- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Quy trình phân tích đoạn Cytochrome B trên các mẫu cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Xem mẫu
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐOẠN CYTOCHROME B
TRÊN CÁC MẪU CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
Trần Nguyễn Ái Hằng1*, Trần Thị Thúy Hà2
TÓM TẮT
Với mục đích kiểm định cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus), việc xây dựng quy trình phân
tích đoạn Cytochrome b là cần thiết. Cặp mồi universal cho Cytb được sử dụng để nhân gen thuộc
vùng gen ty thể thông qua PCR các mẫu cá Tra và một số loài cá da trơn khác với kích thước 430
bp. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và giải trình tự. Các chuỗi trình tự nghiên cứu sau khi giải
cần phải được xử lý sơ bộ trước khi được đưa vào chương trình phân tích chính. Đầu tiên, các chuỗi
trình tự cần được kiểm tra chất lượng giải trình tự và xử lý bằng kết hợp hai phần mềm FinchTV và
Bioedit để đạt được trình tự chuẩn xác nhất cho các bước phân tích tiếp theo. Kế tiếp, dùng phần
mềm BLAST của NCBI để so sánh và xác định mức độ tương đồng của mẫu nghiên cứu với trình
tự chuẩn đã được công bố trong dữ liệu của NCBI. Cuối cùng, phần mềm Mega 6 sẽ là phần mềm
thích hợp cho các phân tích về sự phát sinh loài và khoảng cách di truyền của cá Tra và những loài
cá da trơn khác trong họ Pangasiidae muốn quan tâm.
Từ khóa: cá Tra, Cytochrome b, FinchTV và Bioedit, Pangasianodon hypophthalmus, quy trình
phân tích đoạn
I. ĐẶT VẤN ĐỀ đoạn trong vòng đời (trứng và ấu trùng) thậm
Theo Ủy hội sông Mekong (MRC: Mekong chí còn phức tạp hơn việc nhận dạng khi trưởng
River Commission) thì Việt Nam có tổng số 13- thành.
14 loài trong họ Pangasiidae, bao gồm 1 loài Ngày nay, sự phát triển vượt bậc của ngành
thuộc giống Helicophagus, 11 loài thuộc giống gienome học (gienomics) và các thiết bị thế hệ
Pangasius và 2 loài thuộc giống Pangasianodon mới đã mở đường cho việc nghiên cứu toàn bộ
(MRC, 2008). Tuy nhiên, việc phân loại dựa vào gienome của các sinh vật thủy sản. Đặc biệt với
hình thái học biến động lớn và còn nhiều tranh sự xuất hiện của kỹ thuật giải trình tự giene thế
cãi. Hiện nay, một số trang web cung cấp thông hệ mới đã giảm chi phí và nhân công một cách
tin rộng rãi về hình thái cá (www.fishbase.org); đáng kể trong khi có thể tạo được nguồn dữ liệu
tuy nhiên, trong một số trường hợp đặc tính hình di truyền khổng lồ trong thời gian ngắn. Đồng
thái bị giới hạn như đặc điểm khác biệt giữa các thời, với những chương trình phần mềm đa dạng
loài là quá nhỏ hoặc khó nhận thấy từ bên ngoài đã giúp ích rất nhiều cho việc phân tích dữ liệu
như xương lá mía, bóng hơi... . Thêm vào đó, gien, phát hiện ra những vùng đột biến điểm rất
nhiều đặc tính hình thái đã bị loại bỏ trong quá hiệu quả cho việc đánh giá khác biệt di truyền
trình tiêu hóa (ví dụ, cá tra bần thì thường thấy cũng như phát sinh loài quần thể của sinh vật.
trái bần bên trong dạ dày của nó) hoặc xử lý chế DNA ty thể (mtDNA) được sử dụng rộng
biến (ví dụ như đồ hộp, thịt phi lê) thì việc xác rãi trong nghiên cứu phân loại và phả hệ bởi
định trở nên khó khăn hoặc thậm chí không thể. tính di truyền theo dòng mẹ, không bị trộn lẫn
Hơn nữa, việc xác định hình thái qua các giai qua các thế hệ tiến hóa nhanh (gấp 10 lần so
1
Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
2
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I
* Email: hangtna.ria2@mard.gov.vn
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 19
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
với DNA ở trong nhân) và phương pháp thuật thủy sản An Giang, Trại cá giống Châu Hưng,
phân tích đơn giản (Kuhner và ctv., 2000). Bình Đại Bến Tre,…
Trong đó, một số gien nằm trên DNA ty - Mẫu cá sau khi thu được rửa sạch bằng nước
thể (mtDNA) được xem như những DNA ngọt và mã hóa. Tiến hành phân loại bằng hình thái
mã vạch trong phân loại động vật như khi mẫu còn tươi. Mẫu vây ngực (2 - 4g) được thu
gien Cytochrme c oxidase subunit 1 (COI)
và cố định riêng rẽ trong các ống eppendorf 2ml, giữ
(Hebert và ctv., 2003; Puckridge và ctv.,
trong cồn 96o. Các mẫu cá sau đó được bảo quản lạnh
2013), Cytochrome b (Sevilla và ctv.,
ở - 200C cho mục đích phân tích sinh học phân tử sau
2007), 16s rRNA (Vences và ctv., 2005).
này.
Trong đó, vùng nhỏ của gien cytochrome
b cũng được xem là một marker tiềm năng 2.2. Phương pháp xây dựng quy trình
cho mục tiêu này. 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vây cá Tra
Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào Quy trình tách DNA từ mẫu vậy là quy trình tủa
được thực hiện để xây dựng quy trình phân muối được mô tả như trong Hình 1.
tích đoạn gien Cytochrome b trên mẫu cá
Tra (P. hypophthalmus) phục vụ cho mục Eppendorf chứa mẫu
đích nghiên cứu kiểm định. Do đó, nghiên 500µl Solution 1 đã cắt mịn 5x5 mm
+ 5 µl
cứu này nhằm góp phần xây dựng quy ProteinaseK
Votex nhanh
trình phân tích đoạn gien Cytochrome b
trên các mẫu cá Tra (P. hypophthalmus).
Ủ ở 550C /3 giờ hoặc qua đêm
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
Bỏ trên đá 10 phút
PHÁP XÂY DỰNG QUY TRÌNH 240 µl
Solution 2
2.1. Vật liệu nghiên cứu và thời gian Đảo vài lần, bỏ trên đá 5 phút
thực hiện
2.1.1 Thời gian thực hiện Ly tâm 8000 rpm /15 phút
- Thời gian thu mẫu: 8/2014 – 8/2015 Cẩn thận hút 300 µl dịch trong
500 µl ethanol
- Thời gian thực hiện phân tích đoạn 100 % lạnh
cytochrome b: 9/2015 – 6/2016 Ủ ở 40C/2 giờ
Địa điểm thực hiện: Phòng sinh học
Ly tâm 11000 rpm /15 phút
phân tử, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy
sản II
Bỏ dịch nổi
500 µl ethanol
2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 70 % lạnh
- Mẫu được thu thập là cá da trơn Ly tâm 11000 rpm /5 phút
thuộc họ Pangasiidae từ các sông lớn tại
Bỏ dịch nổi, làm khô ở 370C
các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Hậu Giang,
Sóc Trăng, Đồng Tháp, Tiền Giang và Bến 100 µl TE
Tre. Thời gian thu và phân tích mẫu được Bảo quản ở -25 0C
tiến hành nhiều lần trong năm 2014-2015.
- Thu mẫu cá Tra từ các trại giống Hình 1. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu vây cá
và trung tâm nuôi thương phẩm: Trung DNA tổng số sau khi tách chiết được bảo quản ở
tâm giống thủy sản Caseamex, Trại giống 4 C. Trước khi tiến hành khuếch đại bằng phản ứng
0
Năm Hổ Cai Lậy, Trung Tâm giống và kỹ PCR, kiểm tra định tính và định lượng DNA tổng số
20 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và sử hiện trên máy PCRPeqSTAR 96X Universal
dụng máy Nanodrop 1000. Gradient Thermocycler.
2.2.2. Xác định điều kiện khuếch đại trình Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng
tự Cytochrome b bằng PCR mồi được thiết kế lần lượt bởi Russell và ctv.,
Để nhân đoạn vùng Cytochrome b của gen (2000) và Wolf và ctv., (2000) có trình tự như
ty thể, phản ứng PCR được chuẩn bị và thực sau:
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ gắn mồi
L14735 5’AAAAACCACCGTTGTTATTCAACTA3’
H15149ad 5’GCICCTCARAATGAYATTTGTCCT CA3’ 52,6oC
Thiết lập chu trình nhiệt cho phản ứng PCR (theo công bố của tác giả Li Lian
Wong (2011)
Bảng 1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 2 phút
94 30 giây
35 Ta 40 giây
72 1 phút
1 72 10 phút
Ta: Nhiệt độ bắt cặp.
2.2.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR lượng cho kết quả giải trình tự trong bước tiếp
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra lần theo. Các bước tiến hành được thực hiện theo
lượt trên gel agarose 2%. Trong bước điện di kit như sau:
này, chúng tôi sử dụng dung dịch đệm TAE Bước 1: Thêm 5 lần thể tích đệm PB với
(Tris-acetate-EDTA) và dung dịch Ethidium 1 thể tích mẫu. Sau đó trộn đều và chuyển vào
bromide được bổ sung trực tiếp vào gel agarose cột SV
trước khi thực hiện đổ gel vào khuôn điện di. Bước 2: Đặt cột vào máy ly tâm 12000 vòng
Sau đó, mẫu được nạp và điện di trong dung trong 30 giây, sau đó đổ bỏ dịch chảy xuống và
dịch SB 1X với hiệu điện thế 120V, 60mA. Sản thu lại cột SV
phẩm PCR phân tách được soi, kiểm tra và chụp Bước 3: Thêm 700 µl đệm NW, sau đó ly
ảnh dưới ánh sáng UV. tâm 12000 vòng trong 30 giây và đổ bỏ dịch
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR chảy xuống rồi thu lại cột SV.
Trước khi tiến hành giải trình tự, tất cả Bước 4: Tiến hành ly tâm thêm 1 phút ở
sản phẩm PCR được tinh sạch bởi kit ExpinTM 12000 vòng để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa NW.
PCR SV của hãng GeneAll để đảm bảo chất Sau đó chuyển cột SV vào ống 1,5 ml mới.
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 21
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bước 5: Nhỏ 50 µl dung dịch đệm EB hoặc đuôi của file giải trình tự cho thích hợp với các
H2O vào giữa màng của cột SV và ủ trong 1 phút phần mềm xử lý sau này. Kế tiếp, đối với phần
rồi ly tâm 12000 vòng trong 1 phút. Sau đó, thu mềm Bioedit được sử dụng để chỉnh sửa, thay
lại sản phẩm tinh sạch và đo Nanodrop để kiểm đổi, so sánh mồi xuôi, mồi ngược nhằm chỉnh
tra độ tinh sạch DNA trước khi tiến hành giải sửa những nucleotide không rõ ràng nhằm tăng
trình tự trong bước tiếp theo.
độ tin cậy của mẫu.
2.2.5. Giải trình tự vùng Cytochrome b
2.2.7. So sánh trình tự với dữ liệu NCBI
của gen ty thể
Bước 1: Đăng nhập cơ sở dữ liệu NCBI
Sau khi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR
tại http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. NCBI sử
và đo nồng độ trên máy Nanodrop 1000, chúng
dụng BLAST để so sánh trình tự được đưa vào
tôi tiến hành gửi mẫu đi giải trình tại First BASE
Laboratories, Malaysia. cơ sở dữ liệu của trình tự đáp ứng công ước
quốc tế dựa vào tiêu chuẩn cho mã vạch DNA
2.2.6. Đánh giá chất lượng, phân tích và
Cytochrome b
sắp xếp trình tự bằng phần mềm FinchTV và
Bioedit Bước 2: Chọn “BLAST” từ menu ở phía
Các trình tự từ nghiên cứu sau khi nhận về phải của trang chủ để thực hiện bước tìm kiếm
từ công ty giải trình tự được xử lý cơ bản để đạt dữ liệu và gióng hàng với trình tự gốc của dữ
được một trình tự hoàn chỉnh nhằm chuẩn bị cho liệu NCBI
bước xử lý sau này. Phần mềm FinchTV dùng Bước 3: Chọn “Nucleotide Blast” từ màn
để kiểm tra chất lượng trình tự và chuyển đổi hình chính của BLAST (Hình 2.)
Hình 2: Màn hình chính của phần mềm BLAST, NCBI
22 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Bước 4: Dán chuỗi trình tự vào mục “Enter
query sequence in fasta format” và kích “BLAST”.
Bước 5: Nhìn vào kết quả tìm kiếm NCBI cho
biết những loài gì được tìm thấy gần nhất với
đoạn trình tự được tra tìm. Kết quả cho biết
về Mức độ bao phủ (Query cover), mức tương
đồng (Identification) với loài gần nhất
Bước 6: Kích vào nút “Taxonomy reports
” và “Distance tree of results”trên trang web
để xem báo cáo về phân loại và cây phát sinh Hình 3. Kết quả kiểm tra chất lượng
chủng loại mà cơ sở dữ liệu NCBI xây dựng. DNA bằng gel agarose
Dựa vào kết quả trên Hình 3, cho thấy DNA
2.2.8. Thiết lập cây phả hệ các mẫu nghiên tách chiết được với hàm lượng lớn, không bị đứt
cứu và xác định giá trị quan hệ loài gãy, sạch và ít bị nhiễm RNA. Ngoài ra, chúng
Dữ liệu trình tự Cytochrome b của cả mẫu tôi dùng máy đo Nanodrop để kiểm tra một cách
mới giải mã và dữ liệu có sẵn trong ngân hàng chính xác hàm lượng và mức độ tinh sạch cua
gen sẽ được chuẩn bị để phân tích khoảng các sản phẩm DNA (Bảng 2).
di truyền giữa các mẫu bằng cách sử dụng Bảng 2. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA bằng
phần mềm MEGA phiên bản 6.0 (Tamura và máy đo nồng độ Nanodrop
ctv., 2007). Sử dụng phương pháp Neighbour-
joining (NJ) và mô hình khoảng cách Kimura
2-Parameter (K2P) (Kimura, 1980) có trong
phần mềm MEGA để xây dựng cây phát sinh
chủng loại của Cytochrome b. Với bộ dữ liệu
gốc, bootstrap 1000 lần được thực hiện nhằm
đánh giá độ tin cậy của sự phân nhánh trên
các cây phát sinh chủng loại NJ. Các chỉ số Từ kết quả trên ở Bảng 2 cho thấy hàm
về sự khác biệt trong cùng loài và cùng giống lượng DNA thu được tương đối cao và chỉ số
(conspecific and congeneric divergences) sẽ OD 260/280 điều nhỏ hơn 1,8. Điều này cho
được tính toán. Các dữ liệu được phân nhóm thấy phương pháp tách chiết DNA bằng tủa
(putative species clusters) dựạ vào cây phát muối hoàn toàn thích hợp cho nghiên cứu của
sinh chủng loại NJ. Các nhóm được cho là đề tài.
cùng loài khi có độ chênh lệch hay khác biệt 3.2. Phản ứng PCR
dưới 2%.
3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR
Từ kết quả điện di trên gel agarose (Hình 4)
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
cho thấy sản phẩm PCR nằm trong khoảng 430
3.1. Kết quả tách chiết DNA
bp. Sản phẩm PCR tốt ở tất cả hầu hết nhiệt độ
Để thử nghiệm qui trình tách chiết DNA, lai. Do đó, nhiệt độ Ta thích hợp cho phản ứng
chúng tôi tiến hành tách trên 7 mẫu vây cá Tra khuếch đại sẽ được lựa chọn theo công bố của
thu được ở Long Xuyên, tỉnh An Giang. tác giả 52,6oC.
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 23
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 4. Kết quả tối ưu mồi cytb
3.2.2. Kết quả phản ứng PCR
Hình 5. Kết quả chạy PCR với cặp mồi cytochrome b.
Kết quả PCR trên một số mẫu cá Tra ngẫu Trình tự nhận được từ công ty First BASE
nhiên (Hình 5) cho thấy quy trình chạy của tác Laboratories, Malaysia có 2 file với hai đuôi
giả cũng hoàn toàn thích hợp cho điều kiện AB1 và SEQ, dùng file đuôi AB1 cho phần
phòng thí nghiệm của đề tài mặc dù sản phẩm mềm FinchTV.
DNA khuyếch đại có hàm lượng hơi thấp. Tuy Từ màn hình chính (Hình 6), nhập “Open” để
nhiên, điều này sẽ được điều chỉnh khi tăng hàm nhập đoạn trình tự mong muốn kiểm tra chất
lượng DNA đầu vào cho phản ứng PCR.
lượng giải trình tự với đuôi file .AB1.
3.3. Phân tích và sắp xếp trình tự bằng
phần mềm FinchTV
Hình 6. Màn hình chính của phần mềm FinchTV
24 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Hình 7. Kết quả kiểm tra chất lượng giải trình tự của sản phẩm
Theo quy ước, mỗi một màu chỉ thị cho một sai khác giữa hai trình tự thì nucleotide sẽ được
loại nucleotide, trong đó Adenine (A) = Xanh chọn dựa vào giá trị Q. Dựa vào giá trị Q của
lá cây, Thymine (T) = đỏ, Cytosine (C) = Xanh FinchTV, chúng ta sẽ biết được bắt đầu vị trí
dương, Guanine (G) = Đen (Hình 7). Từ kết nào sẽ bị cắt bỏ trong đoạn trình tự bằng phần
quả cho thấy, tín hiệu đọc của mỗi nucleotide mềm Bioedit nhầm loại bỏ đi đoạn mồi được
rõ ràng và tách biệt chứng tỏ kết quả đọc chính gắn vào trong qua trình giải trình tự. Đối với
xác, rõ ràng, không bị tạp nhiễm. Ngoài ra, giá dữ liệu nhiều chuỗi trình tự, các trình tự này sẽ
trị của chất lượng giải trình tự (Quality values) được gióng hàng, cắt bỏ hai đầu cho bằng nhau
còn được thể hiện khi nhấp vào biểu tượng có và save lại ở một file dạng fasta chuẩn bị cho
hình “Q” trên menu. Sau đó, khi nhấp chuột vào việc phân tích sau này.
một nucleotide nào đó, ở góc dưới cùng bên trái 3.4. Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu
sẽ hiện ra giá trị Q và vị trí của nucleotide. Ví trên NCBI
dụ, khi nhấp chuột vào nucleotide ở vị trí thứ
Những đoạn trình tự sau khi xử lý hoàn
428, giái trị Q được hiển thị là Q(10), điều này
chỉnh, được sử dụng để so sánh với trình tự dữ
có nghĩa là có nghĩa là nucleotide thứ 428 sẽ
liệu trên NCBI. Các thao tác được thực hiện
có xác suất đọc sai là 1/10. Khi giá trị Q này
như sau: dán chuỗi trình tự muốn so sánh vào
nằm ở 30 hoặc cao hơn thì việc đọc nucleotide
ô “Enter query sequence”, Chọn “Pangasiidae”
ở vị trí đó được xem là chính xác. Ngoài ra, khi
trong ô Organism và nhấn nút BLAST (Hình 8).
gióng hàng mồi xuôi và mồi ngược, nếu có sự
Hình 8. Màn hình chính của phần mềm BLAST
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 25
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Kết quả được thể hiện như Hình 9.
Hình 9. Kết quả so sánh trình tự của mẫu với dữ liệu trên NCBI của phần mềm BLAST
Thông qua phần mềm BLAST, kết quả dụng việc kiểm định loài trong các thực phẩm
(Hình 9) cho thấy sự tương đồng cao (99% -100 chế biến, việc này nhằm xác định sản phẩm
%) của các trình tự nucleotide gen Cytochrome này có nguồn gốc từ các Tra hay từ các loài
b của mẫu cá Tra trong nghiên cứu với trình tự cá khác.
nucleotide của loài đã được công bố trên ngân 3.5. Thiết lập cây phả hệ các mẫu nghiên
hàng gen NCBI. Từ đây, có thể kết luận kết cứu và xác định giá trị quan hệ loài bằng
quả định danh bằng chỉ thị sinh học phân tử phần mềm Mega 6
cytochrome b có trùng khớp với kết quả định Các bước để tiến hành phân tích và vẽ cây
danh bằng hình thái hay không và từ đó đưa ra phát sinh chủng loại gồm có:
mức độ chính xác của phương pháp sinh học 1. Xác định mục tiêu, lấy mẫu sinh vật và
phân tử. Bước phân tích này cũng được ứng họ gene;
26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
2. Chọn marker phân tử, tức gene hay 9. Chấp nhận kết quả hoặc quay lại bước 2.
protein cần đọc trình tự; Từ phầm mềm Bioedit, các bước từ 1 đến 4
3. Đọc trình tự, hiệu chỉnh trình tự; sẽ được thực hiện, trong đó, các trình tự muốn
4. Sắp xếp thẳng hàng các trình tự; nghiên cứu sẽ được gióng hàng và lưu trữ trên
5. Chọn mô hình tiến hóa; một file dữ liệu với đuôi được lưu là .fasta để
chuẩn bị cho việc phân tích trong phần mềm
6. Phân tích sự phát sinh chủng loài;
Mega 6. Phần mềm Mega 6 là phần mềm phổ
7. Đọc cây tiến hóa; biến được sử dụng rộng rãi trong việc xử lý kết
8. Kiểm tra cây tiến hóa; quả giải trình tự của các mẫu nghiên cứu.
Hình 10. Màng hình chính cho Aligment của Mega 6
Sau đó, bước 5 và 6 sẽ được thực hiện với một ma trận khoảng cách giữa tất cả các taxa.
phần mềm Mega 6. Trong phần mềm này, cây Do phương pháp neighbor-joining mà một
phát sinh loài sẽ được thiết lập bằng chức năng trong những phương pháp nhanh nhất để dò tìm
Phylogeny (Hình 11). Trong Phylogeny, chọn cây tiến hóa nên nó thường được sử dụng để
phương pháp Test Neighbor-Joining Tree (NJ). phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa. Đồng
Phương pháp neighbor-joining (NJ) có mô hình thời, trong phương pháp này sẽ chọn phân tích
tiến hóa là một hàm hiện. Trong phương pháp bootstrap 1000 lần lặp lại. Phân tích bootstrap
này từng cặp trình tự một sẽ được so sánh thẳng được thực hiện nhằm kiểm tra tính chính xác và
hàng cặp đôi và ứng với từng cặp, khoảng cách độ tin cậy cho từng nhánh trong cây tiến hóa.
di truyền sẽ được tính toán. Do mô hình tiến Đầu tiên, các vị trí từ chuỗi trình tự đã sắp xếp
hóa là một hàm hiện nên một trong số mô hình thẳng hàng sẽ được đảo chỗ cho nhau một cách
tiến hóa có thể được chọn để tính toán khoảng ngẫu nhiên để tạo ra nhiều mẫu phụ (gọi là sự
cách di truyền giữa từng cặp taxa từ đó cho ra lặp lại bootstrap). Như vậy các mẫu phụ có kích
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 27
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
thước giống như mẫu gốc nhưng vị trí thành hộ) cho một nhánh đơn lẻ nào đó. Do giá trị
phần không giống nhau. Sau đó các mẫu phụ sẽ support được biểu diễn bằng tỷ lệ % nên ít nhất
được trải qua quá trình phân tích tương tự như phải có 100 lần lặp lại, tức 100 lần tạo mẫu phụ.
mẫu gốc đã trải qua. Kết quả từ những mẫu phụ Thông thường thì người ta làm với 1.000 lần lặp
sẽ được dùng để tính toán giá trị support (ủng lại để đạt được mức độ tin cậy cần thiết.
Hình 11. Màn hình của phần mềm Phylogeny
Dựa vào kết quả từ cây tiến hóa, chúng ta nhưng giữa các mẫu cá dứa và cá xác sọc là sự
có thể xác định sự phát sinh chủng loại của các khác biệt này là 6,62 %. Điều này cho thấy hai
mẫu cần nghiên cứu dựa vào chỉ số được thể loài này là hai loài khác nhau hoàn toàn do có
hiện trên từng nhánh cây. Ví dụ, theo hình 13, độ chênh lệch hay khác biệt trên 2% (Hình 12).
những mẫu cá dứa có mức độ khác biệt là 0 %,
Hình 12: Cây Neighbor-Joining (NJ) được xây dựng từ trình tự gen Cytochrome b của 9 mẫu cá
nghiên cứu và trình tự của 2 loài: Pangasius macronema và Pangasius elongatus
28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
Ngay sau khi có kết quả cây tiến hóa, tiến bật nhóm lòai cần chú ý trước khi công bố.
hành thực hiện bước 7 đến bước 9, nhà nghiên Ngoài ra, Mega 6 cũng giúp tính toán
cứu có thể so sánh kết quả với cây tiến hóa mà khoảng cách di truyền của những loài nghiên
nhà nghiên cứu đã định nghĩa sẵn từ trước. Sự cứu bằng chức năng Distance Compute
sai khác giữa hai cây tiến hóa này có thể giúp pairwise distances dựa vào mô hình tính toán
nhà nghiên cứu đi đến quyết định chấp nhận Kimura 2-Parameter (K2P). Kết quả nhận được
kết quả hay quay lại hiệu chỉnh. Sau khi có cây như bảng 3, khoảng cách di truyền giữa các mẫu
tiến hóa, nhà nghiên cứu có thể đưa cây tiến thuộc họ cá dứa và cá xác sọc là 0,137, kết quả
hóa vào những chương trình xử lý hình ảnh đồ này đã thể hiện sự khác biệt rõ rệt giữa hai loài
hòa thông thường để hiệu chỉnh hay làm nổi này.
Bảng 3: Khoảng cách di truyền của các mẫu thuộc 2 loài trong họ
Pangasiidae: Pangasius macronema và Pangasius elongatus
IV. KẾT LUẬN mềm BLAST của dữ liệu NCBI đã so sánh và
Quy trình phân tích đoạn gien xác định mức độ tương đồng của mẫu nghiên
Cytochrome b hoàn toàn phù hợp với mục đích cứu với trình tự mẫu, nếu kết quả thể hiện là
nghiên cứu kiểm định cá Tra. Các mẫu DNA sau 99-100%, kết luận mẫu nghiên cứu có mức độ
khi được thực hiện phản ứng PCR đã tinh sạch tương đồng cao với mẫu đã được công bố ở dữ
và giải trình tự. Các trình tự sau khi nhận từ liệu của NCBI. Cuối cùng, phần mềm Mega 6
công ty giải trình tự đã được kiểm tra chất lượng sẽ là phần mềm thích hợp cho các phân tích về
và xử lý bằng kết hợp hai phần mềm FinchTV sự phát sinh loài và khoảng cách di truyền giữa
và Bioedit để đạt được trình tự chuẩn xác nhất cá Tra và những loài cá da trơn khác trong họ
cho các bước phân tích tiếp theo. Sau đó, phần Pangasiidae.
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 29
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
TÀI LIỆU THAM KHẢO DNA barcoding. Molecular Ecology Resources
Hebert, P.D.N., Cywinska, A., Ball, S.L., 13, 32-42.
deWaard, J.R., 2003. Biological identifications Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S,
through DNA barcodes. Proceedings of the 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary
Royal Society of London. Series B: Biological Genetics Analysis (MEGA) software version
Sciences 270, 313-321. 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-
Kimura, M., 1980. A simple method for 1599.
estimating evolutionary rate of base Sevilla R, Diez A, Noren M, 2007. Primers
substitutions through comparative studies of and polymerase chain reaction conditions
nucleotide sequences. Journal of Molecular for DNA barcoding teleost fish based on the
Evolution 16:111-120. mitochondrial cytochrome b and nuclear
MRC, 2008. Mekong River Commission, Phnom rhodopsin gienes. Mol Ecol Notes 7:730–734.
Penh Vences, M, 2005. Comparative performance of
Puckridge, M., Andreakis, N., Appleyard, S.A., the 16S rRNA gene in DNA barcoding of of
Ward, R.D., 2013. Cryptic diversity in flathead amphibians.
fishes (Scorpaeniformes: Platycephalidae) http://www.fishbase.org (ngày 16/07/2016)
across the Indo-West Pacific uncovered by
30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
PROCESS OF ANALYSIS FOR CYTOCHROME B GEN
ON TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) SAMPLES
Tran Nguyen Ai Hang1*, Tran Thi Thuy Ha1
ABSTRACT
For identify Tra catfish (Pangasianodonhypoph-thalmus), process of analysis for cytochrome b gen
was built. Using the universal primer for cytochrome b gen to amplify PCR products about 430
bp for length from Tra catfish and other catfish samples belonging to Pangasidae. After cleaning
process, products were sent to sequence. Before using for the analyzed steps, these sequences will
be pre-treated to get the best sequences by two software such as FinchTV and Bioedit. Next, using
BLAST to find a similarity with species was published in the database of NCBI. Finally, Mega 6
software would be use to analyze genetic distance as well as building Neighbor-Joining tree subspe-
cies which also confirm close relationships between these species in the same family Pangasiidae.
Keywords: Tra Catfish, Cytochrome b, Finch TV and Bioedit, Pangasianodon hypophthal-
mus, Mega 6.
Người phản biện: ThS. Bùi Thị Liên Hà
Ngày nhận bài: 26/7/2016
Ngày thông qua phản biện: 10/8/2016
Ngày duyệt đăng: 05/9/2016
1
Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No.2
2
Research Institute for Aquaculture No.1
*Email: hangtna.ria2@mard.gov.vn
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 8 - THÁNG 9/2016 31
nguon tai.lieu . vn