1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Quy trình công nghệ sản xuất Alkyl glycerol từ sinh vật biển dùng và tạo thực phẩm chức năng Akumarin

Quy trình công nghệ sản xuất Alkyl glycerol từ sinh vật biển dùng và tạo thực phẩm chức năng Akumarin

Alkyl glycerol (AG) có tác dụng kích thích hệ miễn dịch của con người một cách tự nhiên, giảm lượng cholesterol, chống viêm. Tác động sinh lý của các chất này rất đa dạng, rõ rệt nhất là để điều trị và phục hồi cho bệnh nhân ung thư (ức chế sự phát triển khối u, giảm di căn, giảm tăng trưởng mạch máu trong khối u, giảm đau), trị liệu sau xạ trị và xử lý trạng thái suy giảm miễn nhiễm. Được sử dụng như dạng thuốc hỗ trợ, điều trị đối HIV/AIDS để tăng cấp độ của hệ thống miễn dịch của chúng và các

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 13

Ngày tạo 12/29/2020 11:33:27 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 3.81 M

Tên tệp

Tải Quy trình công nghệ sản xuất Alkyl glycerol từ sin... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ALKYL GLYCEROL TỪ SINH VẬT BIỂN DÙNG VÀ TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG AKUMARIN Chu Quang Truyền1*, Cầm Thị Ính1, Hoàng Thanh Hương1, S.P. Kasijanov2, N.A. Latyshev2, Phạm Quốc Long1 TÓM TẮT Alkyl glycerol (AG) có tác dụng kích thích hệ miễn dịch của con người một cách tự nhiên, giảm lượng cholesterol, chống viêm. Tác động sinh lý của các chất này rất đa dạng, rõ rệt nhất là để điều trị và phục hồi cho bệnh nhân ung thư (ức chế sự phát triển khối u, giảm di căn, giảm tăng trưởng mạch máu trong khối u, giảm đau), trị liệu sau xạ trị và xử lý trạng thái suy giảm miễn nhiễm. Được sử dụng như dạng thuốc hỗ trợ, điều trị đối HIV/AIDS để tăng cấp độ của hệ thống miễn dịch của chúng và các tế bào máu. Tác dụng điều tiết miễn nhiễm dựa vào kích sinh bạch cầu, tiểu cầu và cytokine diệt virus. Nó cũng giúp ngăn ngừa và giảm bệnh tiểu đường, cao huyết áp. Bài viết này trình bày phương pháp sản xuất alkyl glycerol từ sinh vật biển tạo thực phẩm chức năng akumarin phục vụ cho cuộc sống. Chi tiết các bước trong quy trình như thủy phân mỡ, axít hóa, rửa nước, kết tinh từng phần hai bước trong aceton, lọc và sấy khô tạo sản phẩm cuối cùng trong điều kiện phù hợp được trình bày trong bài báo. Với hàm lượng AG thu được là ≥90% và được bào chế thực phẩm chức năng Akumarin chứa 50% hàm lượng AG. Từ khóa: Alkyl glycerols, lipid, sinh vật biển, hợp chất có hoạt chất sinh học tự nhiên. I. ĐẶT VẤN ĐỀ vai trò trung gian ở các đáp ứng của tế bào Thực phẩm chức năng (functional (Taguchi et al., 1998). Tác động sinh lý của foods), thực phẩm thuốc (medical foods) khác các chất này rất đa dạng, rõ rệt nhất là để điều với thực phẩm phổ biến thông dụng hàng ngày trị và phục hồi cho bệnh nhân ung thư, trị liệu (ordinary foods) là thức ăn ngoài giá trị dinh sau xạ trị và xử lý trạng thái suy giảm miễn dưỡng còn có tính năng đặc biệt phòng ngừa nhiễm (Lannitti et al., 2011, Magnusson et và điều trị bệnh tật. Thực phẩm chức năng al., 2011). Tác dụng điều tiết miễn nhiễm dựa được sản xuất và sử dụng đầu tiên ở Nhật, sau vào kích sinh bạch cầu, tiểu cầu và cytokine đó lan rộng sang Mỹ, các nước châu Âu và diệt virut. Tác động kháng tạo hình mới do nhiều nước trên toàn thế giới, trong đó có Việt hoạt tính ức chế hoạt động của enzym protein Nam. Hàng năm, toàn thế giới sử dụng khoảng kinaza C (Anne-Laure et al., 2010). Khả năng trên 65 tỷ USD cho các chế phẩm bổ sung dinh nổi trội khác là dễ tạo nhũ tương dạng nano dưỡng, trong đó thị trường Bắc Mỹ chiếm 1/3, và dẫn thuốc đến nơi cần nhận (Taguchi et al., thị trường châu Âu 1/3 Nutrition Business 1998). Alkyl glycerol có tác dụng kích thích Journal, 2003; 2004). hệ miễn dịch của con người một cách tự nhiên Alkyl glycerol là một họ các hợp chất có làm giảm lượng cholesterol, các bệnh về tim vai trò quan trọng trong nhiều quá trình của mạch. cơ thể sống với hai chức năng sinh học chính Hiện nay, lipit được thu nhận theo nhiều là tham gia cấu trúc màng tế bào và đảm nhận phương pháp khác nhau như: phương pháp 1 Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên *Email: quangtruyen69@gmail.com 2 Viện Sinh học biển A.V Zhirmunsky 120 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  2. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp 2.2. Sơ đồ nghiên cứu chung cơ học hoặc phương pháp nhiệt. Từ nguyên liệu nội tạng thủy sản tiến II. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ hành thu nhận lipit tổng. Bằng các phản ứng 2.1. Nguyên liệu kiềm hóa, axit hóa và sau đó kết tinh bằng Sau khi sàng lọc, chúng tôi lựa chọn aceton chúng tôi thu nhận được akyl glycerol nguyên liệu nội tạng thủy sản (cá, bạch tuộc, đạt độ tinh khiết ≥ 90%, hiệu suất của quá mực...). từ các nhà máy chế biển hải sản Hải trình đạt 98%. Dưới đây là sơ đồ nghiên cứu Phòng, Nha Trang. Các mẫu nội tạng bảo quản sản xuất alkyl glycerol và tạo thực phẩm chức ở điều kiện nhiệt độ -20°C phục vụ cho xử lý năng. phân tích sau này. Hình 1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất alkyl glycerol và tạo TPCN Akumarin 2.3. Dụng cụ, hóa chất dung môi và thiết bị Dung môi, hóa chất phân tích: aceton, phân tích dietyl ete, axit acetic, n-hexan, etanol, etyl Lipit được chiết tách bởi thiết bị chiết acetat, HCl, H2SO4, Na2SO4, KOH. đa năng có gia nhiệt 150 lít, phễu chiết công Xác định hàm lượng AG bằng GC-MS: nghiệp 80 lít, bình phản ứng, thiết bị làm lạnh, Máy GC- 6890 Agilent Mỹ. Detector MS- cân công nghiệp, máy quay cất chân không 10 5975C Agilent Mỹ. Cột DB-XLB (30 m * 250 lít mm * 0,25 µm), nhiệt độ: từ 80-2700C, bơm TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 121
  3. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 mẫu 1 µl, nhiệt độ 2500C, khí mang He, tốc độ khiết 80,5%; hiệu suất của quá trình là 90,6%. 1 ml/phút. Kết tinh lần thứ 2 thu được 41 g sản phẩm AG có III. THỰC NGHIỆM độ tinh khiết 95,6%; hiệu suất quá trình là 98%. 3.1. Chiết lipit tổng 3.4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở thực phẩm Nguyên liệu nội tạng thủy sản sau khi thu chức năng Akumarin mua được bảo quản ở -20°C. Sau đó tan đông 3.4.1. Yêu cầu về chỉ tiêu cảm quan và để tự phân hủy bởi enzym nội sinh và chiết - Trạng thái: Viên nén kích thước đều lipit tổng bằng phương pháp nhiệt trong thiết - Màu sắc: Bột màu trắng vàng nhẹ, nén bị đun đa năng 150 lít có gia nhiệt, ở nhiệt độ thành viên ổn định là 90°C và thời gian 180 phút, lọc tách - Mùi vị: có mùi đặc trưng của sản phẩm, riêng phần lipit tổng, phần bã còn lại tiếp tục không có mùi lạ được li tâm để tận thu phần lipit. 3.4.2. Yêu cầu các chỉ tiêu chất lượng 3.2. Thủy phân trong môi trường kiềm AG có các chỉ tiêu và mức chất lượng Lipit tổng được kiềm hóa trong môi theo quy định dưới đây: trường kiềm KOH/EtOH 15% khuấy và đun ở nhiệt độ 60°C trong thời gian 60 phút cho tan Bảng 1. Yêu cầu các chỉ tiêu chất lượng hoàn toàn. Sau đó để nguội về nhiệt độ phòng Chỉ tiêu Đơn vị tính Mức công bố và axit hóa bằng H2SO4/H2O, khuấy đến pH=3, Hàm lượng tro % ≤1 tách bỏ lớp nước và rửa lại bằng nước ấm đến Độ ẩm % ≤5 pH = 6, loại bỏ phần nước và thu được lớp lipit. Khối lượng mg/viên 950±10% 3.3. Tinh chế Alkyl glycerol riêng Để nghiên cứu quá trình kết tinh sản Hàm lượng mg 400-600 phẩm trong aceton, tiến hành các thí nghiệm Alkyl glycerol với hỗn hợp phản ứng sau quá trình thủy phân gồm có lipit và AG (hàm lượng AG trong lipit 3.4.3. Hàm lượng kim loại nặng là 2% theo khối lượng) được kết tinh trong Bảng 2. Hàm lượng kim loại nặng aceton như sau: + Kết tinh lần 1: hòa tan 2 kg dầu béo với Tên chỉ tiêu Đơn vị tính Không vượt 20 lít aceton, khuấy đều và đun nóng ở 60°C quá cho đến khi hỗn hợp hòa tan hết (1 giờ). Sau đó Hàm lượng Pb mg/kg 10,0 ngừng cung cấp nhiệt, ngừng khuấy và giữ dung Hàm lượng Hg mg/kg 0,5 dịch trong vòng 10 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiếp Hàm lượng Cd mg/kg 2,0 theo hỗn hợp được làm lạnh đến 0°C để trong 12 giờ. Sau thời gian đó, lọc lấy kết tủa và rửa lại 3.4.4. Các chỉ tiêu vi sinh vật bằng 500 ml aceton lạnh. Kết tủa đem sấy khô ở Bảng 3. Các chỉ tiêu vi sinh vật nhiệt độ phòng. Cân kiểm tra khối lượng và xác định hàm lượng AG có trong sản phẩm. Tên chỉ tiêu ĐVT Mức tối đa + Kết tinh lần 2: Sản phẩm trung gian ở Tổng số vi sinh vật hiếu CFU/g 104 khí kết tinh lần 1 đem lặp lại một lần nữa chính xác các bước như giai đoạn 1. Coliforms CFU/g 10 E. coli CFU/g 0 Từ 2 kg lipit sau khi kết tinh thứ nhất từ aceton thu được 45 g sản phẩm AG có độ tinh Pseudomonas aeruginosa CFU/g 0 Tổng số nấm men mốc CFU/g 102 122 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  4. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 3.4.5. Hàm lượng hóa chất không mong 3.5. Thành phần cấu tạo muốn Tính cho mỗi viên nén 1.000 mg/viên: Bảng 4. Hàm lượng hóa chất không mong muốn Alkyl glyceryl ete 500 mg (hoạt chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ lipit có trong nội TT Tên chỉ tiêu ĐVT Mức tối đa tạng thủy sản (cá, mực...), Avicel 40 mg, tinh 1 Aflatoxin B1, ppm 3,0 bột 60 mg và tá dược. 2 Hàm lượng ppm 0,1 Aflatoxin tổng số 3 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, thuốc thú y và các chất không mong muốn khác phù hợp với Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm ban hành Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của bộ trưởng Bộ Y tế. Sản phẩm Akumarin TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 123
  5. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 IV. KẾT LUẬN Số: 629/HĐ-KHCN-CNSH, Bộ Nông nghiệp Từ nguyên liệu nội tạng thủy sản, chúng và Phát triển Nông thôn. tôi đã chiết tách và kết tinh được chế phẩm alkyl glycerol và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở TÀI LIỆU THAM KHẢO alkyl glyceryol. Từ chế phẩm alkyl glycerol, Nutrition Business Journal, 2003. The NBJ/SPINS chúng tôi đã bào chế được sản phẩm thực Organic Foods Report 2003. New Hope phẩm chức năng AKUMARIN đã được Natural Media, Inc., Boulder, CO. cấp giấy xác nhận về an toàn thực phẩm số Taguchi, H., Armarego, W.L., 1998. Glyceryl 14511/2014/ATTP-XNCB của bộ Y tế. Chúng ether monooxigenase [EC1.14,16.5]. tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất TPCN A Microsomal enzyme of ether lipid chứa akyl glycerol đạt độ tinh khiết ≥ 90%, metabolism. In © 1998. John Wiley & Sons, hiệu suất của quá trình đạt 98%. Đã xây dựng Inc. Med. Res. Rev. 18(1), 43- 89. được tiêu chuẩn cơ sở của TPCN Akumarin. Iannitti, T., Palmieri, B., 2011. An update on the Đây là công bố đâu tiên về quy trình sản xuất therapeutic role of alkyl glycerols. Mar. TPCN Akumarin ở Việt Nam chứa hàm lượng Drugs 8, 2267–2300. alkyl glycerol. Anne-Laure, D., Paul, M.,, Frédérique, P., Romain, Bước đầu có thể khẳng định sự thành M., Damien, L.B., 2010. Multiple beneficial health effects of natural alkyl glycerols from công từ việc nghiên cứu quy trình tạo chế shark liver oil. Mar Drugs 8, 2175-2180. phẩm alkylglycerol, sản xuất TPCN Akumarin Magnusson, C.D., Haraldsson, G.G., 2011. Ether từ nội tạng thủy sản phục vụ cuộc sống. lipids. Chem. Phys. Lipids 164, 315-340. Nutrition Business Journal, 2004. NBJ’s Organic LỜI CÁM ƠN Foods Report 2004, New Hope Natural Công trình được thực hiện dưới sự tài Media, Inc., Boulder, CO. trợ của Đề tài: “Nghiên cứu quy trình sản xuất thực phẩm chức năng giàu hoạt chất alkyl glyxeryl ete từ nội tạng động vật thủy sản”. 124 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  6. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 TECHNOLOGICAL PROCESS FOR PRODUCTION OF ALKYL GLYCEROL FROM MARINE ORGANISMS FOR FUNCTIONAL FOODS AKUMARIN Chu Quang Truyen1*, Cam Thi Inh1, Hoang Thanh Huong1, S.P. Kasijanov2, N.A. Latyshev2, Pham Quoc Long1 ABSTRACT Alkyl glycerol’s (AGs) are involved in stimulating the immune system of mammals naturally, reducing cholesterol and anti-inflammatory. Physiological impact of AGs is diverse and clearest in treatment and recovery of cancer patient. AGs are widely known to normalize the function of bone marrow, causing excessive stimulation. In this regard, AG is successfully used in the rehabilitation therapy during the treatment of cancer, radiation lesions, immunodeficiency states and others. AGs are used as support medicine to treat HIV/ AIDS by increasing levels of immune system and blood. AGs are used to regulate infection dismiss based on stimulating white blood cell, platelet and cytokine multiplication for killing virus. They are also used to prevent and reduce diabetes and high blood pressure symptom. This paper presents the method for producing alkyl glycerol’s of marine organisms’ fat involving the hydrolysis of fat, acidification of the fatty mixture, washing it with water, two-step fractional crystallization in acetone, filtration and drying of the end product under proper conditions. The purity of obtained AG is more than 90% and it was used for the preparation of functional food akumarin containing 50% of AG. Keywords: Alkyl glycerol, lipid, marine organisms, natural bioactive compounds. Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Lan Chi Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 1 Institute of Natural Products Chemistry – VAST *Email: quangtruyen69@gmail.com 2 A.V Zhirmunsky Institute of Marine Biology - FEB, RAS TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 125
  7. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 ĐIỀU CHẾ PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN TỪ BÁN KHÁNG NGUYÊN DOMOIC ACID Đào Việt Hà1* và Phạm Xuân Kỳ1 TÓM TẮT Nhằm lựa chọn protein tải tối ưu của phức hợp kháng nguyên DA, cơ chất DA (có bản chất bán kháng nguyên) được gắn kết với 03 loại protein khác nhau bao gồm Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Bovine Serum Albumin (BSA) và Polylysin (Plys) thông qua cầu nối hóa học Disuccinimidyl Suberate (DSS). Ở thí nghiệm tạo phức DA-DSS (pH 6-7, nhiệt độ phòng khoảng 28oC), hiệu suất phản ứng khá ổn định (65-68%). Ngược lại, có sự khác biệt về hiệu suất của các protein tải trong phản ứng kết hợp với phức hợp DA-DSS: cao nhất là BSA (20,5%), tiếp theo là KLH (7,15%) và Plys (14,2%). Trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein, tỉ lệ số phân tử DA gắn kết với 1 phân tử protein cũng có sự khác biệt theo từng protein (Plys:59, BSA: 22, KLH: 14). Trên cơ sở so sánh kết quả này với số gốc acid amin lysin tự do nội phân tử của từng protein, BSA được nhận định có tính ưu việt hơn cả và được chọn lựa là protein tải của phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein để gây phản ứng miễn dịch ở thỏ trắng New Zealand tại Việt Nam. Từ khóa: domoic acid, hiệu suất, kháng nguyên, protein tải. I. ĐẶT VẤN ĐỀ tử protein. Trong những thập niên gần đây, hướng Công bố đầu tiên trong lĩnh vực này là của nghiên cứu miễn dịch học nhằm phục vụ phát Newsome và ctv., (1991) khi ông thành công triển phương pháp thử nghiệm nhanh (ELISA) tạo kháng nguyên DA-BSA (Bovine Serum đối với độc tố domoic acid (DA) đã và đang Albumin) nhờ tính chất vật lý bám dính của được quan tâm nhiều. Một khó khăn rất lớn phân tử DA trên bề mặt phân tử protein mang khi tạo kháng thể kháng độc tố DA là động (BSA) trong môi trường có độ ion hóa cao. vật bậc cao chỉ sản sinh được kháng thể kháng Tuy nhiên, lượng kháng thể sản sinh khi sử lại những độc tố có bản chất protein. Trong dụng kháng nguyên này rất thấp và thiếu tính khi đó, DA có khối lượng phân tử thấp, không đặc hiệu do cấu trúc kém bền vững của phức thuộc nhóm protein nên cơ thể sinh vật không hợp kháng nguyên và tính ngẫu nhiên khi phân có hiệu ứng miễn dịch khi bị tiêm trực tiếp tử DA gắn kết với BSA. Smith và Kitts (1994), độc tố. Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của Osada và cs., (1995) đã cải tiến bằng cách sinh vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên gắn kết DA và BSA với sự có mặt của Ethyl phải điều chế một phức hợp kháng nguyên dimethylaminopropyl carbondiimide (EDC) từ DA có bản chất là bán kháng nguyên (hap và N-hydroxy succinimide (NHS) đóng vai ten) bằng cách gắn kết độc tố này với một loại trò hoạt hóa nhóm amin thứ cấp của phân tử protein thích hợp, sao cho trong phức chất tạo protein BSA, sau đó gắn với gốc cacboxyl của ra vừa có tính chất kháng nguyên từ độc tố phân tử DA thông qua liên kết kiểu peptide. Vì (DA), vừa có tính sinh miễn dịch của một phân DA có 03 gốc cacboxyl, các gốc này kết hợp 1 Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam * Email: daovietha69@gmail.com 126 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  8. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 ngẫu nhiên với phân tử protein tải nên kháng và ít tốn kém hơn so với Garthwaite và ctv., thể sản sinh sẽ ở dạng hỗn hợp 03 kháng thể (1998). Mặt khác, do tính duy nhất của gốc tương ứng với 03 điểm tiếp nhận khác nhau amine sơ cấp trong phân tử DA, kháng nguyên của phân tử DA. Mặt khác, hàm lượng kháng sẽ chỉ có đồng nhất 01 dạng epitopi (điểm tiếp thể tạo ra từ kháng nguyên được điều chế bằng nhận), do đó sẽ cho sản phẩm kháng thể tương phương pháp này cũng rất ít và lẫn nhiều tạp ứng với độ đặc hiệu cao hơn các phương pháp chất không mong muốn. trước đây. Nhằm cải thiện chất lượng kháng thể Mặt khác, để phục vụ cho việc điều chế (có tính đặc hiệu hơn), Garthwaite và ctv., phức hợp giữa DA và protein từ kháng nguyên (1998) đã phát triển phương pháp tạo kháng ban đầu (DA), cần phải có bước chọn lọc nguyên bằng cách gắn gốc amine của DA với được protein đặc hiệu cộng hợp đặc hiệu với gốc cacboxyl của protein tải. Ở phương pháp DA. Hemoyamin KeyHole Limpets (KLH), này, với 01 gốc amine tự do duy nhất của DA, Bovine Serum Albumin (BSA), Human kháng nguyên hoàn toàn tương đồng về điểm Gamma Globulin (HGG), Diphtheria Toxoid tiếp nhận của DA do đó sẽ giảm thiểu được tạp (DT), Ovalbumin (OVA) hay Polylysin (Plys) chất không mong muốn trong sản phẩm miễn thường được sử dụng làm protein tải của DA dịch. Mặc dù vậy, do các protein mang thường (Branaa và ctv., 1999; Kawatsu và ctv., 1999; có rất nhiều nhóm cacboxyl trên bề mặt phân Kania và Hock, 2002; Kania và ctv., 2003). tử, chất lượng kháng thể còn phụ thuộc vào Tùy thuộc vào số lượng gốc amine sơ cấp tỉ lệ gắn kết thành công giữa số lượng phân (-NH2) hoạt tính của phân tử, các protein tải tử DA nhất định với một phân tử protein tải. khác nhau có ảnh hưởng lớn đến sản lượng Bằng phương pháp này, kháng thể sản sinh ra cũng như độ đặc hiệu của kháng thể. có sản lượng và tính đặc hiệu cao hơn hẳn so Vì vậy nghiên cứu này tiến hành thăm dò với Smith và Kitts (1994). Tuy nhiên, do DA thử nghiệm khả năng gắn kết với phân tử DA chỉ có nhóm amine thứ cấp (-NH) nên cần phải của một số protein tải thương mại bao gồm chuyển đổi sang dạng amine sơ cấp (-NH2) BSA, KLH, Plys trên cơ sở so sánh hiệu suất trước khi tạo phức kháng nguyên có thể làm phản ứng, tỉ lệ gắn kết của 01 phân tử protein hao hụt đi phần nào kháng nguyên sau điều tải. Kết quả của nghiên cứu này sẽ là cơ sở chế nên quy trình thực hiện này lại quá phức khoa học cho việc chọn lựa protein tải tối ưu tạp và tốn kém. đối với độc tố DA nhằm tạo phức hợp kháng Một phương pháp khác có thể sử dụng nguyên tốt nhất từ cơ chất bán kháng nguyên để điều chế phức hợp kháng nguyên là gắn kết DA ban đầu. Đây là một trong những nội dung gốc amine sơ cấp của phân tử DA với chính quan trọng của đề tài cấp Nhà nước “Nghiên gốc amine sơ cấp của phân tử protein tải. Để cứu phát triển bộ KIT phát hiện nhanh một số thực hiện được phản ứng gắn kết này, cần có sự độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy sản” trong tham gia của hợp chất mang tính cầu nối giữa chương trình Công nghệ Sinh học Thủy sản 02 phân tử. Disuccinimidyl Suberate (DSS, của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn C16H20N2O8) là một hợp chất có khả năng liên đến 2020. kết giữa nhóm amine sơ cấp của DA và nhóm II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU nitrate (-NO3) của phân tử DSS, sau đó phức 2.1. Chuẩn bị dung dịch DA: Hòa tan 2 này được kết hợp với nhóm amine sơ cấp của mg domoic acid (DA) chuẩn (TOCRIS, Anh phân tử protein thông qua nhóm cacboxyl của 14277-97-5) trong 1 thể tích nhỏ nước cất (
  9. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 2.2. Chuẩn bị dung dịch DSS: Hòa tan 20 mg serum, WAKO, Nhật Bản, 016-15133)/Plys Disuccinimidyl Suberate (DSS) (THERMO, (Polylysin, WAKO, Nhật bản 513-74891) Mỹ, 68528-80-3) trong 1,6 ml DMF (N,N- trong 200 µl dung dịch đệm PBS (Phosphate dimethylformamide) (WAKO, Nhật Bản 048- Buffer Saline) 0,1 M - dung dịch này có nồng 27585). độ 25 mg protein tải/ml. 2.3. Tạo phức DA-DSS: Trộn dung dịch DA 2.5. Tạo phức giữa DA-DSS và protein tải: và dung dịch DSS, lắc đều, sau đó để yên ở Trộn hỗn hợp DA-DSS và dung dịch protein nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Thêm vào hỗn tải trong PBS, giữ yên ở nhiệt độ phòng trong hợp này một thể tích nhỏ dichloruamethal 2 giờ, sau đó thẩm tích qua đêm (lặp lại 3 lần) (CH2Cl2), lắc đều để lắng cho đến khi phân ở 40C (giữ trong tủ lạnh) bằng 1.000 ml dung thành 02 lớp chất lỏng (lớp dưới bao gồm DSS dịch đệm PBS 0,1 M nhằm loại bỏ DA và DA- và DMF dư thừa; lớp trên bao gồm nước cất DSS không tham gia phản ứng. Dung dịch sau có chứa DA-DSS). Loại bỏ lớp dưới, giữ lại thẩm tích chứa DA-DSS-KLH/BSA/Polylysin lớp trên bằng phễu chiết, dùng khí N2 để loại được đưa về tổng thể tích 08 ml bằng dung dichloruamethal. dịch đệm PBS 0,1 M. Dung dịch cuối cùng 2.4. Chuẩn bị dung dịch protein tải (KLH/ này có nồng độ protein tải phản ứng với 1 mg BSA/ Polylysin): Hòa tan 5 mg KLH DA ban đầu là 250 µg/ml. (Keyhole Limpet Hemocyanin, DAKO, Nhật bản 517-39611)/BSA (Albumin, bovine Hình 1: Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA thông qua cầu nối DSS gắn nhóm imino (-NH) của DA và gốc amine (-NH2) của protein tải 128 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  10. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 2.6. Xác định hiệu suất tạo phức của phức - Tính toán hàm lượng protein tải (KLH/ DA-DSS: Xác định hàm lượng DA dư thừa BSA/Polylysin) trên cơ sở so sánh với dung sau phản ứng DS-DSS trong hỗn hợp bằng dịch protein chuẩn 1 mg/ml trong đệm PBS phương pháp HPLC cho phân tích độc tố DA 0,1 M. theo Kodama và Kotaki (2005). III. KẾT QUẢ 2.7. Xác định hiệu suất tạo phức của phức 3.1. Hiệu suất của phản ứng giữa DA và DA-DSS-KLH/BSA/Polylysin DSS - Đo cường độ màu của DA có mặt trong Hàm lượng DA tham gia phản ứng tạo phức hợp DA-DSS-protein thu nhận sau thẩm phức DA-DSS được trình bày ở Bảng 1. Hiệu tích ở bước sóng 242 nm với mẫu trắng là đệm suất phản ứng có khoảng dao động từ 65% PBS 0,1 M. đến 68% so với lượng DA sử dụng ban đầu, và - Tính toán hàm lượng DA trong phức không có sự sai khác thống kê giữa 03 lần thí hợp trên cơ sở so sánh với dung dịch DA chuẩn nghiệm. Như vậy, hiệu suất phản ứng của quy 250 µg/ml trong đệm PBS 0,1 M. trình gắn kết giữa DA và DSS là khá ổn định - Đo cường độ màu của protein tải có giữa 03 lần thí nghiệm. mặt trong phức hợp DA-DSS-protein (sau thẩm tích) ở bước sóng 280 nm; Bảng 1. Hàm lượng DA trong phức hợp DA-DSS và hiệu suất phản ứng Thí nghiệm Hàm lượng DA (mg) Hàm lượng DA (mg) tham Hiệu suất phản ứng ban đầu gia phản ứng 1 2,0 1,30 65% 2 2,0 1,36 68% 3 2,0 1,30 65% 3.2. Hiệu suất phản ứng cộng hợp giữa DA- hợp kháng nguyên sau cộng hợp với cùng 01 DSS và protein tải lượng DA (2 mg) thông qua cầu nối DSS được Kết quả xác định hàm lượng 03 protein trình bày trong Bảng 2. tải bao gồm KLH, BSA và Plys trong phức Bảng 2. Hàm lượng protein trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein và hiệu suất phản ứng STT Phức hợp kháng Hàm lượng protein Hàm lượng protein Hiệu suất phản ứng nguyên (mg) sử dụng cộng hợp (mg) trong phức (%) hợp kháng nguyên 1 Plys-DSS-DA1 5,0 0,710 14,2 2 BSA-DSS-DA2 5,0 1,025 20,5 3 KLH-DSS-DA3 5,0 0,088 7,15 Ghi chú: Plys: Polylysin, BSA: Bovine Serum Albumin, KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin DA 1, DA 2, DA 3: DA của từng thí nghiệm kết hợp DA-DSS (Bảng1) TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 129
  11. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 Kết quả cho thấy, hiệu suất thực nghiệm Từ kết quả tính toán hàm lượng DA trước tính theo hàm lượng protein tham gia phản và sau phản ứng, số phân tử DA tham gia phản ứng dao động từ 14,2-20,5% tùy theo protein ứng tạo phức với 01 phân tử protein tải được khác nhau. Hiệu suất cao nhất được ghi nhận ở trình bày trong Bảng 3. Theo kết quả bảng này, BSA (20,5%), tiếp theo là Plys (14,2%), trong 59 trong tổng số 79 gốc lysine của Plys, 22 khi KLH lại có hiệu suất thấp nhất (7,15%). trong tổng 39 gốc lysine của BSA đã gắn kết 3.3. Hệ số kết hợp của DA với 01 phân tử với DA, trong khi ở Plys, chỉ có 14 trong tổng protein số 735 gốc lysine kết hợp thành công. Bảng 3. Số phân tử DA trong các phức hợp kháng nguyên cộng hợp với KLH, BSA và Plys STT Phức hợp Số gốc lysine tự do Số phân tử DA kết hợp trong 1 phân tử protein với 1 phân tử protein 1 Plys-DSS-DA 79 (*) 59 2 BSA-DSS-DA 35 (**) 22 3 KLH-DSS-DA 735 (***) 14 Ghi chú: Plys: Polylysin; BSA: Bovine Serum Albumin; KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin (*): theo Brian và ctv., 1996; (**): theo Huang và ctv., 2004; (***): theo Dolaski và ctv., 2005 IV. THẢO LUẬN với DA do chúng cũng bị che khuất khi hòa Xét về mặt khối lượng phân tử, KLH tan trong môi trường đệm (giống như trường là một protein glycosyl hóa rất lớn với khối hợp của KLH). Khác với 02 protein trên, BSA lượng phân tử 4.500.000-13.000.000 đ.v.c. có khối lượng phân tử nhỏ hơn hẳn (khoảng Thông thường, protein có khối lượng phân 65.000 đ.v.c), nhưng lại có tính tan tốt trong tử càng lớn sẽ có càng nhiều gốc lysine tự do đệm PBS. Trong thực nghiệm, 22 gốc lysine đóng vai trò là epitope (điểm tiếp nhận) trong của BSA đã kết hợp thành công với DA trong phản ứng tạo phức với DA-DSS nên sẽ tăng phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA. Kết khả năng cao hơn tạo ra các kháng thể. Dolaski quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu và ctv., (2005) xác định có 739 gốc lysine tự của Huang và ctv., (2004) chứng minh rằng do trong phân tử KLH. Tuy nhiên, các phân một phân tử BSA có chứa 35 gốc lysine tự do tử KLH lại có xu hướng tập hợp lại và kết tủa nhưng chỉ có khoảng 22-24 gốc có thể gắn kết khi hòa tan trong môi trường đệm PBS. Do đó, đặc hiệu với phân tử DA. Như vậy, có thể đánh các nhóm lysine tự do có nguy cơ bị che khuất, giá rằng trong 03 protein thử nghiệm, BSA có dẫn đến hạn chế khả năng liên kết với phân tử hiệu suất gắn kết tốt nhất với DA. DA. Đây chính là nguyên nhân dẫn đến hiệu Ngoài ra, nguồn gốc của protein tải đóng suất và hệ số kết hợp giữa các gốc lysine tự do vai trò quan trọng trong cơ chế gây miễn dịch của KLH với DA không cao trong thí nghiệm. đối với sinh vật thử nghiệm. Thông thường, Plys có khối lượng phân tử 150.000-300.000 hệ miễn dịch sẽ nhạy cảm hơn đối với kháng đ.v.c, với 79 gốc lysine tự do trong cấu trúc nguyên có đặc tính lạ, do đó các protein có phân tử. Kết quả thí nghiệm cho thấy protein nguồn gốc xa với động vật gây miễn dịch này có tỉ lệ gắn kết giữa gốc lysine và phân thường cho hiệu giá kháng thể cao hơn. KLH tử DA cao nhất trong 03 protein thử nghiệm. có nguồn gốc từ loài ốc đá (Giant Keyhole 20 gốc lysine trong Plys không gắn kết được Limpet Megathura crenulata) phân bố giới 130 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
  12. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 hạn ở một số vùng thuộc ven biển Thái Bình Hemocyanin. World Journal of Agricultural Dương, BSA là protein nguồn gốc từ động vật Sciences 1 (2): 129-136. móng guốc (bò), và Plys có nguồn gốc từ tế Garthwaite, I., Ross, K.M., Miles, C.O., Hansen, bào cơ thể người. Như vậy, khi gây miễn dịch R.P., Foster, D., Wilkins, A.L., and Towers, ở đối tượng thỏ trắng New Zealand, KLH có N.R., 1998. Polyclonal Antibodies to Domoic tính sinh miễn dịch tốt nhất so với 02 protein Acid, and Their Use in Immunoassays for Domoic Acid in Sea Water and Shellfish. còn lại. Tuy nhiên, tính theo hệ số gắn kết giữa Natural Toxins 6: 93-104. DA và protein, số phân tử DA kết hợp với Huang, B.X., Kim, H-Y., and Dass, C., 2004. KLH lại quá nhỏ. Kháng thể tạo ra bằng liệu Probing Three-Dimensional Structure of pháp miễn dịch khi sử dụng phức hợp kháng Bovine Serum Albumin by Chemical Cross- nguyên này sẽ không đạt được tính đặc hiệu Linking and Mass Spectrometry. J Am Soc cao với DA, do đó, không đáp ứng yêu cầu sử Mass Spectrom. 15: 1237–1247. dụng cho tạo kít ELISA. Kania, M., and Hock, B., 2002. Development of V. KẾT LUẬN monoclonal antibodies to domoic acid for the detection of domoic acid in blue mussel Kết hợp giữa kết quả thực nghiệm và (Mytilus edulis) tissue by ELISA. Analytical nguyên lý miễn dịch, BSA được chọn lựa làm Letters: Chemical and Bio-sensors 35(5): protein tải để điều chế phức hợp kháng nguyên 855-868. từ bán kháng nguyên DA để sử dụng gây miễn Kania, M., Kreuzer, M., Moore, E., Pravda, dịch ở thỏ trắng New Zealand nhằm thu nhận M., Hock, B., and Guilbault, G., 2003. kháng thể đặc hiệu kháng DA. Development of Polyclonal Antibodies LỜI CẢM ƠN against domoic acid for their use in Công trình này thuộc nội dung khoa học electrochemical biosensors. Analytical Letters 36(9): 1851-1863. của đề tài KHCN cấp Nhà nước 2013-2015 Kawatsu, K., Hamano, Y., Noguchi,T., 1999. "Nghiên cứu phát triển bộ KIT phát hiện nhanh Production and characterization of a một số độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy sản" monoclonal antibody against domoic acid trong chương trình Công nghệ Sinh học Thủy and its application to enzyme immunoassay. sản của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông Toxicon 37: 1579-1589. thôn đến 2020. Newsome, H., Truelove, J., Hierlihy, L., and TÀI LIỆU THAM KHẢO Collins, P., 1991. Determination of Domoic Branna, P., Naar, J., Chinain, M., Pauillac, S., Acid in Serum and Urine by Immunochemical 1999. Preparation and characterization of Analysis. Bull. Environ. Contam. Toxicol. domoic acid - protein conjugates using a 47: 329-334. small amount of toxin in a reversed micellar Osada, L., Marks, J., Stewart, J.E., 1995. medium: Application in Competitive Enzyme Determination of Domoic Acid by Two linked Immunosorbant Assay. Bioconjugate. Different Versions of a Competitive Enzyme- Chem. 10: 1137-1142. Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Bull. Brian, L. F., and Corn, R.M.,1996. Covalent Environ. Contam. Toxicol. 54: 797-804. Attachment and Derivatization of Poly Smith, D.S., and Kitts, D.D., 1994. A competitite (L-lysine) Monolayers on Gold Surfaces As Enzyme-linked Immunoassay for domoic Characterized by Polarization-Modulation FT- acid determination in human fluid. Fd. IR Spectroscopy. Anal. Chem. 68: 3187-3193. Chem. Toxic. 32 (12): 1147-1154. Dolashki, A., Schütz, J., Hristova, R., Voelter, Smith, D.S., and Kitts, D.D., 1995. Enzyme W., and Dolashka, P., 2005. Spectroscopic immunoassay for the determination of Properties of Non-glycosilated Functional domoic acid in mussel extracts. J. Agric. Unit KLH2-c of Keyhole Limpet Food. Chem.43: 367-371. TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015 131
  13. VIEÄN NGHIEÂN CÖÙU NUOÂI TROÀNG THUÛY SAÛN 2 MAKING ANTIGEN FROM A HAP TEN DOMOIC ACID Dao Viet Ha1* and Pham Xuan Ky1 ABSTRACT With the aim to select the appropriate carrier protein for DA-antigen, a hap ten DA was coupled with 03 different carrier proteins e.g. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Bovine Serum Albumin (BSA) and Polylysin (Plys) via chemical substrate of Disuccinimidyl Suberate (DSS). Productivity of a reaction between DA and DSS (pH 6-7, room temperature) was stable (65-68%). In contrast, there was the difference in productivity among 03 carrier proteins reacted with DA-DSS: BSA showed highest productivity (20.5%), following were KLH (7.15%) and Plys (14.2%). In the antigen compound, a coupling ratio between DA and each protein was also different (Plys:59, BSA: 22, KLH: 14). Based on the information about free lysin number in protein structure, BSA is considered more advantage in both productivity and coupling ratio, therefore, it is selected to be as a carrier protein for DA antigen in order to produce specific DA-antibody in New Zealand rabbit in Vietnam. Keywords: domoic acid, productivity, antigen, carier protein. Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 29/5/2015 Ngày thông qua phản biện: 03/8/2015 Ngày duyệt đăng: 07/8/2015 1 Institute of Oceanography, Vietnam Academy of Science and Technology *Email: daovietha69@gmail.com 132 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 6 - THAÙNG 8/2015
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng