Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SỰ HIỆN DIỆN CỦA Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH VÀ HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG KHÁNG SINH VÀ KHÁNG KHÁNG SINH TRÊN TÔM NUÔI TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Nguyễn Diễm Thư1*, Lê Hồng Phước1, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Mã Tú Lan1 TÓM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) gây ra bởi vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã gây thiệt hại kinh tế đáng kể trong nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Nghiên cứu trước cho thấy V. parahaemolyti- cus kháng với nhiều loại kháng sinh do việc lạm dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Hiện tại có ít thông tin về hiện trạng sử dụng thuốc kháng sinh và tần số xuất hiện của V. parahaemolyticus trong tôm nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), Việt Nam. Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát tỷ lệ nhiễm Vibrio parahaemolyticus và đánh giá hiện trạng kháng kháng sinh của V. parahaemolyticus tại ĐBSCL. Nghiên cứu được thực hiện qua điều tra việc sử dụng kháng sinh tại 76 ao tôm thẻ và tôm sú nuôi thương phẩm và xác định sự hiện diện của V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong tổng số 396 mẫu tôm, nước và bùn thu ở ĐBSCL. 47 chủng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập được thử kháng sinh đồ với 13 loại kháng sinh. Kết quả cho thấy sự hiện diện của V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND là 12,37% trong tổng số 396 mẫu (tôm, nước và bùn). Kết quả điều tra cho thấy oxytetracycline, doxycycline và enrofloxacin là ba loại kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất trong tôm nuôi. Các chủng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND có tỉ lệ kháng khá cao với amoxicillin (80,85%) và ampicillin (78,72%), vì vậy không nên sử dụng hai loại kháng sinh này trong điều trị bệnh AHPND do V. parahaemolyticus. Từ khóa: Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND, kháng sinh, kháng kháng sinh, tôm nuôi. I. ĐẶT VẤN ĐỀ hoặc ruột bị đứt đoạn, bơi xoắn ốc, lỏng vỏ, màu Vibrio parahaemolyticus mang gen độc, tác sắc nhợt nhạt. Tôm bệnh cũng cho thấy các dấu nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) hiệu gan bất thường như gan teo, nhỏ, gan sưng, hay hội chứng chết sớm (EMS), đã gây ra thiệt màu đen hoặc nhạt màu (Lightner et al., 2013; hại kinh tế đáng kể trong các trang trại nuôi tôm. Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015). Bệnh thường xảy ra khoảng 8 ngày sau khi thả Tần suất nhiễm bệnh thường xảy ra nhiều giống, phát triển một cách nhanh chóng và gây hơn trong hệ thống nuôi tôm thâm canh nên chết nghiêm trọng trong 20 đến 30 ngày nuôi thường đòi hỏi việc sử dụng kháng sinh trong đầu (Han et al., 2015). Triệu chứng lâm sàng điều trị bệnh. Sử dụng kháng sinh không đúng tôm bệnh bao gồm tăng trưởng chậm, ruột rỗng liều lượng trong phòng trị bệnh nhiễm khuẩn 1 Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II * Email: thu_seven@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 75
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II trong nuôi trồng thủy sản được cho là có liên trên môi trường TCBS (thiosulfate citrate bile quan dẫn đến sự kháng thuốc của vi khuẩn salts sucrose agar) được lựa chọn và xác nhận (Elmahdi et al., 2016). Các thông tin hiện tại về V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND bằng việc sử dụng thuốc kháng sinh trong tôm nuôi phương pháp duplex PCR. Quy trình duplex PCR và tần suất hiện diện của V. parahaemolyticus sử dụng theo phương pháp của Han et al., (2015) gây bệnh AHPND còn rất hạn chế ở ĐBSCL, nhằm phát hiện hai gen gây độc pirA và pirB với Việt Nam. Nghiên cứu này nhằm xác định tần các cặp mồi VpPirA-284F/R (VpPirA-284F: suất xuất hiện của V. parahaemolyticus gây 5’-TGACTATTCTCACGATTGGACTG-3’, bệnh AHPND trên các mẫu tôm, mẫu nước và VpPirA-284R: 5’-CACGACTAGCGCCATTG mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm; đánh giá việc sử TTA-3’) và VpPirB-392F/R (VpPirB-392F: dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho 5 ’ - T G AT G A A G T G AT G G G T G C T C - 3 ’ , tôm nuôi; ngoài ra việc thử kháng sinh đồ các VpPirB-392R: 5’-TGTAAGCGCCGTTTAAC chủng V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND TCA-3’). Quy trình duplex PCR gồm giai đoạn nhằm lựa chọn kháng sinh phù hợp cho việc biến tính ban đầu ở 94°C trong 3 phút, tiếp theo điều trị loại bệnh này trên tôm. là 35 chu kỳ của 94°C trong 30 giây, 60°C trong 30 giây, và 72°C trong 30 giây; và giai đoạn II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP cuối ở 72°C trong 7 phút. 2.1. Điều tra việc sử dụng kháng sinh và 2.3. Phương pháp thử kháng sinh đồ thu mẫu Thử nghiệm kháng sinh đồ trên V. Điều tra phỏng vấn được thực hiện với các parahaemolyticus được thực hiện theo phương chủ trang trại hoặc nhân viên kỹ thuật của 76 pháp khuếch tán đĩa thạch (Tendencia, 2004), ao nuôi tôm nuôi thương phẩm gồm 37 ao nuôi và theo hướng dẫn của Clinical and Laboratory tôm sú (Penaeus monodon) và 39 ao nuôi tôm Standards Institute (CLSI, 2014). Các kháng thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) ở các tỉnh sinh được thử nghiệm là: ampicillin (AMP), Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu và Bến Tre vào năm 2015. Điều tra phỏng vấn được tiến hành amoxicillin (AM), gentamicin (GM), kanamycin qua việc sử dụng phiếu điều tra soạn sẵn gồm (KA), oxytetracycline (OTC), tetracycline hai phần: i) Đặc điểm ao nuôi và các kỹ thuật (TC), doxycycline (DOX), ciprofloxacin (CIP), quản lý ao, và ii) Dịch bệnh và việc sử dụng trimethoprim và sulfamethoxazol (bactrim), thuốc kháng sinh. norfloxacin (NOR), florfenicol (FLO), neomycin (NEO), erythromycin (ERY). Tổng cộng 396 mẫu thu gồm 131 mẫu tôm, 131 mẫu nước và 134 mẫu bùn được thu tại 2.4. Phương pháp phân tích số liệu 131 ao nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Dữ liệu được nhập và phân tích thống kê Liêu, Kiên Giang và Bến Tre trong năm 2015. bằng phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA). Mẫu tôm đã được thu từ các ao nuôi tôm có dấu hiệu chết nghi ngờ nhiễm V. parahaemolyticus. III. KẾT QUẢ Các ao có thu mẫu tôm được thu thêm mẫu 3.1. Sự hiện diện của V. parahaemolyticus nước và mẫu bùn để kiểm tra sự hiện diện của V. gây bệnh AHPND parahaemolyticus. Trong 396 mẫu thu, tổng cộng 226 khuẩn lạc 2.2. Phân lập và định danh vi khuẩn nghi ngờ V. parahaemolyticus với đặc điểm màu Khuẩn lạc nghi ngờ V. parahaemolyticus tím hoa cà trên môi trường CHROMagarTM với các đặc điểm màu tím hoa cà trên môi trường Vibrio và màu xanh lá cây trên môi trường TCBS CHROMagarTM Vibrio và màu xanh lá cây được phân lập và 49 mẫu V. parahaemolyticus 76 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II mang 2 gen độc pirA và gen pirB đã được xác Tỷ lệ V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND nhận bằng phương pháp duplex PCR (Bảng 1). trong 396 mẫu là 12,37% (49/396). Bảng 1. Tần suất xuất hiện của V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND tại ĐBSCL Số khuẩn lạc/mẫu nghi ngờ Số khuẩn lạc/mẫu V. Tỉnh V. parahaemolyticus parahaemolyticus gây bệnh AHPND Tôm Nước Bùn Tôm Nước Bùn Bạc Liêu 7/35 10/35 15/35 0 0 0 Bến Tre 1/4 1/4 5/9 0 0 2 Sóc Trăng 12/27 5/27 26/25 6 1 6 Kiên Giang 27/38 29/38 23/38 8 11 3 Cà Mau 19/27 19/27 27/27 4 1 7 Tổng mẫu 66/131 64/131 96/134 18 13 18 Tần suất (%) 50,38 48,85 71,64 13,74 9,92 13,43 3.2. Hiện trạng sử dụng kháng sinh tại nông hộ (62%) cho biết sử dụng kháng sinh để ao nuôi tôm điều trị bệnh đang xảy ra, và 38% số nông hộ Kết quả khảo sát tại các trang trại cho báo cáo sử dụng kháng sinh để phòng bệnh. thấy hơn 16 loại kháng sinh khác nhau được Oxytetracycline (31,7%), doxycycline (12,7%) sử dụng (Hình 1). 68,9% số nông hộ được báo và enrofloxacin (7,9%) là ba loại kháng sinh cáo là có sử dụng kháng sinh. Hơn một nửa số được sử dụng phổ biến nhất. Hình 1. Tỷ lệ sử dụng kháng sinh của 5 tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 77
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.3. Hiện trạng kháng kháng sinh của gây bệnh AHPND phân lập được tìm thấy có AHPND gây bệnh Vibrio parahaemolyticus khả năng kháng với amoxicillin (80,85%), Khả năng nhạy cảm kháng sinh của 47 78,72% kháng với ampicillin, 27,66% kháng mẫu V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND với florfenicol, 23,40% kháng với kanamycin đã phân lập được thử kháng sinh đồ với 13 và 21,28% kháng với oxytetracycline. loại kháng sinh. Tỉ lệ nhạy, kháng trung gian Norfloxacin là loại kháng sinh còn nhạy cao và kháng của từng loại kháng sinh với các vi nhất (97,87%) trong số các mẫu vi khuẩn phân khuẩn phân lập được trình bày trong Bảng 2. lập trong nghiên cứu này. Hầu hết tất cả các chủng V. parahaemolyticus Bảng 2. Tỉ lệ các mẫu V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND nhạy, kháng trung gian và kháng các loại kháng sinh (n = 47) Kháng Kháng Nhạy STT Kháng sinh trung gian n % n % n % 1 Ampicillin 37 78,72 7 14,89 3 6,38 2 Amoxicillin 38 80,85 8 17,02 1 2,13 3 Gentamicin 3 6,38 5 10,64 39 82,98 4 Kanamycin 11 23,40 23 48,94 13 27,66 5 Oxytetracycline 10 21,28 28 59,57 9 19,15 6 Tetracycline 6 12,77 6 12,77 35 74,47 7 Doxycycline 3 6,38 1 2,13 43 91,49 8 Ciprofloxacin 0 0 3 6,38 44 93,62 9 Bactrim 9 19,15 5 10,64 33 70,21 10 Norfloxacin 0 0 1 2,13 46 97,87 11 Florfenicol 13 27,66 1 2,13 33 70,21 12 Neomycin 7 14,89 38 80,85 2 4,26 13 Erythromycin 1 2,13 42 89,36 4 8,51 45 mẫu trong tổng số 47 mẫu V. parahaemolyticus của các chủng phân lập được kháng với năm (95,7%) cho thấy kháng với ít nhất một loại hoặc sáu loại thuốc kháng sinh. Hai trong số kháng sinh. 42 mẫu (98,4%) cho thấy kháng các chủng gây bệnh AHPND (4,3%) còn nhạy với hai loại kháng sinh trở lên. 23 mẫu (70,2%) với cả 13 loại kháng sinh đã thử kháng sinh đồ kháng với ba loại kháng sinh trở lên và 6,4% (Bảng 3). 78 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 3. Tần số kháng kháng sinh của các mẫu V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND Loại Số chủng vi khuẩn Tỉ lệ (%) Không kháng 2 4,3 Kháng 1 loại kháng sinh 3 6,4 Kháng 2 loại kháng sinh 9 19,1 Kháng 3 loại kháng sinh 25 53,2 Kháng 4 loại kháng sinh 2 4,3 Kháng 5 loại kháng sinh 3 6,4 Kháng 6 loại kháng sinh 3 6,4 Tổng 47 100 IV. THẢO LUẬN parahaemolyticus đề kháng cao với ampicillin ở Nghiên cứu này cho thấy V. parahaemoly- Malaysia (63,1%), Thái Lan (72%) và Indonesia ticus gây bệnh AHPND hiện diện với tỉ lệ (98%) (Al-Othruvi et al, 2014; Lesmana et 12,37% trên các mẫu thu ở 5 tỉnh ven biển al, 2001; Yano et al., 2011). Đa số các mẫu V. ĐBSCL. Nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Trưởng parahaemolyticus phân lập (95,7%) cho thấy là và ctv., (2015) cho thấy tần số xuất hiện của V. kháng với ít nhất một loại kháng sinh và một số parahaemolyticus trên các mẫu cá và nước tại chủng V. parahaemolyticus kháng với năm hoặc Tiền Giang cũng chiếm tỉ lệ khá cao 13,97%. sáu loại thuốc kháng sinh. Kết quả nghiên cứu này tương tự với kết quả của Đặng Thị Hoàng Oxytetracycline, doxycycline và Oanh và ctv., (2006) và Huỳnh Ngọc Trưởng enrofloxacin là ba loại kháng sinh được sử và ctv., (2015) đã báo cáo V. parahaemolyticus dụng nhiều nhất tại 4 tỉnh khảo sát ở Cà Mau, kháng với bốn, năm hoặc sáu loại thuốc kháng Sóc Trăng, Bạc Liêu và Bến Tre. Kết quả này sinh. phù hợp với kết quả của Mai Văn Tài và ctv., (2004) cho thấy oxytetracycline và doxycycline V. KẾT LUẬN là các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến Sự hiện diện của V. parahaemolyticus gây nhất trong nuôi trồng thủy sản. Đáng chú ý, việc bệnh hoại tử gan tụy là 12,37% trong tổng số sử dụng enrofloxacin trong nuôi trồng thủy sản mẫu 396 mẫu tôm, mẫu nước và mẫu bùn thu đã bị cấm ở Việt Nam nhưng enrofloxacin vẫn ở 5 tỉnh ĐBSCL. Oxytetracycline, doxycycline được sử dụng trong nuôi tôm ở ĐBSCL. và enrofloxacin được báo cáo là được sử dụng nhiều trong tôm nuôi. Nghiên cứu cho thấy tỷ Kết quả nghiên cứu này cho thấy hầu hết lệ cao V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND các mẫu V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND kháng với amoxicillin và ampicillin, vì vậy có đã phân lập đều kháng với amoxicillin và thể khuyến cáo không nên sử dụng amoxicillin ampicillin. Các nghiên cứu trước đã cho thấy V. và ampicillin trong điều trị bệnh này. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 79
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TÀI LIỆU THAM KHẢO (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio Tài liệu tiếng Việt parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, of shrimp. Diseases of aquatic organisms, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh 113(1), 33-40. Phương, 2006. Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio Lesmana, M., Subekti, D., Simanjuntak, C. H., phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú Tjaniadi, P., Campbell, J. R., & Oyofo, B. A., (Penaeus monodon). Tạp chí nghiên cứu khoa 2001. Vibrio parahaemolyticus associated with học, tr. 42 – 52. cholera-like diarrhea among patients in North Jakarta, Indonesia. Diagnostic microbiology Huỳnh Ngọc Trưởng, Trần Thị Ngọc Thanh, and infectious disease, 39(2), 71-75. Nguyễn Tiến Dũng, 2015. Tình hình nhiễm và tỉ lệ kháng thuốc của Vibrio spp. phân lập từ Lightner D.V., Redman C.R., Pantoja B.L., thủy sản và nước nuôi tại Tiền Giang. Tạp chí Noble L.M., Nunan, Loc Tran, 2013. Khoa học 2 (67): 157. Documentation of an Emerging Disease (Early Mortality Syndrome) in SE Asia & Mai Văn Tài và ctv., 2004. Báo cáo tóm tắt đề tài: Mexico. OIE Reference Laboratory for Shrimp Đánh giá hiện trạng các loại thuốc, hóa chất và Diseases, Department of Veterinary Science chế phẩm sinh học dùng trong nuôi trồng thủy & Microbiology, School of Animal and sản nhằm đề xuất các giải pháp quản lý. Comparative Biomedical Sciences. Tài liệu tiếng Anh Ruangpan, L., & Tendencia, E. A., 2004. Al-Othrubi, S. M., Kqueen, C. Y., Mirhosseini, Laboratory manual of standardized methods H., Hadi, Y. A., & Radu, S., 2014. Antibiotic for antimicrobial sensitivity tests for bacteria resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated isolated from aquatic animals and environment. from cockles and shrimp sea food marketed Southeast Asian Fisheries Development in Selangor, Malaysia. Clinical Microbiology: Center, Aquaculture Department. Open Access, 2014. Yano, Y., Hamano, K., Satomi, M., Tsutsui, Clinical and Laboratory Standards Institute, I., & Aue‐umneoy, D., 2011. Diversity and 2014. Performance standards for antimicrobial characterization of oxytetracycline‐resistant susceptibility testing, 24th informational bacteria associated with non‐native species, supplement. Approved standard M100-S24. white‐leg shrimp (Litopenaeus vannamei), and Clinical and Laboratory Standards Institute, native species, black tiger shrimp (Penaeus Wayne, PA, 226 pp. monodon), intensively cultured in Thailand. Elmahdi, S., DaSilva, L. V., & Parveen, Journal of applied microbiology, 110(3), 713- S., 2016. Antibiotic resistance of Vibrio 722. parahaemolyticus and Vibrio vulnificus Zorriehzahra, M. J., & Banaederakhshan, R., in various countries: A review. Food 2015. Early mortality syndrome (EMS) as new microbiology, 57, 128-134. emerging threat in shrimp industry. Adv. Anim. Han, J. E., Tang, K. F., Tran, L. H., & Lightner, Vet. Sci, 3(2s), 64-72. D. V., 2015. Photorhabdus insect-related 80 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II OCCURRENCE, ANTIBIOTIC USAGE AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF Vibrio parahaemolyticus FROM FARMED SHRIMPS IN THE MEKONG DELTA, VIETNAM Nguyen Diem Thu1*, Le Hong Phuoc1, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Ma Tu Lan1 ABSTRACT Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus has resulted in significant economic losses in shrimp production in Vietnam. Previous studies reported that V. parahaemolyticus showed multiple-antibiotic resistance due to the misuse of antibiotics to control pathogenic infections in aquaculture. There is a lack of information on the use of antibiotics by shrimp farmers as well as knowledge regarding the presence of V. parahaemolyticus in the Mekong Delta, Vietnam. This study aimed to investigate the incidence of pathogenic Vibrio parahaemolyti- cus and to assess the antibiotic resistance profile as well as to perform the antimicrobial susceptibil- ity test in V. parahaemolyticus isolates in the Mekong Delta. The study was carried out through a survey on the use of antibiotics in 76 grow-out shrimp farms and identification of the occurrence of AHPND pathogenic V. parahaemolyticus isolates in a total of 396 shrimp, water and mud samples collected in the Mekong Delta. Forty seven AHPND-causing V. parahaemolyticus isolates were tested for sensitivity to 13 antibiotics. The results showed that the incidence of AHPND-causing V. parahaemolyticus isolates was 12.37% in the total of 396 samples. Oxytetracycline, doxycycline and enrofloxacin were the most commonly used antibiotics in the shrimp farms. The study showed high percentage of amoxicillin and ampicillin resistance (80.85% and 78.72%, respectively) by AHPND-causing V. parahaemolyticus isolates, suggesting these two antibiotics should be excluded in the treatment of V. parahaemolyticus. Keywords: AHPND pathogenic Vibrio parahaemolyticus, antibiotic, antibiotic resistance, farmed shrimps. Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Ngày nhận bài: 27/6/2016 Ngày thông qua phản biện: 08/8/2016 Ngày duyệt đăng: 05/9/2016 1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2. *Email: thu_seven@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 81
nguon tai.lieu . vn