Phân bố tần số thay đổi alen trên các
SNP tiềm năng SNP tiềm năng
Các tham số được điều chỉnh trong các SNP) (Hình 6). Phân bố của tần số thay đổi alen
phần mềm Bowtie2, SAMtools và VarScan, cũng cho thấy phần lớn SNP tiềm năng có tần
cùng với đó do hệ phiên mã được xây dựng từ số nằm trong khoảng từ 30 đến 50% (Hình 7).
một cá thể tôm nên chúng tôi nhắm đến các vị 3.4. Phần mềm quản lý ngân hàng transcript
trí có tần số thay đổi alen là 50% được coi là Chúng tôi đã xây dựng phần mềm quản
các vị trí dị hợp về alen. Dựa vào đó chúng tôi lý hệ phiên mã tôm sú hoạt động trực tuyến tại
tìm ra được 17.783 SNP tiềm năng trong 6.683 địa chỉ http://tomsu.ibt.ac.vn. Phần mềm cho
transcript với mật độ trung bình là 0,648 SNP phép duyệt và xem chi tiết từng transcript cũng
mỗi một kb. Hầu hết các SNP tiềm năng này như các microsatellite và SNP của chúng.
đều được phân loại vào transition (2/3 tổng số
Hình 8. Giao diện phần mềm quản lý hệ phiên mã tôm sú
14 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
IV. THẢO LUẬN cắt nối intron, sản phẩm gene mới hay phân
Trên thế giới thì tôm sú là loài chưa được tích biểu hiện gene.
xây dựng bản đồ hệ gen hoàn chỉnh từ trước Việc tìm ra một số lượng lớn các vùng
đến nay mặc dù đã có những thông tin về EST microsatellite và SNP sẽ là nguồn chỉ thị phân
trên ngân hàng Genbank của NCBI, do vậy tử hữu ích cho những nghiên cứu trong tương
giải trình tự hệ phiên mã (RNA-seq) là một lai để sàng lọc các tính trạng số lượng trong
hướng đi đúng đắn cho việc khai phá de novo phân tích quần thể và phả hệ. Hệ gene của tôm
những thông tin về hệ gene bên trong tôm sú. sú được coi là có số lượng microsatellite rất
Với phương pháp RNA-seq, chúng ta chỉ cần lớn, lớn hơn cả nhiều động vật có xương sống
một lượng mẫu RNA rất nhỏ là đã đảm bảo và nhiều gấp 4 lần so với hệ gene cá lóc Fugu
chất lượng giải trình tự cho những phân tích (Huang và ctv., 2011; Maneeruttanarungroj và
tin sinh tiếp theo. Sự tiến bộ của công nghệ ctv., 2006). Lý do vì sao số lượng microsatellite
giải trình tự thế hệ mới đi kèm với đó là độ dài trong tôm sú lại nhiều như vậy thì chưa được
trình tự đọc tăng lên cũng như các phần mềm giải thích rõ ràng nhưng có những giả thiết cho
lắp ráp tin sinh học được phát triển sâu hơn rằng chắc chắn microsatellite trong tôm sú có
đã giúp các kết quả phân tính chính xác hơn liên quan đến vai trò bảo toàn những chức
rất nhiều so với trước kia. Lắp ráp de novo hệ năng quan trọng trong tôm sú. Như vậy cần có
phiên mã đã thực sự tạo nên sự đột phá với rất những nghiên cứu sâu hơn về việc kết hợp các
nhiều trình tự được giải mã trên rất nhiều các vùng lặp lại microsatellite trong gene đã biểu
loài khác mà cũng không hề có thông tin hệ hiện với các tính trạng số lượng đã biết của
gene tham chiếu như tôm sú (Meyer và ctv., tôm sú. Nhằm hướng đến việc thiếp lập bản
2009; Nielsen và ctv., 2010; Novaes và ctv., đồ di truyền và khai phá được những thông
2008; Wheat, 2010). tin đa hình của tôm sú một cách chính xác, ở
Chúng tôi thực hiện phân tích ước chừng những nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sẽ tăng
số lượng gene và chú giải chức năng những số lượng mẫu và số lượng mô dùng để tách
gene này cho hệ phiên mã tôm sú bằng công chiết RNA cũng như lấy mẫu ở những vùng
cụ BLAST, kết quả có 71,72% số lượng địa lý khác nhau.
transcript không được chú giải chức năng vì V. KẾT LUẬN
không thể tìm thấy các trình tự tương đồng với Trong nghiên cứu này, từ dữ liệu giải
chúng trên ngân hàng dữ liệu. Để có thể tìm ra trình tự thế hệ mới của mô tim tôm sú nuôi ở
được một trình tự tương đồng có ý nghĩa trên Việt Nam, chúng tôi đã lắp ráp được hệ phiên
ngân hàng dữ liệu có một phần phụ thuộc vào mã bằng phương pháp de novo. Từ dữ liệu đã
độ dài của trình tự cần tìm kiếm, chủ yếu các lắp ráp, trình tự được so sánh trên các cơ sở dữ
trình tự không tìm thấy trên cơ sở dữ liệu có liệu protein của thế giới như Nr NCBI. Cuối
độ dài nhỏ hơn 300 bp, các trình tự có độ dải cùng đã xây dựng được website trực quan
nhỏ thế này rất thường xuyên xuất hiện trong quản lý dữ liệu trình tự, dữ liệu chú giải và
các nghiên cứu của giải trình tự thế hệ mới và dữ liệu phân tích biểu hiện cho tôm sú nuôi ở
việc chú giải chức năng cho chúng vẫn còn Việt Nam. Những dữ liệu này rất có ích cho
rất khó khăn với các phần mềm tin sinh hiện những phân tích tiếp theo đặc biệt là truy tìm
nay (Novaes và ctv., 2008). Tuy nhiên thì các những chỉ thị tiềm năng liên kết với các tính
transcipt không được tìm thấy trên ngân hàng trạng quan trọng trên tôm sú như tăng trưởng
dữ liệu được coi là nguồn thông tin quý giá và kháng bệnh.
cho những nghiên cứu tiếp theo về quá trình
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 15
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
TÀI LIỆU THAM KHẢO Alignment/Map format and SAMtools.
Andriantahina, F., Liu, X., Feng, T., Xiang, J., 2013. Bioinforma. Oxf. Engl. 25, 2078–2079.
Current status of genetics and genomics Maneeruttanarungroj, C., Pongsomboon, S.,
of reared penaeid shrimp: information Wuthisuthimethavee, S., Klinbunga, S.,
relevant to access and benefit sharing. Mar. Wilson, K.J., Swan, J., Li, Y., Whan, V.,
Biotechnol. N. Y. N 15, 399–412. Chu, K.-H., Li, C.P., Tong, J., Glenn, K.,
Conesa, A., Götz, S., García-Gómez, J.M., Terol, Rothschild, M., Jerry, D., Tassanakajon, A.,
J., Talón, M., Robles, M., 2005. Blast2GO: 2006. Development of polymorphic expressed
a universal tool for annotation, visualization sequence tag-derived microsatellites for
and analysis in functional genomics research. the extension of the genetic linkage map of
Bioinforma. Oxf. Engl. 21, 3674–3676. the black tiger shrimp (Penaeus monodon).
Anim. Genet. 37, 363–368.
FAO, 2010. Food and Agriculture Organisation
of the United Nations. The state ofworld Meyer, E., Aglyamova, G.V., Wang, S., Buchanan-
fisheries and aquaculture. Carter, J., Abrego, D., Colbourne, J.K., Willis,
B.L., Matz, M.V., 2009. Sequencing and de
Grabherr, M.G., Haas, B.J., Yassour, M., Levin,
novo analysis of a coral larval transcriptome
J.Z., Thompson, D.A., Amit, I., Adiconis,
using 454 GSFlx. BMC Genomics 10, 219.
X., Fan, L., Raychowdhury, R., Zeng,
Q., Chen, Z., Mauceli, E., Hacohen, N., Nielsen, C.B., Cantor, M., Dubchak, I., Gordon,
Gnirke, A., Rhind, N., di Palma, F., Birren, D., Wang, T., 2010. Visualizing genomes:
B.W., Nusbaum, C., Lindblad-Toh, K., techniques and challenges. Nat. Methods 7,
Friedman, N., Regev, A., 2011. Full-length S5–S15.
transcriptome assembly from RNA-Seq data Novaes, E., Drost, D.R., Farmerie, W.G., Pappas,
without a reference genome. Nat. Biotechnol. G.J., Grattapaglia, D., Sederoff, R.R.,
29, 644–652. Kirst, M., 2008. High-throughput gene and
Huang, S.-W., Lin, Y.-Y., You, E.-M., Liu, T.-T., SNP discovery in Eucalyptus grandis, an
Shu, H.-Y., Wu, K.-M., Tsai, S.-F., Lo, C.-F., uncharacterized genome. BMC Genomics 9,
Kou, G.-H., Ma, G.-C., others, 2011. Fosmid 312.
library end sequencing reveals a rarely Thiel, T., Michalek, W., Varshney, R.K., Graner,
known genome structure of marine shrimp A., 2003. Exploiting EST databases for the
Penaeus monodon. BMC Genomics 12, 242. development and characterization of gene-
Koboldt, D.C., Zhang, Q., Larson, D.E., Shen, derived SSR-markers in barley (Hordeum
D., McLellan, M.D., Lin, L., Miller, C.A., vulgare L.). TAG Theor. Appl. Genet. Theor.
Mardis, E.R., Ding, L., Wilson, R.K., 2012. Angew. Genet. 106, 411–422.
VarScan 2: Somatic mutation and copy Wheat, C.W., 2010. Rapidly developing functional
number alteration discovery in cancer by genomics in ecological model systems via
exome sequencing. Genome Res. 22, 568– 454 transcriptome sequencing. Genetica
576. 138, 433–451.
Langmead, B., Salzberg, S.L., 2012. Fast gapped- You, E.M., Liu, K.F., Huang, S.W., Chen, M.,
read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods Groumellec, M.L., 2010. Construction
9, 357–359. of integrated genetic linkage maps of the
Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., tiger shrimp (Penaeus monodon) using
Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, microsatellite and AFLP markers. Anim
G., Durbin, R., 1000 Genome Project Data Genet 41, 365–376.
Processing Subgroup, 2009. The Sequence
16 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
ASSEMBLING, ANNOTATING AND ANALYZING
THE TRANSCRIPTOME OF Penaeus monodon
Nguyen Cuong1*, Pham Quang Huy1, Nguyen Van Lam1, Ha Thi Thu1, Pham Thi Hoa1,
Nguyen Hai Trieu1, Dau Huy Tung1, Nguyen Giang Thu2, Nguyen Huu Ninh3,
Dong Van Quyen1, Chu Hoang Ha1, Dinh Duy Khang1
ABSTRACT
Despite black tiger shrimp (Penaeus monodon) is the important aquaculture species in our
country and contributes significantly to the export revenues in the recent years, the data
of the black tiger shrimp genome and transcriptome are not well documented until now.
Although domestication and genetic improvement can be implemented through traditional
breeding programs, the molecular markers and other data generated from genome and
transcriptome sequencing will greatly improve the efficiency and effectiveness of selection.
In this paper, the transcriptome of P. monodon was sequenced using the Next Generation
Sequencing technology with the raw data size of 9 Gb. The raw reads were de novo
assembled to get 51.638 transcripts. Those transcripts were annotated and analyzed to find
7.016 microsatellites and 17.783 SNPs. A website with helpful utilities had been developed
to manage the transcripts. These results would be useful for further research on P. monodon.
Keywords: transcriptome, assembling de novo, next generation sequencing, annotating,
gene display, microsatellite, SNP.
Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Sáng
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015
Ngày duyệt đăng: 07/8/2015
1
Institute of Biotechnology
*Email: cuongnguyen@ibt.ac.vn
2
Sub-Department of Environment and Technology Science
3
Research Institute for Aquaculture No 1
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 17
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
NUÔI CẤY MÔ RONG SỤN (Kappaphycus alvarezii, Doty): KẾT QUẢ
BƯỚC ĐẦU VỀ TẠO MÔ SẸO TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Đào Duy Thu1*, Phạm Thị Mát1, Vũ Thị Hoài1, Nguyễn Văn Nguyên1
TÓM TẮT
Mô sẹo (callus) là nguyên liệu quan trọng để nhân nhanh số lượng cây mầm trong công nghệ nuôi
cấy mô rong biển. Bài viết này trình bày kết quả bước đầu về nghiên cứu tạo mô sẹo rong sụn trong
phòng thí nghiệm sử dụng môi trường nuôi cấy PES ở độ mặn 28‰, khử trùng bằng hỗn hợp
kháng sinh và cảm ứng tạo mô sẹo trong điều kiện nhiệt độ 250C (±1°C), ánh sáng huỳnh quang
5 μmol photons m-2.s-1, chu kỳ chiếu sáng là 12: 12. Kết quả cho thấy với 100% mẫu cấy không bị
nhiễm khuẩn và nấm, tỷ lệ hình thành mô sẹo có thể đạt tới 45,16% và mô sẹo hình thành sớm
nhất được quan sát sau 5 ngày nuôi cấy. Kết quả bước đầu xác định việc hình thành mô sẹo bị ảnh
hưởng bởi các yếu tố kích thước mẫu cấy, nồng độ agar làm môi trường nhưng không ảnh hưởng
vào việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng.
Từ khóa: Rong sụn, Kappaphycus alvarezii, phát sinh mô sẹo, Việt Nam.
I. MỞ ĐẦU số lượng lớn con giống có cùng đặc điểm tính
Rong sụn là loại rong biển kinh tế đang trạng đảm bảo đủ nhu cầu về giống cho việc
được trồng tại nhiều nước châu Á Thái Bình trồng thương phẩm. Thực tiễn, hai nghiên
Dương làm nguyên liệu sản xuất carrageenan. cứu của Dawes và ctv., (1991; 1993) đã thử
Tương tự như các loài rong biển khác, từ trước nghiệm thành công sản xuất mô sẹo rong sụn
tới nay, giống rong sụn chủ yếu được sản xuất và từ những mô sẹo đó họ tiếp tục nuôi cấy
bằng phương pháp sinh sản sinh dưỡng. Theo thành rong giống đạt tỷ lệ 100%. Rong giống
phương pháp này, chỉ có những nhánh rong sau đó đem trồng thử nghiệm cho tốc độ tăng
có sức sinh trưởng tốt được lựa chọn để nhân trưởng hàng ngày tăng gấp 1,5-1,8 lần so với
giống và đây là nguyên nhân chính dẫn đến rong sinh sản sinh dưỡng thông thường (Reddy
suy giảm nguồn gen, kém sức sống kéo theo sự và ctv., 2003).
suy giảm về năng suất rong thu hoạch (Dawes Tại Việt Nam, rong sụn là loài rong kinh
và ctv., 1993). tế đang được trồng nhiều ở vùng biển từ Phú
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhân Yên đến Bình Thuận. Tuy nhiên, sản lượng và
giống rong sụn bằng nuôi cấy mô là phương chất lượng rong sụn Việt Nam hiện nay đang
pháp hiệu quả trong việc lưu giữ những nguồn bị suy giảm không đáp ứng được nhu cầu chế
gene quý phục vụ cho việc sản xuất theo biến rong sụn nội địa (Đào Duy Thu và ctv.,
phương pháp sinh sản sinh dưỡng. Quá trình 2014). Đây là vấn đề lớn cần phải có phương án
phục hồi và nhân nhanh thành cây non có tác giải quyết triệt để. Nhằm thử nghiệm phương
dụng “trẻ hóa” nguồn giống, tăng cường khả pháp nhân giống rong sụn bằng nuôi cấy mô
năng chống chịu với môi trường (Reddy và và cải thiện chất lượng rong sụn, nghiên cứu
ctv., 2008; 2010; Baweja và ctv., 2009). Bên này sẽ trình bày những kết quả bước đầu thử
cạnh đó, nuôi cấy mô có thể tạo ra được một nghiệm phương pháp tạo mô sẹo trong phòng
1
Viện Nghiên cứu Hải sản
*Email: ddthu@rimf.org.vn
18 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
thí nghiệm làm nguyên liệu tái sinh chồi tạo trong nhà kính. Hàng tuần kiểm tra sinh trưởng
cây non sau này. của rong và thay môi trường mới.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Sau khi lưu giữ rong được khoảng 4-5
NGHIÊN CỨU tuần, rong sụn được nuôi thích nghi với điều
2.1. Chuẩn bị nguyên liệu kiện phòng thí nghiệm. Chọn những tản rong
Rong sụn (Kappaphycus alvarezii) gốc khỏe mạnh cắt bớt gốc và nuôi trong các bình
lấy từ vùng trồng rong vịnh Cam Ranh, Khánh thủy tinh trong phòng thí nghiệm nuôi cấy
Hòa. Tại điểm trồng rong, tản rong khỏe mạnh, mô. Môi trường nuôi rong là PES (Provasoli
sạch bệnh được lựa chọn, rửa sạch và xếp vào enriched seawater) được pha bởi các hóa chất
thùng xốp cách nhiệt rồi phủ bề mặt bởi khăn nguồn gốc Sigma- Trung Quốc, ngoại trừ
giữ ẩm. Thùng rong được vận chuyển bằng Cyanocobalmin từ Việt Nam. Các bình nuôi
đường hàng không về Hà Nội và vận chuyển rong được đặt dưới ánh sáng huỳnh quang 25-
bằng ô tô về Viện Hải sản- Hải Phòng. 35 µmol photon m-2.s-1, chu kỳ sáng tối L:D=
12:12, nhiệt độ du trì ở 25±1oC bằng máy điều
Tại Viện Nghiên cứu Hải sản, rong sụn hòa nhiệt độ, sục khí nhẹ 24/24 giờ. Rong sụn
được lưu giữ theo mô tả Sulistiani và ctv., được nuôi thích nghi khoảng 1 tuần đến 10
(2012), cụ thể: Rong sau rửa sạch được nuôi ngày, định kỳ 3 ngày thay toàn bộ môi trường
lưu trong bể kính kích thước 50x70x80cm sử nuôi.
dụng môi trường f/2 với nước biển lọc qua lõi
lọc 5 µm, độ mặn 31‰ tương tự như ở vùng Rong sau khi thích nghi với phòng thí
trồng rong. Chế độ sục khí 24/24 giờ, duy trì nghiệm được cắt thành từng đoạn 4 – 5 cm,
nhiệt độ 25-300C, chế độ chiếu sáng tự nhiên cọ sạch vật bám bằng chổi lông và nước biển
(L:D=12:12). Việc nuôi lưu rong sụn thực hiện pha 0,5% chất tẩy rửa tinh dầu lô hội, Hàn
Hình 1: Lưu giữ rong sụn trong phòng thí nghiệm
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 19
- VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2
Quốc trong 10 phút cho mỗi đoạn rong. Từng nhất về các yếu tố ngoại cảnh.
đoạn rong này sau đó được rửa lại bằng nước - Ảnh hưởng của nồng độ agar và chất điều
biển vô trùng 3 lần và ngâm trong dung dịch tiết sinh trưởng BA (6-benzyl aminopurine):
povidone iodine (hàm lượng iodine 0,5% Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ agar
w/v) nồng độ 2% trong 3 phút. Sau khi ngâm đến hiệu quả hình thành mô sẹo, ba loại nồng
Povidone iodine, các đoạn rong được rửa lại độ agar (Bacto agar, Sigma- Trung Quốc)
bằng nước biển vô trùng 3 lần rồi đem ủ trong là 0,8%, 1,5% và 2% được thiết kế bổ sung
48 giờ trong hỗn hợp nước biển vô trùng + 2% vào môi trường PES. Mỗi nồng độ được thử
PES + 3% dung dịch kháng sinh (Penicillin G nghiệm với 30 mẫu cấy có kích thước khác
1 g, Streptomycin sulphate 2 g, Kanamycin nhau được cấy ngẫu nhiên vào các đĩa petri
1 g, Nystatin 25 mg, Neomycin 200 mg pha chứa 20 ml PES. Các đĩa petri được sắp xếp
trong 100 ml nước cất). Các hóa chất kháng ngẫu nhiên trong cùng vị trí trong phòng nuôi
sinh nguồn gốc hãng Sigma- Trung Quốc. cấy để đảm bảo đồng nhất về điều kiện ngoại
Điều kiện ủ kháng sinh là: nhiệt độ duy trì ở cảnh.
25±1ºC, ánh sáng huỳnh quang 25-35 µmol
photon m-2.s-1; chu kỳ sáng tối L:D= 12:12 Tương tự như trên, thí nghiệm đánh giá
(Reddy và ctv., 2003). hiệu quả của việc bổ sung chất điều tiết sinh
trưởng BA (6-benzyl aminopurine, Sigma-
2.2. Thử nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo Trung Quốc) được tiến hành ở ba nồng độ là
Quy trình cấy cảm ứng mô sẹo tuân theo 0 mg/l (đối chứng); 0,5 mg/l và 1 mg/l môi
mô tả của Reddy và ctv., (2003), cụ thể: các trường PES. Số lượng mẫu cấy thử nghiệm
đoạn rong sau khi ủ kháng sinh được rửa lại cho mỗi nồng độ là n=30. Nồng độ agar sử
bằng nước biển vô trùng 3-4 lần rồi cắt thành dụng làm môi trường trong thí nghiệm này là
từng đoạn dài 3 mm làm mẫu cấy. Các mẫu cấy 1,5%. Các đĩa petri sau cấy mẫu cũng được
được lau sạch dịch nhầy tại vết cắt và cấy vào xắp xếp ngẫu nhiên ở cùng vị trí để đảm bảo
môi trường thạch trong đĩa petri với số lượng đồng nhất điều kiện ngoại cảnh. Định kỳ kiểm
9-10 mẫu cấy. Các đĩa mẫu cấy được để ngẫu tra sự hình thành mô sẹo và thống kê số mẫu
nhiên trong cùng khu vực ở phòng thí nghiệm hình thành mô sẹo ở từng thí nghiệm.
kín, duy trì thông khí bằng điều hòa nhiệt độ Xử lý số liệu: Việc phân tích so sánh giữa
với nhiệt độ phòng khoảng 25±1ºC, chiếu sáng các nghiệm thức được thực hiện bằng phân
bằng đèn huỳnh quang với cường độ 5 µmol tích χ (Chi-square) với α = 0,05 và thống kê
2
photon m-2.s-1, chế độ chiếu sáng 12:12. mô tả. Tỷ lệ mẫu cảm ứng mô sẹo được tính
- Ảnh hưởng của kích cỡ mẫu cấy: theo công thức: M= tổng số mẫu hình thành
Để đánh giá ảnh hưởng của kích cỡ mẫu mô sẹo/tổng số mẫu cấy.
cấy đến việc hình thành mô sẹo, tổng cộng 279 III. KẾT QUẢ
mẫu ở các kích cỡ đường kính khác nhau (từ 3.1. Ảnh hưởng của kích cỡ mẫu cấy
1,5-3,5 mm) được cấy ngẫu nhiên vào các đĩa
petri khác nhau với mỗi đĩa chứa 20 ml PES Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác
+ 1,5% Bacto agar (Reddy và ctv., 2003). Các biệt về tỷ lệ phát sinh mô sẹo giữa hai loại mẫu
mẫu cấy được đánh số thứ tự và theo dõi sự có kích cỡ khác nhau. Thử nghiệm cảm ứng
phát triển mô sẹo hàng ngày dưới kính giải 279 mẫu cho thấy sau 14 ngày có 126 mẫu
phẫu với độ phóng đại tối đa 4,5 lần. Các đĩa hình thành mô sẹo chiếm 45,1%. Đối với mẫu
petri đựng mẫu cấy được đặt ngẫu nhiên trong có đường kính >2 mm, tỷ lệ hình thành mô sẹo
cùng một vị trí thí nghiệm để đảm bảo đồng là 51,4% (75/146). Tỷ lệ này ở mẫu có đường
kính
nguon tai.lieu . vn
