1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên và sàng lọc các chủng có khả năng kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Trần Thị Ngọc Phương1*, Đặng Thị Hoàng Oanh1 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 12

Ngày tạo 12/29/2020 11:49:55 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.35 M

Tên tệp

Tải Sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng kháng vi khuẩ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SÀNG LỌC VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Trần Thị Ngọc Phương1*, Đặng Thị Hoàng Oanh1 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên và sàng lọc các chủng có khả năng kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra. Kết quả cho thấy, 96 chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với vi khuẩn chỉ thị Escherichia coli được chọn, với 29 chủng phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)), 24 chủng từ cá lăng (Mystus nemurus (Valenciennes, 1839)), 21 chủng từ cá vồ đém (Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866)), 12 chủng từ cá trê (Clarias macrocephalus (Gunther, 1864)) và 8 chủng từ cá hú (Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866)). Kết quả nhuộm Gram và kiểm tra sinh hóa cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn lactic được chọn đều là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, hình cầu, hình oval, que ngắn hay que dài, oxidase và catalase âm tính. Kết quả xác định tính đối kháng và khả năng sinh bacteriocin, thu được 46 chủng thể hiện tính đối kháng và 3 chủng vi khuẩn thể hiện khả năng kháng khuẩn (sinh bacteriocin thô). Từ khóa: Aeromonas hydrophila, chế phẩm sinh học (probiotic), khả năng kháng khuẩn, vi khuẩn lactic I. ĐẶT VẤN ĐỀ 88% đối với bệnh xuất huyết trong các hộ nuôi Với khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước được khảo sát so với các bệnh khác và gây thiệt ngọt, Đồng bằng sông Cửu Long được đánh giá hại lớn cho người nuôi. có tiềm năng to lớn cho sự phát triển ngành nuôi Trước tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh trồng thủy sản. Bên cạnh các đối tượng nuôi như không đúng cách dẫn đến nhiều tác hại nghiêm tôm thẻ chân trắng, tôm sú,… cá tra cũng được trọng như hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn xem là đối tượng nuôi chủ lực, đem lại lợi nhuận gây bệnh, hay dư lượng thuốc kháng sinh cao cho người nuôi và góp phần vào giá trị xuất trong vật nuôi có thể gây hại đến sức khỏe con khẩu của cả nước. Theo báo cáo của Hiệp hội người. Đặc biệt, đối với vi khuẩn gây bệnh A. cá tra Việt Nam, tính đến ngày 30/6/2015 diện hydrophila, hiện tượng kháng thuốc kháng sinh tích nuôi thả mới tại ĐBSCL là 1.959 ha (tăng diễn ra ngày càng phức tạp, Quách Văn Cao 0,21% so với cùng kỳ năm 2014), sản lượng đạt Thi và ctv., (2014) đã chỉ ra rằng hầu hết các 516.140 tấn (tăng 1,22% so với cùng kỳ), tổng chủng A. hydrophila kháng hoàn toàn với kháng kim ngạch xuất khẩu cá tra đến 31/5/2015 đạt sinh nhóm penicillin, cefalexin và trimetroprim/ hơn 616 triệu USD. Tuy nhiên, trong hiện trạng sunfamethoxazol. Nên, việc nghiên cứu để tìm thâm canh hóa mô hình nuôi cá tra như hiện nay, những giải pháp thay thế tốt hơn cho phòng và trị tình hình dịch bệnh đang diễn ra phức tạp và bệnh là việc cần thiết. Trong số những giải pháp khó kiểm soát gây ra thiệt hại lớn cho người tìm được, chế phẩm sinh học được xem như một nuôi cá tra, trong đó, bệnh xuất huyết (tác nhân giải pháp thay thế tiềm năng vì vi khuẩn hữu ích gây bệnh là A. hydrophila) là một trong những có khả năng bám dính cao trong biểu mô ruột và bệnh nguy hiểm với tần suất xuất hiện khoảng còn nâng cao hệ miễn dịch của động vật. Trong 1. Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ. * Email: phuongb1206814@student.ctu.edu.vn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 55
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II đó, vi khuẩn lactic được chứng minh có chức 2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn năng như probiotics, có lợi với sức khỏe vật (Nirunya et al., 2008) chủ khi được bổ sung đủ số lượng trong đường Mỗi mẫu ruột cá được lấy khoảng 25 gram/ ruột (Nirunya et al., 2008), vi khuẩn lactic có cá rồi cho vào ống nghiệm chứa nước muối thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau sinh lý (NaCl 0,9%) đã tiệt trùng và dùng que như các sản phẩm lên men, đường ruột gia súc, vô trùng để nghiền. Tiến hành pha loãng về các đường ruột các loài thủy sản,… Vi khuẩn lactic nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 và 10-4 bằng nước muối là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình cầu hoặc NaCl 0,9%. Lấy 1ml mỗi dung dịch pha loãng hình que, catalase âm tính, không sinh bào tử. và trộn với 20ml MRS (de Man, Rogosa and Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn tạo ra acid lactic, Sharpe) (450C) rồi đổ lên đĩa petri đã được tiệt ethanol, hợp chất thơm và bacteriocin (Chen và trùng. Đĩa petri được ủ ở 280C trong 24 giờ. Hoover, 2003). 2.3. Phương pháp nuôi tăng sinh vi Tuy việc sàng lọc vi khuẩn lactic từ ruột khuẩn chỉ thị (Nirunya et al., 2008) cá không còn là chủ đề mới, và những chủng Các loài vi khuẩn chỉ thị A. hydrophila và vi khuẩn có khả năng sử dụng làm probiotic đã E. coli được nuôi khoảng 20 giờ trong 10ml được tìm thấy trước đây bao gồm Lactobacillus môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) ở 280C. acidophilus, L. johnsonii, L. casei, L. gasseri, 1ml vi khuẩn đã nuôi cấy được lấy chuyển sang L. plantarum, L. rhamnosus, Bifidobacterium 9ml môi trường lỏng và ủ trong 18 giờ ở 280C, longum, B. breve, B. bifidum, B. infantis, mật độ vi khuẩn sau đó được điều chỉnh để đạt Enterococcus faecalis và Enterococcus faecium. 106 CFU/ml dùng cho việc xác định hoạt động Nhưng hầu hết những nghiên cứu trước đây vẫn kháng khuẩn. chưa thực hiện nhiều trên cá da trơn nước ngọt thu từ tự nhiên. 2.4. Phương pháp chọn lọc vi khuẩn có tính kháng khuẩn (Nirunya et al., 2008) Do vậy nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn Chọn lấy những đĩa petri có từ 20-30 khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn tự nhiên có khả lạc của vi khuẩn lactic. Phủ lên đĩa petri đã chọn năng kháng với vi khuẩn A.hydrophila gây bệnh 10 ml môi trường MHB (Mueller-Hinton Broth) xuất huyết trên cá tra, có tiềm năng sử dụng làm (0,75% agar) chứa vi khuẩn chỉ thị E.coli với probiotics, tạo bộ sưu tập vi khuẩn cho những mật độ 105-106 CFU/ml và ủ trong 24h ở 280C. nghiên cứu sâu hơn về vi sinh hữu ích từ các Quan sát và ghi nhận kích thước vòng tròn vô loài cá tự nhiên hoặc cho các thí nghiệm trong trùng xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn. điều kiện in vivo để phòng bệnh xuất huyết trên 2.5. Phương pháp xác định tính đối cá tra. kháng và khả năng sinh bacteriocin (Nirunya et al., 2008) II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tiến hành đổ đĩa môi trường NA (Nutrient 2.1. Phương pháp thu mẫu Agar), sau đó tráng lên 10 ml MHA (Mueller- Mẫu cá da trơn: cá tra, cá lăng, cá trê, cá vồ Hinton Agar) (0,75% agar) có bổ sung vi khuẩn đém được mua từ chợ và từ các ghe cào, tình gây bệnh A. hydophila mật độ 105 – 106 CFU/ trạng cá thu mẫu còn khỏe, bên ngoài không ml agar; và tạo các giếng trên đĩa thạch (d=5- trầy xướt, không xuất huyết. Mỗi loại cá thu 10 6mm). Vi khuẩn lactic sau khi nuôi trong MRS con, cỡ cá khoảng 300 – 400 gram/con, sẽ được (de Man, Rogosa và Sharpe) lỏng ở 280C trong chuyển bằng thùng xốp có sục khí về phòng thí 48 giờ, đem ly tâm 7.000 vòng/phút trong 15 nghiệm để phân tích. Mẫu cá được xịt cồn tiệt phút. Thu phần dung dịch bên trên và chia làm trùng bên ngoài, sau đó cắt lấy đoạn ruột giữa hai phần. Với phần (i) không xử lý, phần (ii) và dạ dày trong điều kiện vô trùng để tiến hành điều chỉnh pH (6,5 – 7,0) dung dịch bằng NaOH phân lập vi khuẩn. 1M để thu dung dịch có khả năng có bacteriocin 56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II thô. Sau đó cho 80µl phần mỗi dung dịch (i) và (1998) đã phân lập và định danh vi khuẩn lactic (ii) vào mỗi giếng. Dung dịch Doxycycline 100 trong đường ruột và phân cá đã xác định rằng vi ppm và MRS broth được sử dụng để làm đối khuẩn lactic chỉ tồn tại một phần rất nhỏ trong chứng dương và đối chứng âm. Ủ ở 28oC trong hệ đường ruột cá (Nirunya B. và ctv., 2008). 24 giờ. Tuy nhiên, nghiên cứu của Nirunya B. và ctv., Xác định tính đối kháng của các chủng vi (2008) đã chỉ ra rằng, vi khuẩn lactic tồn tại với khuẩn lactic đối với vi khuẩn gây bệnh thông số lượng lớn trong đường ruột cá biển với 160 qua đường kính các vòng vô trùng theo Aslim chủng phân lập được. Nguyễn Văn Thành và và ctv., (2005). Nguyễn Ngọc Trai (2012) đã phân lập được 45 2.6. Phương pháp định danh vi khuẩn dòng vi khuẩn từ dạ dày, ruột cá tra và cá rô phi thu từ các ao nuôi thâm canh. Dương Thị Hình dạng, kích thước và tính vòng của vi Kim Loan (2013) đã phân lập được 64 chủng khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm vi khuẩn lactic từ ruột cá tra và cá rô phi được Gram (Barrow  và  Feltham, 1993). Đặc điểm thu từ chợ và ao nuôi. Cùng với những nghiên sinh lý sinh hóa được kiểm tra bằng phản ứng cứu trên, nghiên cứu này đã phân lập được 96 catalase, oxidase, nhuộm bào tử và xác định chủng vi khuẩn lactic từ đường ruột cá da trơn theo cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow và nước ngọt, sống tự nhiên, thu từ các chợ và ghe Feltham, 1993). Sau đó các chủng có tính đối cào. Từ đây, có thể kết luận rằng, hệ vi sinh kháng mạnh với A.hydrophila và có khả năng đường ruột cá (cả cá nước mặn và cá nước ngọt) sinh bacteriocin đối kháng được giải trình tự là nguồn dự trữ phong phú vi khuẩn lactic, đặc định danh tại công ty công nghệ sinh học Nam biệt đối với cá da trơn, trong đó vi khuẩn phân Khoa bằng phương pháp sinh học phân tử. lập từ cá tra chiếm số lượng nhiều nhất (30%) 2.7. Phương pháp xử lý số liệu trong tổng số chủng vi khuẩn phân lập được. Sử dụng phần mềm Microsoft Office Excel Các dòng vi khuẩn phân lập từ cá da trơn này 2007 để thống kê và so sánh đường kính vòng có nguồn gốc từ môi trường nước tự nhiên, xâm vô trùng gây ra bởi các chủng vi khuẩn lactic. nhập và cư trú hệ tiêu hóa của cá thông qua thức Từ đó, xác định được các chủng có tính kháng ăn tự nhiên hoặc môi trường nước (Nguyễn Văn khuẩn cao từ các loài cá và xác định chủng tốt Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012). nhất thuộc loài cá nào. 3.2. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN lập được 3.1. Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic Những chủng được chọn được tiến hành có tính kháng khuẩn từ đường ruột cá da trơn kiểm tra đặc điểm sinh lí sinh hóa trước khi tiếp Kết quả phân lập từ 5 loài cá da trơn nước tục thực hiện thử tính đối kháng với vi khuẩn ngọt đã tuyển chọn được 96 chủng vi khuẩn A.hydophila. Kết quả cho thấy, hầu hết chúng lactic, trong đó có 29 chủng được phân lập cá đều có khuẩn lạc tròn, bóng, bìa nguyên và có tra (P. hypophthalmus), 24 chủng từ cá lăng (M. đường kính dao động từ 0,5mm đến 1,2mm. nemurus), 21 chủng từ cá vồ đém (P. larnaudii), Ngoài ra, quan sát dưới kinh hiển vi quang học 12 chủng từ cá trê (C. macrocephalus) và 8 cho thấy chúng là những vi khuẩn Gram dương, chủng từ cá hú (P. larnaudii) dựa trên khả năng không sinh bào tử, hình cầu, hình oval, hình que ức chế vi khuẩn E.coli khi tạo ra vùng vô trùng ngắn hay que dài, catalase và oxidase âm tính. trên môi trường có chứa E. coli (Hình 1A). Mặc Đặc biệt, xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vùng dù trước đây, vi khuẩn lactic được phân lập chủ trong suốt của một trường do CaCO3 bị phân yếu từ thực phẩm lên men, từ sữa hay trong giải, khi phát triển trên môi trường MRS có 0,5% ruột của nhiều loài động vật như chuột, lợn, gà CaCO3 (Hình 1B, 1C). Những đặc điểm này phù và người; thêm vào đó, Ringø và Gatesoupe hợp với đặc điểm của giống Lactobacillus được TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 57
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II mô tả bởi Kandler và Wiss (1986) (Nguyễn Văn Lactobacillus, trong đó, vi khuẩn hình oval và Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012). Vì vậy có hình que ngắn chiếm ưu thế với số chủng theo thể kết luận rằng, 96 chủng vi khuẩn phân lập từ thứ tự là 43 chủng (45%) và 39 chủng (41%) ruột cá da trơn sống tự nhiên đều thuộc giống (Bảng 1). Hình 1: A: Khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên đĩa thạch MRS được tráng bằng MHB 0,75% agar chứa vi khuẩn E.coli; B, C: Vi khuẩn lactic có khả năng làm tan vôi khi phát triển trên đĩa thạch MRS có chứa 0,5% CaCO3 Bảng 1: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được từ ruột cá da trơn tự nhiên Hình thái tế bào vi khuẩn Nguồn phân lập Hình cầu Hình oval Hình que ngắn Hình que dài Cá tra (Pangasius CT1.1 CT1.2 CT2.8 CT4.8 hypophthalmus (Sauvage, 1878)) CT10.2 CT2.1 CT2.9 CT8.3 CT4.6 CT3.3 CT4.9 CT3.4 CT4.14 CT3.6 CT7.1 CT3.7 CT7.2 CT3.8 CT7.3 CT4.4 CT8.6 CT4.10 CT10.1 CT8.7 CT8.10 CT8.11 CT8.15 CT8.16     CT10.8   58 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cá lăng (Mystus nemurus CL9.5 CL2 CL1 (Valenciennes, 1839)) CL10.20 CL3 CL8.23 CL10.3 CL8.26 CL4 CL10.1 CL8.20 CL10.4 CL8.21 CL10.6 CL9.3 CL10.7 CL9.6 CL10.10 CL10.8 CL10.37 CL10.14 CL10.22 CL10.23 CL10.29     Cá trê (Clarias TV8.7 TV2 TV3 macrocephalus (Gunther, 1864)) TV8.3 TV4 TV8.6 TV8.10 TV8.11 TV8.14 TV8.15 TV8.16 TV8.17 TV8.18 TV8.23     Cá hú (Pangasius CH4.1 CH2 CH5.1 conchophilus (Roberts & CH4.2 Vidthayanon, 1991)) CH4.3 CH4.4 CH4.5   CH4.7     Cá vồ đém (Pangasius VD1.4 VD3.3 VD1.5 VD4.6 larnaudii (Bocourt, 1866)) VD4.3 VD3.8 VD1.6 VD5.3 VD4.11 VD3.11 VD2.1 VD5.2 VD4.1 VD2.2 VD3.6 VD3.7 VD3.10 VD3.12 VD4.7 VD4.8     VD5.1   TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 59
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.3. Tính đối kháng và khả năng sinh có nhiều khả năng đối kháng được với hai chủng bacteriocin thô vi khuẩn gây bệnh trên. Thực tế từ nghiên cứu Vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của này đã cho thấy, trong 96 chủng vi khuẩn lactic tác nhân gây bệnh bằng việc sinh ra các acid chọn lọc được, có 46 chủng thể hiện tính đối hữu cơ và H2O2. Các acid hữu cơ ức chế vi kháng và 3 chủng có khả năng sinh bacteriocin. khuẩn Gram âm, vi khuẩn gây bệnh, vi khuẩn Trong đó, các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ gây hư hỏng thực phẩm, nấm,… Trong đó, cá tra chiếm số lượng nhiều nhất với 22 chủng, acid hữu cơ có khả năng sinh chất ức chế và 15 chủng phân lập từ cá lăng. Vi khuẩn lactic diệt khuẩn với acid acetic mạnh hơn acid lactic, phân lập từ cá vồ đém có 7 chủng, từ cá trê chỉ có 2 chủng thể hiện tính đối kháng và vi khuẩn ngoài ra vi khuẩn lactic còn sinh H2O2 có khả phân lập từ cá hú không thể hiện tính đối kháng năng diệt khuẩn Gram âm và cả Gram dương với A. hydrophila. Hầu hết các chủng vi khuẩn với cơ chế sinh ra supeoxide (O2-) và các gốc lactic đều thể hiện tính kháng trung bình (với hydroxyl (OH-) tự do phá hủy DNA tạo hiệu đường kính vùng vô trùng trung bình (d) từ quả diệt khuẩn (Dilek, 2014). Bên cạnh đó, A. 4,5mm đến 9,5mm) và yếu (d= 2mm ÷ 4mm) hydrophila và E. ictaluri đều là vi khuẩn Gram (Aslim và ctv., 2005) (Hình 2). âm cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được Hình 2: Đường tròn vô trùng tạo ra bởi vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila. (+): đối chứng dương (kháng sinh Doxycycline 100ppm); (-): đối chứng âm (môi trường MRS lỏng); 1.1, 2.1: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic không xử lý; 1.2, 2.2: dung dịch ly tâm từ vi khuẩn lactic chuẩn pH (6,5-7) bằng dung dịch NaOH 1M. Ngoài acid hữu cơ và H2O2, vi khuẩn lactic acidilactici) là những bacteriocins phổ biến và còn có khả năng sinh bacteriocin, bacteriocin là được sử dụng nhiều nhất trong các sản phẩm những chuỗi peptide hay protein được sinh ra lên men (Dilek, 2014). Nhiều báo cáo đã chứng bởi một vài chủng vi khuẩn, hầu hết bacteriocin minh dòng Lactobacillus có khả năng sinh diệt những tế bào đích bằng tính thấm của màng bacteriocins “lactocidin”. Thực tế, nghiên cứu tế bào và hoạt động đặc hiệu vì chúng yêu cầu đã tìm ra được 3 chủng CL2, CL10.20 (phân những chất thụ cảm đặc hiệu trên bề mặt tế lập từ cá lăng) và CT3.7 (phân lập từ cá tra) bào đích. Bacteriocin được phân loại theo đặc có khả năng sinh bacteriocin trung bình và yếu điểm sinh hóa và đặc điểm di truyền, trong với đường kính vòng vô trùng lần lượt là 9mm, đó Nisin (L. lactis) và Pediocin (Pediococcus 4mm và 2mm (Bảng 2). 60 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 2: Bảng đường kính vòng vô trùng gây ra bởi hoạt động kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn chỉ kháng với Aeromonas hydrophila A.hydrophila Khả năng đối kháng Khả năng sinh bacteriocin Nguồn Tên chủng Đường kính vòng Đường kính vòng phân lập Độ nhạy(*) Độ nhạy(*) vô trùng (mm) vô trùng (mm) Cá tra CT8.3 8 (++) 0 (-) CT7.3 7 (++) 0 (-) CT8.7 7 (++) 0 (-) CT8.15 7 (++) 0 (-) CT3.6 6 (++) 0 (-) 3. CT3.7 4. 6 5. (++) 6. 2 7. (+) CT4.4 6 (++) 0 (-) CT8.11 6 (++) 0 (-) CT8.16 6 (++) 0 (-) CT10.8 6 (++) 0 (-) CT7.1 5 (++) 0 (-) CT8.6 5 (++) 0 (-) CT10.2 5 (++) 0 (-) CT3.8 4 (+) 0 (-) CT4.9 4 (+) 0 (-) CT4.10 4 (+) 0 (-) CT2.8 3 (+) 0 (-) CT2.1 2 (+) 0 (-) CT2.9 2 (+) 0 (-) CT3.3 2 (+) 0 (-) CT3.4 2 (+) 0 (-) CT7.2 2 (+) 0 (-) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 61
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cá lăng CL2 13 (++) 9 (++) CL10.20 6 (++) 4 (+) CL8.20 3 (+) 0 (-) CL8.21 3 (+) 0 (-) CL9.3 3 (+) 0 (-) CL9.6 3 (+) 0 (-) CL10.14 3 (+) 0 (-) CL10.22 3 (+) 0 (-) CL10.29 3 (+) 0 (-) CL3 2 (+) 0 (-) CL8.26 2 (+) 0 (-) CL10.7 2 (+) 0 (-) CL10.10 2 (+) 0 (-) CL10.23 2 (+) 0 (-) CL10.37 2 (+) 0 (-) Cá trê TV3 4 (+) 0 (-) TV4 4 (+) 0 (-) Cá vồ VD4.8 10 (++) 0 (-) đém VD4.11 9 (++) 0 (-) VD5.3 9 (++) 0 (-) VD1.5 5 (++) 0 (-) VD4.6 5 (++) 0 (-) VD4.7 5 (++) 0 (-) VD1.6 2 (+) 0 (-) Đối DC(+) 14 (++) chứng   DC(-) 0 (-) (*) (+): khả năng kháng khuẩn yếu (d=2÷4mm), (++) khả năng kháng khuẩn trung bình (d=4÷14mm), (+++) khả năng kháng khuẩn mạnh (d=14÷24mm), (-) Không nhạy (d=0) 3.4. Định danh các chủng vi khuẩn lactic Kết quả, 2 chủng CL2 và CL10.20 phân lập từ có khả năng sinh bacteriocin thô cá lăng xác định là chủng Lactobacillus reuteri Sau khi đã tìm được 3 chủng vi khuẩn HFI-LD5 có độ tương đồng theo thứ tự 100% lactic (CL2, CL20 và CL3.7) có khả năng sinh (548/548bp) và 99% (551/552bp), chủng CT3.7 bacteriocin thô, các chủng này được phục hồi và phân lập từ cá tra xác định là chủng Lactobacillus tách ròng trên đĩa thạch MRS. Sau đó gửi mẫu fermentum JCM- 1173 với độ tương đồng 100% đến Công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam (539/539bp). Trình tự gen của các chủng vi Khoa, thực hiện định danh, giải trình tự gen 16S khuẩn này được trình bày ở Bảng 4. rRNA và được tra cứu trên BLAST SEARCH 62 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 4: Trình tự gen của Lactobacillus fermentum JCM- 1173 và Lactobacillus reuteri HFI- LD5 Chủng Trình tự gen Lactobacillus fer- AT C C T G G C T C A G G AT G A A C G C C G G C G G T- mentum JCM- 1173 G T G C C TA ATA C AT G C A A G T C G A A C G C G T T G - GCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATT- GATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT- G A G TA A C A C G TA G G TA A C C T G C C C A G A A G - CGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATAC- CGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCT- TAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATG- GACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAAC- GGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTT- GAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGA- C A C G G C C C ATA C T C C TA C G G G A G G C A G C A G - TAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATG- GAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCG- GCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACG- TATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTA- ACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAG Lactobacillus reuteri GGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGC- HFI-LD5 CGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGTACG- CACTGGCCCAACTGATTGATGGTGCTTGCACCT- GATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGAC- GGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGC- GGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCG- CATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAA- GATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCT- GCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCT- TACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGA- CTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTC- CATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC- CACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGC- GTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCT- GTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACT- GTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGT- CACGGCTAACTACGTGCCAG Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram trong quá trình lên men nguyên liệu động vật dương, thuộc loài Lactobacillus, được tìm thấy và thực vật. L. fermentum được xác định như TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 63
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II probiotic tiềm năng với khả năng làm giảm hoạt động trong khoảng pH rộng và kháng với cholesterol tốt hơn hẳn các loài Lactobacillus enzyme phân giải protein và lipid, có khả năng khác bằng việc hấp thụ cholesterol, thúc đẩy ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn gây hại quá trình chuyển hóa cholesterol. Một nghiên gram dương và Gram âm, các loài thuộc nấm cứu khác của Allameh và ctv., 2013, đã xác định và động vật nguyên sinh. Đã có những nghiên L. fermentum HM579790, được phân lập từ dạ cứu tìm thấy L. reuteri có thể sinh đủ lượng dày cá lóc (Channa striatus) sống tự nhiên, có reuterin để gây ra những hiệu quả diệt khuẩn tiềm năng làm probiotic trong nuôi cá lóc khi đáng mong đợi (Lei et al., 2011). Nghiên cứu cho thấy khả năng ức chế A. hydrophila cao này được xem như nghiên cứu khởi phát cho nhất trong 13 chủng vi khuẩn phân lập được việc phát hiện L. reuteri tồn tại trong ruột động trong điều kiện in vitro với đường kính vùng vô vật thủy sản, cụ thể là cá lăng sống tự nhiên với trùng 8mm và khả năng cải thiện tỉ lệ sống của khả năng đối kháng và sinh bacteriocin đối với cá lóc (Channa striatus) có ý nghĩa thống kê A. hydrophila. khi bổ sung 2x106CFU/g vi khuẩn L. fermentum Kết quả này có ý nghĩa rất lớn cho những vào khẩu phần. Trong nghiên cứu này, chủng nghiên cứu về vi khuẩn có tiềm năng làm L. fermentum JCM-1173 được sàng lọc từ probiotic trong phòng bệnh gan thận mủ và đường ruột cá tra, tuy khả năng đối kháng (sử bệnh xuất huyết trên cá tra khi mà việc sử dụng dụng dịch huyền phù được lọc vô trùng) của sinh vật đối kháng và bacteriocin để ức chế lại L. fermentum JCM-1173 (6mm) nhỏ hơn L. A.hydrophila là vấn đề tương đối mới vì hiện fermentum HM-579790 (8mm) nhưng nghiên nay chưa tìm thấy nghiên cứu nào được thực cứu đã xác định được khả năng sinh bacteriocin hiện trong và ngoài nước sử dụng Lactobacillus đối với A.hydrophila. spp. hay bacteriocin do vi khuẩn sinh ra để ức Lactobacillus reuteri được ghi nhận vào chế lại. phân loại khoa học của vi khuẩn lactic vào đầu IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ thế kỉ 20, mặc dù vào thời điểm này, loài này bị nhầm lẫn với nhóm vi khuẩn Lactobacillus Kết luận: Trong nghiên cứu này đã thực fermentum. Đến những năm 60 của thế kỉ 20, hiện phân lập được 96 chủng vi khuẩn lactic nhà vi sinh học người Đức Gerhard Reuter đã từ ruột cá da trơn tự nhiên, trong đó có 46 phân biệt L. reuteri và L. fermentum và phân chủng thể hiện tính đối kháng vi khuẩn gây loại vào loài L. fermentum dạng sinh học II. bệnh A.hydrophila. Từ nghiên cứu, đã tìm Đến năm 1980, Kandler và cộng sự đã xác định được 3 chủng vi khuẩn có khả năng sinh sự khác biệt rõ giữa L. reuteri và những dạng bacteriocin thô, có tiềm năng sử dụng làm sinh học khác của L. fermentum, từ đó tên khoa probiotic. Kết quả định danh đã xác định 2 học “reuteri” đã được chọn theo tên của nhà chủng sinh bacteriocin phân lập từ cá lăng là khoa học Gerhard Reuter để phân biệt với L. Lactobacillus reuteri, chủng phân lập từ cá tra fermentum. L. reuteri được phân lập từ nhiều là Lactobacillus fermentum. nguồn thực phẩm, đặc biệt là các sản phẩm từ Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu về tối ưu hóa thịt và sữa. L. reuteri là vi khuẩn lên men dị điều kiện môi trường nuôi đối với khả năng hình, Gram dương, hình que cong với đầu tròn đối kháng và sinh bacteriocin của L. reuteri đơn, theo cặp hoặc những cụm nhỏ, hoạt động và L. fermentum, tiếp tục nghiên cứu hợp chất probiotic của loài này được thể hiện qua khả bacteriocin sinh ra bởi L. fermentum, thực năng ức chế hoạt động của tác nhân gây bệnh, hiện nghiên cứu khả năng đối kháng và sinh kết hợp nhiều cơ chế bao gồm sản sinh acid bacteriocin của hai chủng vi khuẩn này đối với lactic, H2O2 và bacteriocin. Bacteriocin sinh ra các chủng vi khuẩn gây bệnh khác trên động vật bởi loài này là reuterin. Reuterin là hợp chất thủy sản, thực hiện thí nghiệm trong điều kiện trung tính của các phân tử nhẹ, tan trong nước, in vivo,… 64 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TÀI LIỆU THAM KHẢO Aslim, B., Z. N. Yuksekdag, E. Sarikaya and Tài liệu tiếng Việt Y. Beyatli, 2005. Determination of the bacteriocin-like substances produced by some Dương Thị Kim Loan, 2013. Phân lập và đánh giá lactic acid bacteria isolated from Turkish dairy khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic đối products. LWT. 38: 691-694. với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasius hypothalamus). Barrow, G.I. and Feltham, R.K.A. (1993). Cowan Luận văn cao học ngành nuôi trồng thủy sản, and steel’s manual for the identification of 2013, Trường Đại học Cần Thơ. medical bacteria. 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 331. Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus Chen, H. and Hoover, D., 2003. Bacteriocins and sp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan their Food Applications. Compr. Rev. Food thận mủ và đốm đỏ trên cá tra. Tạp chí Khoa Science. Food Safety, 2: 82-89. học Đại học Cần Thơ, 2012:23a 224-234. Dilek Heperkan, 2014. Antimicrobial activity Quách Văn Cao Thi, Từ Thanh Dung và Đặng Phạm of lactic acid bacteria on pathogens in foods Hòa Hiệp, 2014. Hiện trạng kháng thuốc kháng – Why successful? How successful?. Food sinh trên hai loài vi khuẩn Edwardsiellaictaluri Technology 2014, 21-23 July, Las Vegas. và Aeromonashydrophila gây bệnh trên cá tra Lei, B., A. L. Molan, L. S. Maddox, Q. Shu, (Pangasianodonhypophthamus) ở Đồng bằng 2011. Antimicrobial activity of Lactobacillus sông Cửa Long. Tạp chí Khoa học Trường Đại reuteri DPC16 supernatants against selected học Cần Thơ, Số chuyên đề: Thủy Sản (2014) food borne pathogens. World Journal of (2): 7-14. Microbiology and Biotechnology  (Impact Tài liệu tiếng Anh Factor: 1.78). 04/2011; 27(4):991-998. Allameh, S.K., F.M. Yusoff, H.M. Daud, E. Ringø, Nirunya, B., C. Suphitchaya and H. Tipparat, A.Ideris and C. R.Saad, 2013. Characterization 2008. Screening of lactic acid bacteria from of probiotic Lactobacillus fermentum isolated gastrointestinal tracts of marine fish for their from snakehead, Channa striatus, stomach. potential use as probiotics. Songklanakarin Journal of the World Aquaculture Society. J. Sci. Technol.30 (Suppl.1), 141-148, April Volume 44, Issue 6, pages 835–844, December 2008. 2013. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 65
  12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SCREENING OF LATIC ACID BACTERIA FOR THEIR ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST Aeromonas hydrophila CAUSING HEMORRHAGIC DISEASE IN TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) Tran Thi Ngoc Phuong1*, Dang Thi Hoang Oanh1 ABSTRACT The research was conduted to isolate acid lactic bacteria from the gastroinstestinal tracts of wild freshwater catfish and then screen for their antimicrobial activity against Aeromonas hydrophila causing Hemorrhagic disease in cultured Tra catfish. As the result, 96 strains of lactic acid bac- teria which had inhibitory activity against indicator bacteria Escherichia coli were selected with 29 strains isolated from stripped catfish (Pangasianodon hypophthalmus  (Sauvage, 1878)), 24 strains from Mystus nemurus (Valenciennes, 1839), 21 strains from Pangasius larnaudii (Bocourt, 1866), 12 strains from Clarias macrocephalus (Gunther, 1864) and 8 strains from Pangasius larn- audii (Bocourt, 1866). The result of Gram staining and biochemical characteristic tests illustrated most of selected strains of lactic acid bacteria were Gram-positive; nonsporulating; spherical, oval, short rod or long rod shape; negative oxidase and negative catalase. The result of antagonistic activ- ity determination indicated that 46 LAB strains exhibited their inhibitory activity and three of them presented the ability to produce bacteriocin-like substances. Keywords: Aeromonas hydrophila, antimicrobial activity, lactic acid bacteria, probiotic. Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 25/11/2016 Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016 Ngày duyệt đăng: 05/01/2017 1 College of Aquacutulre and Fisheries, Cantho University. * Email: phuongb1206814@student.ctu.edu.vn 66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng