- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi
Xem mẫu
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
SÀNG LỌC CÁC DÒNG NẤM MEN MANG GEN VP28 THÍCH HỢP ĐỂ
SẢN XUẤT TOLERINE PHÒNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM NUÔI
Ngô Thị Ngọc Thủy1*, Đặng Thị Trà My1
TÓM TẮT
Việc sử dụng tế bào nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp đã được
nghiên cứu và sản xuất nhiều loại vaccine phòng bệnh cho động vật có xương sống nhưng được vận
dụng hạn chế trong nghiên cứu bệnh thủy sản nói chung và bệnh tôm nói riêng. Nghiên cứu này tiến
hành sàng lọc 150 chủng nấm men Pichia pastoris có mang gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus
đốm trắng nhằm tạo nguyên liệu cho sản xuất toreline phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Các
chủng nấm men được chọn lọc dựa trên kiểu hình (Mut+), số lượng bản sao gen mục tiêu, khả năng
biểu hiện protein và tốc độ sinh trưởng. Quá trình sàng lọc đã chọn được 125 chủng mang kiểu hình
Mut+, 82 chủng có mang 14-16 bản sao của gene VP28-His trong genome và 8 chủng có khả năng
biểu hiện protein tốt. Trong 8 chủng chọn lọc, chủng 11 cho tốc độ sinh trưởng nhanh, đạt mật độ
tế bào cao nhất (3,92x109 tế bào/ml) và lượng protein VP28 nhiều nhất sau 84 giờ kích thích biểu
hiện. Chủng này được dùng làm nguyên liệu để điều chế toreline phòng bệnh đốm trắng trong các
nghiên cứu tiếp theo.
Từ khóa: VP28, Pichia pastoris, bệnh đốm trắng.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ tiêm. Việc dùng vaccine bằng cách tiêm ngoài
Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus gây việc yêu cầu nhiều công lao động, dễ gây stress
bệnh nghiêm trọng và phổ biến ở tôm nuôi. cho vật chủ, có thể tạo ổ viêm tại vị trí tiêm,
Bệnh này là nguyên nhân chủ yếu gây ra những nó còn không thích hợp trong điều kiện thực tế
tổn hại kinh tế lớn đối với ngành công nghiệp nuôi tôm khi số lượng vật chủ thường lớn và
nuôi tôm trên toàn thế giới. Gần đây, nhiều loại rất mẫn cảm với sự thay đổi của điều kiện môi
vaccine phòng bệnh đốm trắng đã được nghiên trường. Vì vậy, việc nghiên cứu vaccine tái tổ
cứu như vaccine bất hoạt, vaccine nhược độc hợp và quản lý bằng phương pháp cho ăn đã
(Namikoshi et al., 2004; Singh et al., 2005) được trú trọng nhiều hơn, đặc biệt là các protein
hoặc vaccine tái tổ hợp dùng để tiêm cho tôm hay DNA vaccine chế tạo từ gen VP28 của virus
(Namikoshi et al., 2004; Rout et al., 2007; gây bệnh đốm trắng trên các hệ thống biểu hiện
Witteveldt et al., 2004b). Những loại vaccine khác nhau (Caipang et al., 2008; Fu et al., 2011;
này có một số nhược điểm như có yếu tố rủi Kim et al., 2007; Kumar et al., 2008; Ning et
do tiềm tàng khi vaccine nhược độc trở thành al., 2011; Musthaq and Jimmy,2011; Satoh et
có độc lực, hay cần bổ sung thêm chất bổ trợ al.; Witteveldt et al., 2004a; Witteveldt et al.,
hoặc phải đưa vào vật chủ vài lần bằng đường 2004b; Witteveldt et al., 2006).
1
Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.
* Email: thuyngo8@yahoo.com
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 75
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Trong thực tế, có 4 hệ thống biểu hiện sự 03 chủng đối chứng (chủng nấm men GS115
sống: tế bào vi khuẩn, nấm men, tế bào côn trùng mang plasmid pPICK9K rỗng). Các chủng nấm
và các hệ thống biểu hiện bằng tế bào động vật men này được hình thành từ 03 đợt hóa biến
có vú và tế bào thực vật đã được nghiên cứu sử nạp pPICK9K-VP28 vào tế bào nấm men của
dụng để sản xuất vaccine (Hansson et al., 2000). đề tài cấp Bộ “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất
Việc sử dụng tế bào nấm men để điều chế protein tolerin có khả năng hạn chế lây lan của virus
vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cho người và gia gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương
súc đã được ứng dụng rộng rãi do nấm men kết phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long». Bên cạnh
hợp được những ưu điểm của sinh vật đơn bào đó, nghiên cứu còn sử dụng một số loại trang
và sinh vật có nhân điển hình. Ví dụ như các thiết bị, dụng cụ, hóa chất dùng trong nghiên
ưu điểm của việc sản xuất protein tái tổ hợp từ cứu sinh học phân tử và nuôi cấy nấm men như
tế bào nấm men Pichia pastoris bao gồm: sinh máy luân nhiệt, máy quang phổ so màu, tủ ấm
trưởng nhanh, cho mật độ tế bào lớn, sản xuất ra lắc, máy ly tâm, bộ điện di đứng, môi trường
nhiều protein, không bị tạp nhiễm với nội độc tố Yeast extract Peptone Dextrose (YPD), YPD-
và thể thực khuẩn, dễ thao tác di truyền, không Agar, YPD- Geneticin, Minimal dextrose (MD),
là vật mang các tác nhân gây bệnh cho người,… Minimal methanol (MM),...
(Eda và Pinar, 2012; Li et al., 2007). Theo 2.2. Phương pháp nghiên cứu
Balamurugan et al., (2007) đã cho thấy, hiệu suất
2.2.1. Chọn lọc dòng nấm men có kiểu
biểu hiện protein trên tế bào nấm men P. pastoris
hình Mut+
cao gấp 10-100 lần so với trên tế bào E. coli. Tuy
nhiên, việc sử dụng tế bào nấm men làm hệ thống 153 chủng P. pastoris pPIC9K-VP28 nghiên
biểu hiện để sản xuất vaccine phòng bệnh đốm cứu sẽ được cấy 3 đợt (50 chủng thí nghiệm và
trắngcòn hạn chế và vaccine nàycòn chưa được 01 chủng đối chứng/đợt) lần lượt trên các môi
thử nghiệm trên tôm (Jha et al., 2007; Jha et al., trường MM, và MD ở 280C trong 2-3 ngày để
2006a; Jha et al., 2006b; Mavichak et al., 2010; kiểm tra khả năng sử dụng methanol. Các chủng
Sarathi et al., 2008). Mut+ và MutS được phân biệt dựa vào mức độ
tăng sinh của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình
Nghiên cứu này tiến hành nhằm chọn lọc
thường trên cả hai môi trường MM và MD;
được dòng nấm men thích hợp làm nguyên liệu
trong khi đó, MutS chỉ tăng trưởng trên môi
để điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm
trường MD mà không hoặc tăng trưởng rất yếu
trắng cho tôm nuôi. Đây là nghiên cứu thuộc
trên môi trường MM. Các chủng có khả năng
đề tài cấp Bộ: "Bước đầu nghiên cứu, sản xuất
mọc tốt trên cả 2 môi trường sẽ được chọn cho
tolerine có khả năng hạn chế lây lan của virus
nghiên cứu tiếp theo.
gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương
phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long" thực hiện 2.2.2. Chọn lọc dòng P. pastoris mang
năm 2013-2015. nhiều gen bản sao của gen mục tiêu
Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 đã chọn
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
lọc theo 2 phương pháp trên sẽ được cấy chuyển
NGHIÊN CỨU
sang môi trường YPD-Agar có bổ sung Geneticin
2.1. Vật liệu nghiên cứu (G418) nồng độ 0,25 mg/l; và 4 mg/ml. So sánh
Vật liệu nghiên cứu chính là 150 chủng khả năng phát triển của các dòng P. pastoris
nấm men Pichia pastoris GS115 (Invitrogen) pPIC9K-VP28 trên 2 môi trường này. Theo lý
mang plasmid pPIC9K-VP28 (Invitrogen) và thuyết, dòng nấm men có khả năng mọc trên môi
76 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
trường có 0,25 mg G418 có và 4 mg G148 lần nitrocellulose bằng máy chuyển màng semi dry
lượt có 01 và 14-16 copy gene VP28-His. với cường độ dòng điện 1mA/cm2 trong 2 giờ.
2.2.3. Chọn lọc dòng nấm men có khả Sau đó, màng được giữ ở 4°C trong dung dịch
năng sinh tổng hợp protein VP28 5% (w/v) sữa gầy hòa tan trong dung dịch đệm
• Xác định dòng nấm men có khả năng sinh TBS (10 mM Tris-HCl,pH 8,0 ± 0,2, 150 mM
tổng hợp protein VP28 NaCl) có 0,05% Tween. Màng được rửa 03 lần
bằng dung dịch TBS-T; rồi được ủ với kháng
Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 và đối
thể sơ cấp - kháng thể đa dòng kháng thỏ
chứng P. pastoris pPIC9K được biểu hiện trên
đặc hiệu cho protein VP28 (Genesis, #GB-
môi trường nuôi cấy sinh khối Buffered glycerol-
10006) - trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với
complex medium (BMGY) và kích thích 2%
tỷ lệ pha loãng 1:1.000 trong 2 giờ trên máy
methanol trên môi trường Buffered methanol-
lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó, màng lai được
complex medium (BMMY) trong 72 giờ. Quy
rửa 3 lần bằng TSB-T và ủ với kháng thể thứ
trình biểu hiện như sau: Các khuẩn lạc đơn P.
cấp - kháng thể thỏ kháng His (Santa Cruz,
pastoris pPIC9K-VP28 được tăng sinh trong 100
#sc-803) trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với
ml môi trường BMGY ở 280C, 250 vòng.phút-1
tỷ lệ pha loãng 1/500 qua đêm ở 4oC. Cuối
cho đến khi OD600 2-6. Sau đó dịch được ly tâm
cùng, màng lai được rửa 3 lần trong TBS-T và
thu sinh khối và huyền phù trong môi trường
được hiện màu bằng hỗn hợp 3,76 ml TBS/T
BMMY và đo OD600 dịch đạt 1,0. Tiếp theo dịch
với một phần tư viên DAB 10 mg cùng 3 µl
chứa chủng được kích thích sẽ thêm methanol
H2O2 30% cho đến khi xuất hiện vạch protein
100% để đạt nồng độ 2% và đem lắc ở 280C,
quan tâm với độ đậm mong muốn.
250 vòng.phút-1. Sau 24 giờ nuôi cấy các erlen
chứa dịch được thêm methanol để đạt nồng độ • Xác định chủng nấm men cho sinh khối
cuối 2%. Sự hiện diện của protein VP28 trong tốt nhất
xác tế bào được kiểm tra bằng SDS-PAGE và Các chủng nấm men – kết quả chọn lọc
khẳng định lại bằng phương pháp Western blot theo các phương pháp trên –được nuôi cấy tăng
với kháng thể đặc hiệu VP28 (Invitrogen, Mỹ). sinh trên môi trường BMGY và kích thích biểu
Phương pháp phân tích SDS-PAGE và hiện protein trên môi trường BMMY trong điều
Western blot: Tế bào nấm men P. pastoris kiện nồng độ methanol 2%, nhiệt độ nuôi cấy
pPIC9K-VP28 được ly trích protein tổng số 280C và tốc độ lắc ở 150 và 250 vòng.phút-1.
bằng cách bổ sung NaOH 0,4 M ủ ở nhiệt độ Mỗi chủng được nuôi cấy trong 03 erlen 500
phòng trong 5 – 10 phút. Sau đó dung dịch được ml khác nhau. Tốc độ sinh trưởng của các dòng
ly tâm 14.000 vòng.phút-1 trong 1 phút để thu nấm men được xác định bằng cách lấy 1 ml mẫu
cặn tủa. Huyền phù cặn trong 50 µl dung dịch theo thời gian nuôi cấy (0, 12, 24, 36, 48, 60 và
đệm tải mẫu (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ± 0,2; 72 giờ) pha loãng theo cơ số 10 và cấy trang
100 mMdithiotreitol; 2% w/v SDS; 0.1% w/v trên môi trường YPD-Agar.
bromophenol blue and 10% v/vglycerol) rồi đun • Xác định lượng protein VP28
sôi hỗn hợp ở 1000C trong 3 phút; cuối cùng Tất cả các chủng nấm men được chọn lọc sẽ
ly tâm lấy 5-12 µl dịch nổi để điện di SDS – được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường BMGY
PAGE gel và nhuộm Coomassie Blue R-50. Để và kích thích biểu hiện protein trên môi trường
phân tích Western blot, protein đã phân tách BMMY trong điều kiện nồng độ methanol 2%,
trên bản gel SDS-PAGE được chuyển qua màng nhiệt độ nuôi cấy 280C và tốc độ lắc ở 250 vòng.
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 77
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
phút-1. Tại 84 giờ sau kích thích biểu hiện, các dung dịch nuôi cấy theo thời gian (0, 12, 24, 36,
chủng được thu mẫu, các mẫu thu được cân sinh 48, 60, 72, 84 giờ).
khối (xác tế bào) sao cho khối lượng xác tế bào III. KẾT QUẢ
là tương đương. Các mẫu này được phân tích sự 3.1. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris
hiện diện của protein VP28 bằng phương pháp GS115 có kiểu hình Mut+
SDS-PAGE và Western-Blot, xác định độ lớn 153 khuẩn lạc được được dùng để kiểm
của các vạch thể hiện protein tương ứng để chọn tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy lần lượt trên
chủng nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, khả năng môi trường MM, MD ở 280C trong 3 ngày. Sau
sinh protein VP28 theo thời gian của 1 chủng ba ngày nuôi cấy, thu được 125 khuẩn lạc mọc
được chọn cũng được xác định bằng cách phân tốt trên môi trường có và không có bổ sung
tích Western-Blot của xác tế bào trong 1 ml methanol (Bảng 1).
Bảng 1: Kết quả kiểm tra tốc độ tăng trưởng trên môi trường chứa methanol
Nấm men kiểm tra Chủng mọc tốt trên 2 môi trường
TT Tên nhóm thí nghiệm
(chủng) (chủng)
1 2 (pPICK9K-VP28) 50 42
2 ĐC 2 (pPICK-9K) 1 0
3 3 (pPICK9K-VP28) 50 45
4 ĐC 3 (pPICK9K) 1 0
5 7 (pPICK9K-VP28) 50 38
6 ĐC 7 (pPICK9K) 1 0
Theo tính toán lý thuyết cấu trúc pPICK9K- 3.2. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris
VP28 được biến nạp vào nấm men sẽ xảy ra GS115 mang nhiều bản sao gen mục tiêu
hiện tượng tái tổ hợp vật chất di truyền giữa cấu Quá trình sàng lọc dòng P. pastoris có mang
trúc gen AOX1 của vector pPIC9K với AOX1 nhiều bản sao gen mục tiêu được thực hiện bằng
ở genome của nấm men, có thể tạo thành 2 cách cấy chuyển 125 khuẩn lạc sang môi trường
dạng kiểu hình nấm men Mut+ và Muts. Ở kiểu YDP-Agar có bổ sung G418 ở các nồng độ 0,25
hình Mut+, gen AOX1 tự nhiên của nấm men mg/l và 4 mg/l. Kết quả sàng lọc đã xác định
còn nguyên vẹn nên nó có thể phát triển mạnh được 113/125 khuẩn lạc có khả năng kháng
trên môi trường có methanol do biến dưỡng Geneticin 418 ở nồng độ 0,25 mg/l và 82/125
methanol tốt. Ngược lại, ở kiểu hình Muts gen khuẩn lạc có khả năng kháng G418 ở nồng độ 4
AOX1 bị bất hoạt làm nấm men phát triển kém mg/l. Theo lý thuyết, 82 khuẩn lạc này có chứa
trên môi trường có methanol. 14-16 copy gene VP28-His trong genome và
chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu
hiện protein VP28.
78 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 2: Kết quả sàng lọc các dòng nấm men trên môi trường có bổ sung Geneticin G418
Tên nhóm thí Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc kháng Số khuẩn lạc kháng 4 mg
TT
nghiệm kiểm tra 0,25 mg G418/l G418/l
1 2 (pPICK9K-VP28) 42 40 26
2 ĐC 2 (pPICK9K) 1 0 0
3 3 (pPICK9K-VP28) 45 42 28
4 ĐC 3 (pPICK9K) 1 0 0
5 7 (pPICK9K-VP28) 38 31 26
6 ĐC 7 (pPICK9K) 1 0 0
3.3. Kết quả chọn lọc dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp protein VP28
• Khả năng sinh tổng hợp protein VP28
Hình 1: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 bằng SDS-PAGE (A) và Western-Blot (B)
M1: Thang protein opti protein marker G252 ; M2: Thang protein Bio basic BSM0671
ĐC, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143: chủng nấm men đối chứng, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143
82 chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 kích thước khoảng 30 KDa bằng cả hai phương
đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm men mang pháp phân tích SDS-PAGE và Western Blot
pPICK9K rỗng (đối chứng âm) được cảm ứng (Hình 1); các chủng này được dùng để nghiên
biểu hiện protein trên môi trường nuôi cấy cứu tiếp theo.
sinh khối BMGY và kích thích methanol 2%
• Xác định sinh khối của các dòng nấm men
trên môi trường BMMY trong 72 giờ. Sự hiện
diện của protein VP28 trong xác tế bào và dịch 8 chủng nấm men đã qua sàng lọc và 1
nuôi cấy được phân tích bằng kỹ thuật SDS- chủng đối chứng được tiến hành nuôi cấy, kích
PAGE và Western Blot với kháng thể đặc hiệu thích biểu hiện protein bằng methanol 2% ở
của VP28. Kết quả biểu hiện protein đã xác nhiệt độ 280C và tốc độ lắc 150 vòng/phút. Kết
định được 55 chủng có sự hiện diện của protein quả cho thấy, tốc độ sinh trưởng của các chủng
VP28 bằng kỹ thuật Western Blot. Tuy nhiên, nấm men nghiên cứu khác nhau. Chủng 11 có
chỉ có 8 chủng: (3 chủng của nhóm 2 (1, 11, tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế
42); 2 chủng của nhóm 3 (57, 100) và 03 chủng bào nấm men cao nhất ở 108 giờ sau kích thích
của nhóm 7 (126, 143, 147) cho vạch rõ ràng ở biểu hiện bằng methanol 2% (2,99*109tế bào/
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 79
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
ml), sau đó là chủng 57 (2,59*109tế bào/ml). và 168 giờ cho chủng 120 (Hình 2). Bên cạnh
Các chủng còn lại có tốc độ sinh trưởng chậm đó, mật độ tế bào nấm men thu được trong 1 ml
hơn – thời gian cho sinh khối tối đa lâu hơn – môi trường nuôi cấy tại thời điểm sinh trưởng
120 giờ cho chủng 1, 132 giờ cho chủng 42, cao nhất của các chủng này cũng thấp hơn giá
chủng 126, chủng 143; 157 giờ cho chủng 147, trị đạt được của chủng 11 ở 108 giờ (P
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 3: Tốc độ sinh trưởng của các dòng nấm men ở tốc độ lắc 250 vòng.phút-1
3.4. Khả năng sinh protein của các dòng và Western blot (Hình 4). Kích thước vạch
tế bào nấm men chọn lọc protein của chủng nấm men không khác nhau
Kết quả phân tích protein trong cùng rõ rệt trên bản gel SDS-PAGE; song vạch thể
một lượng xác nấm men ở 9 mẫu chọn lọc hiện protein VP28 được quan sát thấy rõ ở
cho thấy các chủng đều có khả năng biểu các chủng 11, 42 và 147 trên bản gel Western-
hiện protein VP28 – đều cho 1 vạch rõ ở kích blot. Từ kết quả này, chủng 11 được chọn để
thước khoảng 30 kDatrên bản gel SDS-PAGE nghiên cứu tiếp theo.
Hình 4: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 trong 9 chủng nấm men chọn lọc
M1: Thang protein Bio basic BSM0671; M2: PageRuler #26619
ĐC, 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147: chủng đối chứng, chủng 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 81
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Lượng protein VP28 được chủng 11 biểu Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protein
hiện theo thời gian được xác định theo thời gian vỏ VP 28 đã được dòng hóa vào tế bào nấm men
sau kích thích biểu hiện: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 và việc sàng lọc 150 chủng nấm men từ 03 đợt
và 84 giờ. Kết quả cho thấy lượng protein VP28 dòng hóa khác nhau đã cho 9 chủng có biểu
được tạo ra tăng dần theo thời gian kích thích; hiện protein VP28 tốt trong tế bào. Chín chủng
lượng protein cao nhất đạt tại 84 giờ (Hình 5). này đều cho vạch protein đặc hiệu cho VP28
ở khoảng 30 kDa trên bản gel SDS-PAGE và
Western-blot. Kết quả này tương tự như kết quả
của Wang (2009) khi tác giả đã xác định được
vạch khoảng 30 kDa trên bản gel của các dòng
nấm men P.pastoris có chứa gen mã hóa protein
vỏ VP28. Trong khi đó Jha et al., (2007) lại
xác định được vạch ở vị trí 35 kDa trên bản gel
phân tách protein của SDS-PAGE và Western-
blot. Sự khác biệt về giá trị trọng lượng thực
của protein (28 kDa) và giá trị được xác định
Hình 5: Sự hiện diện của protein VP28 theo
(30 kDa, hoặc 35 kDa) có thể do việc gắn thêm
thời gian trong xác tế bào nấm men chủng 11
các nucleotide mã hóa các axit amin của histaq
M: Thang PageRuler #26619
hoặc do quá trình đường hóa (glycosylation)
ĐC: chủng đối chứng ở 84 giờ
hay phospo hóa (phosphorylation) – những hiện
0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 chủng 11 ở các giờ 0,
12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 sau biểu hiện tượng thường gặp khi sử dụng tế bào nấm men
làm hệ thống biểu hiện.
IV. THẢO LUẬN
Kết quả biểu hiện protein của các chủng
Việc sử dụng tế bào nấm men để sản xuất nấm men chọn lọc đã cho thấy chủng 11 có tốc
vaccine phòng bệnh cho động vật trên cạn đã độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế bào lớn
được nghiên cứu rộng rãi như bệnh Gumboro trong thời gian ngắn. Cụ thể, ở điều kiện 280C,
trên gà (infectious bursal disease), dịch tiêu nồng độ methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250
chảy cấp trên lợn (porcine epidemic diarrhea), vòng.phút-1, chủng nấm men 11, nuôi cấy trong
bệnh sốt lợn cổ điển (classical swine fever), erlen 500 ml đạt mật độ tế bào tối đa tại 84 giờ
bệnh do virus viêm gan B trên người,…(Eda sau kích thích biểu hiện. Trong các trường hợp
Celik và Pinar Calik, 2012; Rabert et al., 2013; nuôi cấy trong nồi lên men ở tốc độ khuấy tương
Shin và Yoo, 2013); tuy nhiên ứng dụng này còn tự (250 vòng/phút), tốc độ sinh trưởng của nấm
chưa được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy men nhanh hơn, đạt mật độ tế bào tối đa ở 72
sản, đặc biệt là trong việc chế tạo vaccine phòng giờ (Asada et al., 2011; Cai et al., 2014). Trong
bệnh cho tôm nuôi. Hiện nay, mới chỉ có hai phần lớn các nghiên cứu về tốc độ sinh trưởng
nhóm nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men P. của nấm men, tốc độ sinh trưởng của nấm men
pastoris để dòng hóa gen mã hóa protein vỏ: được tính toán dựa trên giá trị OD600 của dung
VP19, VP28, VP26 (Jha et al., 2007; Jha et al., dịch nuôi cấy theo thời gian; trong nghiên cứu
2006a; Wang, 2009), VP37 (Liu et al., 2006), này giá trị OD600 của các chủng cũng được xác
và protein PmRab7 – a shrimp WSSV-binding định (không trình bày trong bài) nhưng không
protein - (Jupatanakul et al., 2010) trong phòng tìm thấy sự sai khác giữa các chủng nghiên cứu,
bệnh đốm trắng cho crayfish và tôm nuôi.
82 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
vì vậy tốc độ tăng trưởng được xác định bằng bình hoặc các chất phụ gia (axit casamino,
cách đếm trực tiếp khuẩn lạc nấm men thông qua sorbitol, EDTA),… (Peng et al., 2011; Rabert
phương pháp trang đĩa dịch nuôi cấy ở các nồng et al., 2013; Shi et al., 2003). Song, trong điều
độ pha loãng khác nhau. Hơn thế nữa, phần lớn kiện thực tế của phòng thí nghiệm, các nghiên
các tài liệu đều xác định việc tăng trưởng của cứu về ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả
chủng nấm men sau dòng hóa trong điều kiện năng lên men của chủng nấm men chọn lọc còn
sử dụng nồi lên men trong khi nghiên cứu này chưa được thực hiện.
được tiến hành trên erlen 500 ml nên một số yếu
KẾT LUẬN
tố môi trường như pH, nồng độ methanol, hàm
Chủng nấm men P. pastoris GS115 số 11
lượng oxy… không được kiểm soát chặt chẽ,
có tốc độ sinh trưởng nhanh cho 3,92x109 tế
do đó có thể làm ảnh hưởng đến mật độ tế bào
bào/ml sau 84 giờ kích thích biểu hiện ở điều
cũng như làm giảm khả năng biểu hiện protein
kiện lên men trong bình lắc ở 280C, nồng độ
của dòng nấm men. Đó có thể là các lý do khiến
methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 vòng/
mật độ tế bào nấm men cao nhất mà nghiên cứu
phút đã được chọn lọc từ 150 chủng nấm men
này tìm được (3,92x109 tế bào/ml) khác với mật
sau dòng hóa. Đây cũng là chủng có khả năng
độ nấm men ở các nghiên cứu khác – như 2,4 x
biểu hiện protein VP28 tốt nhất – kết quả chạy
109 tế bào/ml với chủng nấm men chứa gen quy
điện di phân tách protein trên SDS-PAGE và
định protein CHRM2 (Asada et al., 2011).
kết quả phân tích Western-blot bằng kháng thể
Theo các nhà nghiên cứu, ngoài tốc độ lắc, đặc hiệu của VP28 cho vạch rõ ở khoảng 30
nhiều yếu tố khác nữa có thể ảnh hưởng đến việc kDa. Chủng này được chọn làm nguyên liệu
biểu hiện protein ở nấm men P. pastoris như pH, điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm
nhiệt độ, nồng độ methanol, thành phần trung trắng cho tôm nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T., Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo,
Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H., H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y.,
Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N., 2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus
Murata, T., Haga, T., Iwata, S., Kobayashi, T., (Marsupenaeus) japonicus from white spot
2011. Evaluation of the Pichia pastoris expression syndrome disease after oral administration of
system for the production of GPCRs for structural recombinant VP28 expressed in Brevibacillus
analysis. Microbial Cell Factories 10. brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.
Balamurugan, V., Reddy, G.R., Suryanarayana, V.V.S., Eda Celik, Pinar Calik, 2012. Production of recombinant
2007. Pichia pastoris: A notable heterologous proteins by yeast cells. Biotechnology Advances
expression system for the production offoreign 30, 1108-1118.
proteins—Vaccines Indian J. Biotechnol. 6, 175- Fu, L.L., Wang, Y.B., Wu, Z.C., Li, W.F., 2011. In vivo
186 assessment for oral delivery of Bacillus subtilis
Cai, F., Li, T., Xie, Y., He, X., 2014. Expression of harboring a viral protein (VP28) against white
functional single-chain variable domain fragment spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei.
(scFv) antibody against Metolcarb in Pichia Aquaculture 322, 33-38.
pastoris. Annals of Microbiology 64, 589-597.
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 83
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hansson, M., Nygren, P., Stahl, S., 2000. Design and Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I.,
production of recombinant sub-unit vaccines. Wada, S., Hatai, K., Inagawa, H., Takahashi, Y.,
Biotechnology and Applied Biochemistry 32, 95- Yoshimura, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Aoki, T.,
107. 2010. The effect of liposome-coated recombinant
Jha, R.K., Xu, Z.R., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., Shen, protein VP28 against white spot syndrome virus in
J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. Journal
white spot syndrome virus using recombinant of Fish Diseases 33, 69-74.
oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish & Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa,
Shellfish Immunology 22, 295-307. T., Nishioka, T., Arimoto, M., Muroga, K., 2004.
Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006a. Protection of Vaccination trials with Penaeus japonicus to
Procambarus clarkii against white spot syndrome induce resistance to white spot syndrome virus.
virus using recombinant subunit injection vaccine Aquaculture 229, 25-35.
expressed in Pichia pastoris. Fisheries Science 72, Ning, D., Leng, X., Li, Q., Xu, W., 2011. Surface-
1011-1019. displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce
Jha, R.K., Xu, Z.R., Shen, J., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, protection against white spot syndrome virus in
W.F., 2006b. The efficacy of recombinant vaccines crayfish by oral administration. J. Appl. Microbiol.
against white spot syndrome virus in Procambarus 111, 1327-1336.
clarkii. Immunology Letters 105, 68-76. Peng, H., Liu, H.P., Chen, B., Hao, H., Wang, K.J.,
Jupatanakul, N., Wannapapho, W., Eurwilaichitr, L., 2011. Optimized production of scygonadin in
Flegel, T.W., Sritunyalucksana, K., 2010. Cloning Pichia pastoris and analysis of its antimicrobial
and expression of recombinant shrimp PmRab7 (a and antiviral activities. Protein Expr. Purif. 82,
virus-binding protein) in Pichia pastoris. Protein 37-44.
Expr. Purif. 76, 1-6. Rabert, C., Weinacker, D., Pessoa Jr, A., FarÃas, J.G.,
Kim, C.S., Kosuke, Z., Nam, Y.K., Kim, S.K., Kim, 2013. Recombinants proteins for industrial uses:
K.H., 2007. Protection of shrimp (Penaeus Utilization of Pichia pastoris expression system.
chinensis) against white spot syndrome virus Braz. J. Microbiol. 44, 351-356.
(WSSV) challenge by double-stranded RNA. Fish Rout, N., Kumar, S., Jaganmohan, S., Murugan, V.,
& Shellfish Immunology 23, 242-246. 2007. DNA vaccines encoding viral envelope
Kumar, S.R., Ahamed, V.P.I., Sarathi, M., Basha, proteins confer protective immunity against
A.N., Hameed, A.S.S., 2008. Immunological WSSV in black tiger shrimp. Vaccine 25, 2778-
responses of Penaeus monodon to DNA vaccine 2786.
and its efficacy to protect shrimp against white Musthaq S Syed, Jimmy Kwang., 2011. Oral
spot syndrome virus (WSSV). Fish & Shellfish Vaccination of Baculovirus-Expressed VP28
Immunology 24, 467-478. Displays Enhanced Protection against White Spot
Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G., Ilangovan, K., Syndrome Virus in Penaeus monodon. PLoS ONE
Suzara, V.V., Duzgunes, N., Renugopalakrishnan, 6.
V., 2007. Expression of recombinant proteins in Sarathi, M., Simon, M.C., Venkatesan, C., Hameed,
Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142, A.S.S., 2008. Oral administration of bacterially
105-124. expressed VP28dsRNA to protect Penaeus
Liu, Q.H., Huang, J., Han, W.J., Liang, Y., Lu, C.L., monodon from white spot syndrome virus. Marine
Wang, Q.Y., 2006. Expression, purification Biotechnology 10, 242-249.
and characterization of WSSV-VP37 in Pichia Satoh, J., Kim, H.J., Matsui, T., Nishizawa, T.,
pastoris. Aquaculture 258, 55-62. Optimization of WSSV rVP Expression in E.
84 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
coli Cells and Minimum Dose of rVPs for Oral Virus (WSSV) and the Expressions in Pichia
Vaccination in Kuruma Shrimp. Fish Pathology Pastoris. Master’s thesis, Jimei University. China.
45, 169-174. Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., van Hulten,
Shi, X., Karkut, T., Chamankhah, M., Alting-Mees, M., M.C.W., 2004a. Protection of Penaeus monodon
Hemmingsen, S.M., Hegedus, D., 2003. Optimal against white spot syndrome virus by oral
conditions for the expression of a single-chain vaccination. Journal of Virology 78, 2057-2061.
antibody (scFv) gene in Pichia pastoris. Protein Witteveldt, J., Vlak, J.A., Van Hulten, M.C.W., 2004b.
Expr. Purif. 28, 321-330. Protection of penaeus monodon against white spot
Shin, M.K., Yoo, H.S., 2013. Animal vaccines based syndrome virus using a WSSV subunit vaccine.
on orally presented yeast recombinants. Vaccine Fish & Shellfish Immunology 16, 571-579.
31, 4287-4292. Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2006.
Singh, I.S.B., Manjusha, M., Pai, S.S., Philip, R., 2005. Increased tolerance of Litopenaeus vannamei
Fenneropenaeus indicus is protected from white to white spot syndrome virus (WSSV) infection
spot disease by oral administration of inactivated after oral application of the viral envelope protein
white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic VP28. Diseases of Aquatic Organisms 70, 167-
Organisms 66, 265-270. 170.
Wang, L., 2009. Cloning of Envelope Protein Genes
vp26 and vp28 of Shrimp White Spot Syndrome
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015 85
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
SCREENING SUITABLE PICHIA PASTORIS STRAINS CARRIED VP28 GENE
TO PRODUCE TOLERINE AGAINST WHITE SPOT DISEASE IN SHRIMP
Ngo Thi Ngoc Thuy1*, Dang Thi Tra My1
ABSTRACT
The use of Pichia pastoris as the expression system to produce recombinant proteins for disease
prevention in inverterbrate has been published widely; however, it has been limited used in aqua-
culture, especially in preventation of shrimp diseases. This study is aimed to find a suitable strain
from 150 strains of P. pastoris carrying pPick9K-VP28 vectors to produce tolerine against white
spot disease in shrimp. Those strains were screened based on the phenotype (Mut+), copy number
of VP 28 gene, the ability to express VP28 protein and growth rate of yeast strains. The selection
process figured 125 strains of phenotype Mut+, in which, 82 strains have got 14-16 copy gene of
VP28-His in genome. Further screening showed that recombinant VP28 protein was well expressed
in 8 P.pastoris strains; the expressing protein was given a clear specific band of about 30kDa on
SDS-PAGE gel and Western-blot cellulose membrane. Finally, one strain – strain 11 – revealed
quick growth with the highest cell density of 3.92 x 109cfu/ml at 84 hours post stimulation and ef-
fectively expressed rVP28 the protein was selected to produce tolerine against white spot disease
in future studies.
Keywords: VP28, Pichia pastoris, White spot disease.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015
Ngày duyệt đăng: 15/6/2015
1
Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research,Research Institute for Aquaculture No 2.
* Email: thuyngo8@yahoo.com
86 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015
nguon tai.lieu . vn