- Trang Chủ
- Nông nghiệp
- Sự đồng nhiễm và tương quan giữa các kỹ thuật xét nghiệm PCV2 ở ca bệnh hô hấp phức hợp và còi cọc sau cai sữa
Xem mẫu
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332
SỰ ĐỒNG NHIỄM VÀ TƯƠNG QUAN GIỮA CÁC KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCV2
Ở CA BỆNH HÔ HẤP PHỨC HỢP VÀ CÒI CỌC SAU CAI SỮA
Đỗ Tiến Duy1*, Ngô Thị Ngọc Trâm1, Nguyễn Thế Hiển1,
Trần Hoàng Vũ2 và Nguyễn Tất Toàn1
Tóm tắt
Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm khảo sát tỷ lệ đồng nhiễm các mầm bệnh liên quan PCV2 và đánh giá sự tương
quan giữa các kỹ thuật xét nghiệm trên các ca bệnh khảo sát. Mẫu mô và máu từ heo có dấu hiệu lâm sàng được thu
thập từ 90 trang trại khác nhau ở nhiều tỉnh thành. Phương pháp PCR/RT-PCR được thực hiện để xác định mầm bệnh
trong từng trường hợp. Từ kết quả đó, tiếp tục khảo sát sự tương qua giữa các xét nghiệm thông qua các phương pháp
mổ khám, HE, IHC và ELISA. Kết quả sàng lọc cho thấy nhiễm ghép 2 mầm bệnh có tỷ lệ cao nhất trong đó chủ yếu
là đồng nhiễm giữa PCV2 và PRRSV, tiếp theo là đồng nhiễm 3 mầm bệnh (6,3 - 23,8%) theo trại và (4,1 - 16,3%)
theo ca bệnh. Sự khác biệt tỷ lệ phát hiện PCV2 ở các kỹ thuật xét nghiệm lâm sàng, bệnh tích, PCR, qPCR,
ELISA và IHC là rất có ý nghĩa. PCV2 thường nhiễm ghép với các mầm bệnh PRRSV, MH, HP và CSFV. Sự kết
hợp dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích đặc trưng với kỹ thuật xét nghiệm PCR có giá trị chắc chắn để khẳng định ca
bệnh do PCV2.
Từ khóa: Đồng nhiễm, heo, PCV2.
CO-INFECTION AND CORRELATION BETWEEN PCV2 TEST TECHQUINES IN
PORCINE RESPIRATORY DISEASE COMPLEX (PRDC) AND POST-WEANING
MULTISYSTEMIC WASTING SYNDROME (PMWS)
Abstract
The aim of this study was to investigate the prevalence of the PCV2-related pathogens and to evaluate the cor-
relation between the diagnostic assays in the surveyed cases. Tissue and blood samples from clinical pigs were
collected from 90 different farms in several provinces. PCR/RT-PCR method was performed to identify the
pathogen in each case. From that result, continue to investigate the correlation between tests through surgery, HE,
IHC and ELISA methods. Screening results showed that double co-infection has the highest rate which is mainly
co-infection between PCV2 and PRRSV, followed by co-infection with 3 pathogens (6.3 - 23.8%) by farm and
(4.1 - 16.3%) by case. The difference in the detection rate of PCV2 in clinical, lesion, PCR, qPCR, ELISA and
IHC diagnostic techniques was very significant. PCV2 is co-infect with PRRSV, MH, HP and CSFV pathogens.
The combination of clinical signs, characteristic lesions with PCR testing technique has a certain value to confirm
a case caused by PCV2.
Keywords: Co-infection, pigs, PCV2.
1. MỞ ĐẦU
Circovirus là virus không có vỏ bọc với (Open reading frames - ORFs) bao gồm
bộ gen có dạng vòng DNA mạch đơn thuộc ORF1 và ORF2, mã hóa cho protein cap và
họ Circoviridae (Segales và cs., 2005). Bộ rep, hai protein này được mã hoá ngược chiều
gen Circovirus chứa hai khung đọc mở chính nhau (Palinski và cs., 2017). Cho đến nay,
1
Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh;
2
Công ty Boehringer Ingelheim, Việt Nam;
*
Tác giả liên hệ: Đỗ Tiến Duy. Email: duy.dotien@hcmuaf.edu.vn; ĐT: 0918.356744
327
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332
bốn loài Porcine circovirus (PCV) đã được 3 - 10 tuần tuổi từ 63 trại khảo sát heo ở các
xác định, bao gồm PCV1 không gây bệnh trên tỉnh thành khu vực phía Nam và một số tỉnh
heo (Tischer và cs, 1986), PCV2 hiện đang miền Trung và Bắc. Thu thập mẫu theo hai
gây bệnh phổ biến trên đàn heo (Allan và cs., dạng: Mẫu mô tươi (Phổi, hạch, lách, thận,
1998), PCV3 phát hiện lần đầu vào năm 2015 gan) cho kỹ thuật xét nghiệm PCR và huyết
(Palinski và cs., 2017) và PCV4 vừa mới được thanh cho kỹ thuật Realtime-PCR; Mẫu mô
phát hiện tại Trung Quốc (Zhang và cs., 2019). (Phổi, hạch, lách, thận, gan) cố định formalin
Ở Việt Nam, PCV2 được xác định xuất 10% cho kỹ thuật HE và IHC; và huyết thanh
hiện từ năm 2000. Tỷ lệ nhiễm cũng như thu thập cho xét nghiệm ELISA. Các xét
sự phức tạp do đồng nhiễm với vi khuẩn và
nghiệm được thực hiện ở Phòng thí nghiệm
vi-rút khác có xu hướng tăng dần qua từng
nghiên cứu Chăn nuôi và Thú y, Khoa Chăn
năm (Lâm Thị Thu Hương, 2012). Các bệnh
do Porcine circovirus type 2 (PCVD) hoặc nuôi Thú y, Trường đại học Nông Lâm TP.
các bệnh liên quan đến Porcine circovirus HCM).
type 2 (PCVAD) là các thuật ngữ đề cập đến 2.2. Xác định sự hiện diện của các mầm
một số thể bệnh gây ra do PCV2. Cho đến bệnh khảo sát
nay, cơ chế chính xác của PCVD/PCVAD
Tách chiết DNA/RNA: Mẫu mô tươi
hiện vẫn chưa được biết rõ (Ren và cs., 2016).
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã báo cáo được xử lý với dung dịch PBS 1X, thu được
đồng nhiễm PCV2 với các mầm bệnh khác huyễn dịch 10%. Ly tâm huyễn dịch thu
ở heo, chẳng hạn như vi-rút gây hội chứng phần dịch nổi để tách chiết DNA/RNA theo
rối loạn hô hấp và sinh sản ở heo (PRRSV), quy trình của Bộ kít thương mại (GeneJET
Mycoplasma hyopneumoniae (MH),... là Genomic DNA Purification Kit của Thermo
những yếu tố quan trọng có thể tăng mức độ Scientific, Lithuania) và RNA (SV Total
nghiêm trọng của PCVD/PDVAD. Hơn nữa, RNA Isolation System-Promega, Mỹ). Huyết
việc tiêm phòng thất bại, stress hoặc mật độ thanh từ ca bệnh được tách chiết DNA bằng
đàn đông cùng với nhiễm PCV2 cũng gây bộ kit InviMAG Virus DNA/RNA (INVITEK
ra PCVD/PCVAD (Ren và cs., 2016; Chae Molecular, BerLin, Germany).
và cs., 2005; Segales và cs., 2015; Zhai và
cs., 2011). Các kỹ thuật PCR/RT-PCR: Các cặp
mồi đặc hiệu được sử dụng xác định sự hiện
Tuy nhiên, nghiên cứu đầy đủ về tỷ lệ
diện các mầm bệnh hiện diện trong ca bệnh
đồng nhiễm của các mầm bệnh và cả PCV2
trong các ca bệnh Post-weaning multisystemic khảo sát được tham khảo từ các nghiên cứu
wasting syndrome (PMWS) và Porcine trước đây: PRRSV (Duy và cs., 2015), PCV2
Respiratory disease complex (PRDC) tại (Larochelle và cs., 1999), CSFV (Paton và
Việt Nam phần nào còn rất hạn chế và chưa cs., 2000), MH (Abhijit và cs., 2012), và HP
được cập nhật trong thời gian gần đây. Trong (Hicinova và cs., 2010). Phản ứng PCR/RT-
nghiên cứu này, phân tích sự đồng nhiễm các PCR được thực hiện với tổng phản ứng là
mầm bệnh và đánh giá các chỉ tiêu bệnh lý 25 μl và chu trình luân nhiệt được thực hiện
liên quan đến PCV2 ở các ca bệnh lâm sàng theo quy trình hiệu chỉnh của Phòng xét
được thực hiện bằng phương pháp quan sát nghiệm thuộc Bệnh viện Thú y, Trường đại
lâm sàng, mổ khám, mô học vi thể (HE),
học Nông Lâm TP. HCM. Kết quả được đọc
PCR, Realtime PCR, IHC và huyết thanh học
(ELISA). trên gel agarose 1% ở buồng chiếu tia UV.
2.3. Sự tương quan giữa các xét nghiệm
2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
PCV2 ở các ca PMWS/PRDC
NGHIÊN CỨU
Kỹ thuật Realtime PCR (qPCR)
2.1. Thu thập mẫu xét nghiệm PCV2: DNA tách chiết được
Mẫu được thu thập từ 98 heo có dấu sử dụng để định lượng virus PCV2 bằng kĩ
hiệu lâm sàng liên quan đến PCV2, ở lứa tuổi thuật TaqMan Realtime PCR, theo hướng
328
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332
dẫn protocol V615-42 (Chi cục Thú y Vùng AP, Dako Denmark A/S). Kết quả dương tính
VI, Tp. HCM), với đoạn mồi: Forward: được chấm điểm kháng nguyên (số tế bào
5’-CAGATCCTCCGCCGCC-3’, Reverse: dương tính/mm2), bằng quan sát dưới kính
5’-TBTGACTGTGGTASSCTTGACA-3’, hiển vi ở quang trường (10X), cho điểm từ
Probe: 5’-FAM-CTCCCGCACCTCC- điểm 0 đến 3 theo phần trăm (%) vi trường
MGBNFQ-3’. Phản ứng Realtime PCR có nang bạch huyết có tế bào dương tính với
thành phần MasterMix of InvitrogenTM kháng nguyên PCV2, 0: không hiện diện, 1+:
Platinum Quantitive PCR SuperMix-UDG hiện diện kháng nguyên < 10% vi trường, 2+:
(Cat.No: 1 1730-017, InvitrogenTM). Giá trị hiện diện kháng nguyên 10 - 50% vi trường, và
kết quả được thể hiện qua chỉ số Ct value, Ct 3+: hiện diện kháng nguyên > 50% vi trường.
0.4. Đồng nhiễm giữa 2 mầm bệnh chiếm tỷ
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC): lệ cao nhất, trong đó tỷ lệ nhiễm ghép giữa
Các khối paraffin được cắt tiêu bản với kích PCV2 và PRRSV là chủ yếu (44,4% theo trại
thước 3 - 5 µm, và nhuộm theo quy trình và 41,8% theo ca bệnh), kế tiếp là MH, HP và
thường quy, sử dụng kháng thể sơ cấp đặc CSFV. Tiếp theo là đồng nhiễm 3 mầm bệnh
hiệu với PCV2 (antibody anti-PCV2 mouse; (6,3% - 23,8%) theo trại và (4,1% - 16,3 %)
Rural technology corp) và kháng thể thứ cấp theo ca bệnh. Các trường hợp nhiễm 4 và 5
(anti-mouse Polyclonal goat immunoglobin/ mầm bệnh cùng lúc có tỷ lệ thấp hơn (Hình 1).
Hình 1. Tỷ lệ đồng nhiễm PCV2 và các mầm bệnh theo trại và theo ca bệnh
Tỷ lệ đồng nhiễm cao giữa PCV2 và PRRSV có mục tiêu nhiễm và gây hại đến
PRRSV là phù hợp với nhiều nghiên cứu các tế bào miễn dịch và từ đó làm giảm khả
trước đây (Drolet và cs., 2003). Cả PCV2 và năng phòng vệ của vật chủ (Ouyang và cs.,
329
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332
2019). Tổ hợp nhiễm MH và PCV2 hoặc HP thấp (26,7%) bởi qPCR so với PCR (100 %),
và PCV2 cũng chiếm tỷ lệ cao, tương tự kết cho thấy mô hạch và cơ quan nội tạng có sự
quả báo cáo của Pallarés và cs. (2002). Các hiện diện thường xuyên của mầm bệnh này và
kết quả này cho thấy PCV2, PRRSV, MH, và là cơ quan đích để thu mẫu chẩn đoán ở các
HP đóng vai trò quan trọng ở các ca bệnh có thể bệnh.
dấu hiệu hô hấp sớm trên heo, mà khảo sát Mẫu bệnh phẩm tốt nhất để chẩn đoán
này chọn đối tượng lâm sàng PRDC/PMWS. PCV2 là mẫu mô (đặc biệt là hạch) đã được
3.2. Tương quan kết quả xét nghiệm PCV2 kết luận trong nghiên cứu của Lâm Thị Thu
ở các ca bệnh khảo sát Hương và Đường Chi Mai (2006). Tương
Dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích (đại thể tự kết quả khảo sát của Grau-Roma và cs.
và vi thể) có kết quả tương tự 100% với kĩ (2009), chẩn đoán PCV2 thông qua việc phát
thuật xét nghiệm PCR (24/24). Nhưng so hiện kháng nguyên trong huyết thanh có độ
với xét nghiệm qPCR ở huyết thanh (4/15; nhạy thấp. Tỷ lệ và mức độ dương tính với
26,7%), xét nghiệm huyết thanh học ELISA kháng nguyên PCV2 trong hạch bạch huyết
(13/15; 86,7%) và xét nghiệm IHC trên mô (IHC) ở 24 ca bệnh ở mức khá thấp, tương
tương ứng (3/16; 18,8%) kết quả ngược lại ứng 1+. Mặc dù, theo báo của Segales và cs.
ở trên. Sự khác biệt tỷ lệ phát hiện PCV2 (2012), phổi viêm liên quan đến PCV2 cho
ở các kỹ thuật xét nghiệm là rất có ý nghĩa kết quả dương tính qua nhuộm IHC ở mức
(P = 0,000). Đặc biệt, tỷ lệ phát hiện PCV2 rất trung bình đến cao (2+ đến 3+).
Bảng 1. Tương quan kết quả giữa các xét nghiệm ở các ca nhiễm PCV2
Lâm sàng Cận lâm sàng
Ca bệnh PMWS Bệnh lý qPCR ELISA
PCR IHC
/PRDC Đại thể Vi thể (Ct value) (S/P)
1 + + + + > 40 kxn 0
2 + + + + > 40 kxn 1+
3 + + + + > 40 kxn 0
4 + + + + > 40 1,76) 0
5 + + + + kxn kxn 0
6 + + + + kxn 0,17 kxn
7 + + + + kxn 1,81 kxn
8 + + + + 38,7 1,89 0
9 + + + + > 40 2,21 0
10 + + + + 27,3 1,75 0
11 + + + + 29,8 0,55 1+
12 + + + + 25,4 0,38 1+
13 + + + + > 40 1,86 kxn
14 + + + + > 40 1,31 0
15 + + + + > 40 1,20 0
16 + + + + > 40 0,99 0
17 + + + + > 40 2,62 0
18 + + + + > 40 2,42 0
19 + + + + > 40 0,78 0
20 + + + + kxn kxn 0
21 + + + + kxn kxn kxn
330
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332
22 + + + + kxn kxn kxn
23 + + + + kxn kxn kxn
24 + + + + kxn kxn kxn
Tổng 24/24 24/24 24/24 24/24 4/15 13/15 3/16
Tỷ lệ (%) 100 100 100 100 26,7 86,7 18,8
Ghi chú: kxn, không xét nghiệm; +, kết quả dương; -, kết quả âm
4. KẾT LUẬN on Biotechnology in agriculture, Ho Chi
Minh city Vietnam. 65-67.
PCV2 thường nhiễm ghép với các mầm
Ouyang, T., Zhang, X., Liu, X., and Ren,
bệnh PRRSV, MH, HP và CSFV. Sự kết hợp
L. (2019). Co-infection of swine with
dấu hiệu lâm sàng, bệnh tích đặc trưng với kỹ
porcine circovirus type 2 and other swine
thuật xét nghiệm PCR có giá trị chắc chắn để
viruses. Viruses. 11(2): 185.
khẳng định ca bệnh do PCV2.
Palinski, R., Piñeyro, P., Shang, P., Yuan, F.,
TÀI LIỆU THAM KHẢO Guo, R., Fang, Y., Byers, E. and Hause,
Abhijit, K.B., Lee, H.Y., Jeong, H.W., M.B. (2017). A novel porcine circovirus
Truong, Q.L., Joo, H.G. and Hahn, distantly related to known circoviruses
T.W. (2012). An improved multiplex is associated with porcine dermatitis and
PCR for diagnosis and differentiation nephropathy syndrome and reproductive
of Mycoplasma hyopneumoniae and failure. Journal of virology. 91(1):
Mycoplasma hyorhinis. Korean J Vet e01879-16.
Res. 52(1): 39-43. Ren, L., Chen, X., Ouyang, H. (2016).
Chae, C.A (2005). review of porcine Interactions of porcine circovirus 2 with
circovirus 2-associated syndromes and its hosts. Virus Genes. 52: 437-444.
diseases. Vet. J. 169: 326-336. Segales, J. (2015). Best practice and future
Drolet, R., Larochelle, R., Morin, M., Delisle, challenges for vaccination against
B. and Magar, R. (2003). Detection rates porcine circovirus type 2. Expert Rev.
of porcine reproductive and respiratory Vaccines. 14: 473-487.
syndrome virus, porcine circovirus type Segalés, J., Sibila, M., Fort, M., Nofrarías,
2, and swine influenza virus in porcine M., Rozas D.P.A., Cardiel, G.I. and
proliferative and necrotizing pneumonia. Mateu, E. (2012). Simultaneous porcine
Veterinary pathology. 40(2): 143-148. circovirus type 2 and mycoplasma
Duy, D.T., Park, C., Choi, K., Jeong, J., hyopneumoniae co-inoculation does
Nguyen, T.T., Le, D.T., Vo, K.M. and not potentiate disease in conventional
Chae, C. (2015). Nucleotide sequence pigs. Journal of comparative pathology
analysis of Vietnamese highly pathogenic .147(2-3): 285-295.
porcine reproductive and respiratory Sinha, A., Shen, G.H., Schalk, S., Beach,
syndrome virus from 2013 to 2014 based M.N., Huang, W.Y., Meng, J.X., Halbur,
on the NSP2 and ORF5 coding regions. G.P. and Opriessnig, T. (2011). Porcine
Arch Virol. 161: 669-675. reproductive and respiratory syndrome
Lam Thu Huong and Duong Chi Mai (2006). virus (prrsv) influences infection
Detection of porcine circovirus from dynamics of porcine circovirus type 2
lesions of postweaning-pig with wasting (pcv2) subtypes pcv2a and pcv2b by
disease at some farms in Ho Chi Minh prolonging pcv2 viremia and shedding.
city and some adjacent provinces. Veterinary Microbiology. 152: 235-246.
Proceedings of international workshop Tischer, I., Mields, W., Wolff, D., Vagt,
331
- HỘI NGHỊ KHOA HỌC CHĂN NUÔI THÚ Y TOÀN QUỐC 2021 - AVS2021: 327-332
M. and Griem, W. (1986). Studies on J.W., Huang, L., Lin, T., Yue, C., Ran,
epidemiology and pathogenicity of D.L., Yuan, S.S. and Wei, W.K. (2011).
porcine circovirus. Archives of virology. Co-existence of multiple strains of
91(3-4): 271-276. porcine circovirus type 2 in the same pig
Xiao, C.T., Halbur, G.P. and Opriessnig, from china. Virol. J. 8: 517.
T. (2015). Global molecular genetic Zhang, H.H., Hu, W.Q., Li, J.Y., Liu, T.N.,
analysis of porcine circovirus type 2 Zhou, J.Y., Opriessnig, T. and Xiao,
(PCV2) sequences confirms the presence C.T. (2019). Novel circovirus species
of four main PCV2 genotypes and reveals identified in farmed pigs designated as
a rapid increase of PCV2d. Journal of porcine circovirus 4, Hunan province,
General Virology. 96(7): 1830-1841. China. Transboundary and Emerging
Zhai, S.L., Chen, S.N., Wei, Z.Z., Zhang, Diseases.
332
nguon tai.lieu . vn
