1. Trang Chủ
  2. Nông nghiệp
  3. Phân lập và khảo sát khả năng ức chế nấm Corynespora cassiicola của một số chủng xạ khuẩn

Phân lập và khảo sát khả năng ức chế nấm Corynespora cassiicola của một số chủng xạ khuẩn

Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập và chọn ra chủng xạ khuẩn tiềm năng kiểm soát nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) gây bệnh rụng lá corynespora (CLF) trên cây cao su. Thử nghiệm in vitro và ex vivo bước đầu đã chọn ra được 07 chủng xạ khuẩn TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54 và PT2. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM CORYNESPORA CASSIICOLA CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Hoàng Trọng Minh Quân*, Trần Khắc Huy, Nguyễn Hữu N

Thể loại Tài liệu miễn phí Nông nghiệp

Số trang 11

Ngày tạo 4/7/2023 1:23:34 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.80 M

Tên tệp

Tải Phân lập và khảo sát khả năng ức chế nấm Corynespo... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM CORYNESPORA CASSIICOLA CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN Hoàng Trọng Minh Quân*, Trần Khắc Huy, Nguyễn Hữu Nguyên, Trịnh Thanh Tâm, Nguyễn Hoàng Dũng, Lê Văn Ngô Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TP.HCM *Tác giả liên lạc: quanhoangtrong.hcmus@gmail.com (Ngày nhận bài: 10/2/2018; Ngày duyệt đăng: 22/3/2018) TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập và chọn ra chủng xạ khuẩn tiềm năng kiểm soát nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) gây bệnh rụng lá corynespora (CLF) trên cây cao su. Thử nghiệm in vitro và ex vivo bước đầu đã chọn ra được 07 chủng xạ khuẩn TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54 và PT2. Các chủng này có khả năng sản sinh hợp chất ức chế sự phát triển của nấm Corynespora cassiicola nên đã được định danh Sinh học phân tử và khảo sát điều kiện nuôi cấy. Trong đó, dịch chiết từ chủng Streptomyces misionensis PT2 khi nuôi cấy trong môi trường L4 tại thời điểm 7 ngày cho hoạt tính mạnh nhất, ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm bệnh trên mô hình lá cao su cắt rời trong ít nhất 72 giờ. Phân tích sắc ký pha đảo dịch chiết chủng PT2 ở bước sóng 254 nm cho thấy đỉnh có thời gian lưu 5.45 phút có nồng độ cao và cấu trúc tiềm năng với bước sóng hấp thu cực đại 288.5 nm và 399.2 nm. Từ khóa: C. cassiicola, streptomyces, cây cao su, xạ khuẩn, biến dưỡng thứ cấp, HPLC. ISOLATION AND INVESTIGATION FOR ANTIFUNGAL ACTIVITY TO CORYNESPORA CASSIICOLA OF SEVERAL ACTINOBACTERIA STRAINS Hoang Trong Minh Quan*, Tran Khac Huy, Nguyen Huu Nguyen, Trinh Thanh Tam, Nguyen Hoang Dung, Le Van Ngo University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: quanhoangtrong.hcmus@gmail.com ABSTRACT This research aims to isolate and screen for some Actinomyces showed significant antagonistic activity against the fungal pathogen Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) causing corynespora leaf fall (CLF) on rubber tree. In vitro and ex vivo tests have selected out seven candidates, named TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54, and PT2. Since these strains could synthesize compounds that inhibited Corynespora cassiicola from spreading, they were molecular identified and investigated for cultivation conditions. The result showed that when cultivated strain Streptomyces misionensis PT2 in L4 medium after 7 days gave highest antifungal activity, completely inhibited Corynespora cassiicola from invading rubber leaf tissue within at least 72 hours. Discovering PT2 extract by reverse-phase HPLC at 254 nm showed that 5.45- min peak had noticeable high concentration and promising structure with maximum 42
  2. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 absorbent wavelength at 288.5 nm và 399.2 nm. Keywords: C. cassiicola, streptomyces, rubber tree, actinomycete, secondary metabolism, HPLC. TỔNG QUAN nhiên, khả năng tiêu diệt nấm khi đã xâm Corynespora cassiicola là nấm nội kí sinh nhiễm vào trong mô lá của các chủng này gây bệnh phổ biến trên các loại cây công vẫn chưa được công bố. nghiệp và nông nghiệp, điển hình là cao Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng su, cà chua, đậu nành và đu đủ. Nấm tấn xạ khuẩn làm đối tượng nghiên cứu vì công lên tất cả các loại lá và giai đoạn sống ngành vi khuẩn này đã được khai thác phổ của cây, làm giảm sản lượng lên tới 30%, biến trong tìm kiếm và sàng lọc các kháng thậm chí gây chết hàng loạt. C. cassiicola sinh mới ứng dụng trong nông dược và y có khả năng tiết độc tố cassiicolin gây dược. Bên cạnh đó, bước đầu đề tài cũng rụng lá nhanh, hay còn gọi là bệnh rụng lá tiến hành khảo sát môi trường nuôi cấy C. Corynespora (Corynespora Leaf Fall – cassiicola để giúp tăng cường sản sinh CLF), đã và đang gây thiệt hại đáng kể cho hợp chất thứ cấp. Các phép phân tích được nhiều nước châu Á và châu Phi. Tại Việt thử nghiệm in vitro và ex vivo trên mô Nam, trong thời gian 2009-2010, nấm đã hình lá cao su cắt rời. Sự xuất hiện và thay từng gây dịch với quy mô 3.000 ha tại đổi hàm lượng của các hợp chất sẽ được Quảng Nam và Kom Tum, 300 ha tại Bình theo dõi bằng RP-HPLC. Dương. Nấm tồn tại ở khắp nơi, đặc biệt nhiều tại các bộ phận có triệu chứng bệnh PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP và các mô đang phân hủy. Chính vì vậy, Nguyên vật liệu khả năng gây bệnh luôn tiềm tàng, có thể Lá cao su: lá dùng để phân lập có triệu bùng phát thành dịch trong các điều kiện chứng bị C. cassiicola xâm nhiễm được phù hợp. thu thập tại Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Một số loại thuốc thương mại chứa Minh. Lá cao su 15 ngày tuổi thuộc giống carbendazim và hexaconazole có thể diệt IAN 873 dùng làm mô hình gây nhiễm ex nấm, tuy nhiên phổ diệt rộng có thể tác vivo. động xấu hệ sinh thái đất. Ngoài ra, cả hai Mẫu đất dùng trong phân lập xạ khuẩn: tất đều là thuốc độc có độ bền cao, trong đó cả mẫu dất được thu nhận ở nhiều địa điểm carbendazim thuộc nhóm C, có thể gây vô khác nhau tại vườn Quốc gia Cát Tiên sinh nên đã bị cấm sử dụng. Chính vì vậy, như: rễ cây, đồng cỏ, thảm mục, đất ven việc nghiên cứu tìm ra chế phẩm mới có sông suối. Đất sau khi thu nhận được để khả năng diệt trừ Corynespora cassiicola khô tự nhiên trong một tuần rồi nghiền và một cách hiệu quả và thân thiện môi sàng thành bột mịn để lưu trữ ở -20oC. trường là hết sức cần thiết. Tại nước ta, các Môi trường dùng cho phân lập C. nghiên cứu phòng trị bệnh bằng biện pháp cassiicola: Môi trường PGA (0.4% cao sinh học được quan tâm gần đây, mới chỉ khoai tây, 2% dextrose, 2% agar). Hấp được tiến hành sơ bộ trên Bacillus khử trùng ở 121oC trong 15 phút, bổ sung thuringiensis và Trichoderma sp. Tuy gentamycin về nồng độ of 1 µg/ml ngay 43
  3. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 trước khi đổ đĩa để loại bỏ bớt một phần được cấy sang đĩa PGA-gentamycin khác vi khuẩn không mong muốn trong quá để làm thuần. trình phân lập. Môi trường SD lỏng (2% Chủng nấm đã phân lập và làm thuần được dextrose, 1% peptone, pH 5.6 ở 25oC) xác nhận băng phương pháp định danh dùng để nuôi tăng sinh nấm. sinh học phân tử. Cụ thể, genome được thu Môi trường chọn lọc dùng cho phân lập xạ nhận và tinh sạch để làm khuôn cho phản khuẩn: Môi trường Humic acid Vitamin ứng PCR, sử dụng cặp mồi ITS1 (5’- agar hay A8 (0.1% humic acid, 0.005% TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) ITS4 cao nấm men, 0.002% nalidixic acid, (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). khoáng I lượng và vitamin, pH 7.2 ở Sản phẩm PCR được tinh sạch và tiến 25oC). Đây là môi trường truyền thống, hành giải trình tự với mồi ITS1. Trình tự hiệu quả trong phân lập xạ khuẩn do chỉ DNA được BLAST với cơ sở dữ liệu của chứa lượng dinh dưỡng vừa đủ cho xạ NCBI để xác nhận. khuẩn sử dụng. Kháng sinh terbinafin và Phân lập xạ khuẩn cycloheximide được bổ sung thêm lần lượt Mẫu đất sau khi sơ chế được xử lý bằng tới nồng độ 1 mg/L và 50 mg/L để loại bỏ nhiệt (120oC trong 1 giờ/70oC trong 1 giờ) bớt các vi khuẩn và nấm mốc. hoặc SDS để loại bỏ bớt vi sinh không Môi trường làm thuần xạ khuẩn: môi mong muốn. Sau đó, mẫu đất được hòa và trường ISP2 (0.4% cao nấm men, 1% cao pha loãng trong nước cất vô trùng trước malt, 0.4% dextrose, pH 7.2 ở 25oC). Mô khi tiến hành trải lên đĩa môi trường A8. trường giàu dinh dưỡng cho phép xạ Đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc sau vài trong 4 tuần để ghi nhận sự phát triển của ngày. các khuẩn lạc mang đặc trưng. Khuẩn lạc Môi trường nuôi cấy thu hợp chất thứ cấp: được làm thuần trên đĩa môi trường giàu Môi trường L4 (2% mannitol, 2% đậu dinh dưỡng ISP2. Các chủng cho hoạt tính nành, khoáng đa lượng và vi lượng, pH 6.2 tiềm năng được tiến hành định danh bằng ở 25oC. Môi trường sử dụng mannitol và phương pháp Sinh học Phân tử dựa trên đậu nành làm nguồn cung cấp dinh dưỡng trình tự 16S rRNA. chủ yếu vì giá rẻ mà vẫn đẩm bảo yêu cầu Các chủng xạ khuẩn được tách chiết sản xuất. genome bằng phương pháp phenol- Phương pháp nghiên cứu chloroform và tủa trong cồn lạnh. Genome Phân lập Corynespora cassiicola thu nhận được làm khuôn cho phản ứng Lá cao su có các triệu chứng đặc trưng bị PCR với cặp mồi F1 (5’- C. cassiicola xâm nhiễm được thu nhận và AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và rửa nhẹ bằng nước cất vô trùng. Vị trí 1500R (5’-GTTACCTTGTTACGACTT- nhiễm bệnh được cắt thành các miếng diện 3’). Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải tích 1 cm2, rửa trong cồn 70o rồi rửa lại trình tự bằng mồi F1. Kết quả giải trình tự bằng nước cất cô trùng. Đặt mảnh lá đã xử được BLAST với cơ sở dữ liệu của NCBI lý sơ bộ lên đĩa PGA có gentamycin, ủ 3- để chọn ra chi hoặc loài có độ tương đồng 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Khuẩn lạc có cấu cao nhất. trúc đại thể tương đồng với C. cassiicola Sàng lọc sơ bộ hoạt tính kháng in vitro 44
  4. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 Chủng xạ khuẩn và nấm C. cassiicola Đĩa được đem ủ ở 30oC và quan sát kết quả được cấy ở hai phía đối diện nhau trên đĩa đối kháng sau 10 ngày. thạch L4, cách mép đĩa 1.5 cm (Hình 1). Hình 1. Phương pháp đối kháng điểm Các chủng cho hoạt tính kháng sơ bộ được nồng độ 50,000 ppm để chuẩn bị cho các thu nhận bào tử xạ khuẩn được nhân giống thử nghiệm tiếp theo. trong môi trường ISP2, nuôi lắc trong 3-4 Dịch chiết được kiểm tra hoạt tính kháng ngày để sinh khối đạt lượng nhất định nấm C. cassiicola bằng phương pháp trước khi chuyển sang lên men lượng lớn khuếch tán đĩa giấy (2 mg cao/đĩa) trên trong môi trường ISP2 lỏng trong 1 tới 2 thạch PGA (Hình 2). Chứng âm là dung tuần. Dịch nuôi cấy được trích xuất bằng môi MeOH:DMSO, chứng dương là 40 µg dung môi ethyl actate, cô quay rồi hòa lại cycloheximide/đĩa. Đĩa được ủ ở nhiệt độ trong MeOH:DMSO (4:1) chuẩn hóa về phòng và quan sát kết quả sau 8-9 ngày. Hình 2. Phương pháp khuếch tán đĩa Thử nghiệm ex vivo khoảng 1-2 cm. 2 x 104 CFU bào tử C. Lá cao su 15 ngày tuổi giống IAN 873 cassiicola trong 0.85% NaCl và 0.05% được thu nhận, rửa nhẹ lần lượt bằng Tween 80 được nhỏ trực tiếp lên gân thứ ethanol 70o, 20% javel và nước cất vô cấp, tính là thời điểm 0 giờ. Dịch chiết xạ trùng. Lá sau khi rửa sạch được đặt vào khuẩn được nhỏ lên vết bệnh ở ngày thứ 3 hộp riêng, cách lớp bông ẩm bên dưới hoặc ngày thứ 6. Hộp được giữ ở nhiệt độ 45
  5. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 phòng. Kết quả được ghi nhận đánh giá ở cột CC 125x2 Kromasil 100-5 C18 với thời điểm 0 giờ, 24 giờ và 72 giờ dựa trên quy trình chạy HPLC như sau: 0-100% thang đo của Nguyễn Anh Nghĩa và cộng AcN, 0.3 mL/phút, 15 phút; 100-100% sự. Nghiệm thức được lặp lại 15 lần, sử AcN, 0.3 mL/phút, 4 phút; 100-0% AcN, dụng ANOVA để so sánh sự khác biệt 0.3 mL/phút, 1 phút; 0-0% AcN, 0.8 giữa ba thời điểm và giữa ba thời điểm đối mL/phút, 5 phút; Thời gian lưu: 25 phút. với chứng âm. Nếu bệnh không phát triển Đỉnh tiềm năng là các đỉnh có thời gian hoặc phát triển không đáng kể thì dịch lưu trong khoảng 6-12 phút (không quá chiết có khả năng ngăn ngừa sự phát triển phân cực), có nhiều đỉnh hấp thu UV và lan rộng của C. cassiicola. (nhiều gốc chức). Đối chiếu sự tăng giảm Khảo sát môi trường nuôi cấy tăng cường độ đỉnh với khả năng kháng C. cường sản sinh hợp chất thứ cấp cassiicola trên đĩa để bước đầu phán đoán Khuẩn lạc xạ khuẩn được nhân mầm vào hoạt tính kháng tương ứng. 25 mL môi trường ISP2 lỏng, nuôi lắc 150 rpm, nhiệt độ phòng trong 3 – 5 ngày (tùy KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chủng). Sau đó, tiến hành hút 1 mL dịch Phân lập C. cassiicola và xạ khuẩn nhân mầm chuyển vào 150 mL môi trường Từ mẫu lá bệnh, chúng tôi đã phân lập ISP2 hoặc L4 để tiếp tục nuôi. Thu mẫu được một chủng nấm có hình thái phù hợp sau ngày để so sánh thông qua HPLC. với các đặc trưng được mô tả về khuẩn lạc Phân tích dịch chiết bằng RP-HPLC C. cassiicola: khuẩn ti khí sinh khi non có Dịch chiết tổng sau khi được chuẩn hóa về màu trắng, khi già có màu xám (Hình 3A), 50,000 ppm được lọc qua màng 2 µL, khuẩn ti cơ chất tạo sắc tố đen (Hình 3B). chuyển vào vial 1.5 mL để nạp mẫu vào Hình 3. Chủng nấm phân lập được có hình thái giống C. cassiicola. (A) mặt trên, (B) mặt dưới và (C) hình thái hiển vi 30X Sau khi tiến hành PCR với cặp mồi cho lập được là C. cassiicola (kết quả không nấm và giải trình tự bằng mồi ITS1, chúng được trình bày). Chủng nấm này được sử tôi đã so sánh với cơ sở dữ liệu công bố dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. trên NCBI để khẳng định chủng nấm phân 46
  6. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 Hơn 100 chủng xạ khuẩn đã được phân sợi mảnh, cuối sợi phân đốt tạo thành các lập, mang một số đặc điểm đặc trưng cho chuỗi bào tử. Ngoài ra, vị trí giao nhau của ngành xạ khuẩn như: khuẩn lạc khô, bề các sợi tạo thành các khoang tiếp hợp, mặt nhăn, tạo bào tử, nhiều vòng đồng nhìn thấy rõ ở chủng TKH17 (Hình 5). tâm, ăn sâu mặt thạch,… (Hình 4). Dưới Các chủng này được tiến hành thử nghiệm thị trường của kính hiển vi vật kính dài hoạt tính sơ bộ để sang lọc các chủng có (long distance), khuẩn ti khí sinh có dạng khả năng kháng C. cassiicola. Hình 4. Hình thái một số khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được Hình 5. Hình thái của một số chủng xạ khuẩn dưới thị trường kính hiển vi vật kính dài (long distance). Các mũi tên trên hình của chủng TKH17 chỉ các khoang tiếp hợp 47
  7. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 Thử nghiệm in vitro sàng lọc chủng xạ chủng này được tách chiết và sử dụng khuẩn có tiềm năng ức chế C. cassiicola phương pháp khuếch tán dĩa để xác nhận Từ hơn 100 chủng phân lập được, 7 chủng lại. Đáng chú ý, bốn chủng TKH11, TT37, TKH08, TKH11, TKH12, TKH14, TT37, TT54 và PT2 cho hoạt tính kháng rất rõ TT54 và PT2 thể hiện hoạt tính kháng sơ ràng (Hình 6). bộ với C. cassiicola. Các dịch nuôi cấy các Hình 6. Dịch chiết các chủng xạ khuẩn ức chế sự phát triển của C. cassiicola Thử nghiệm khả năng gây bệnh ex vivo triển. Sau 6 ngày, vết bệnh đạt cấp 4, xuất của chủng C. cassiicola trên lá cây cao su: hiện nhiều tơ nấm. Sau 9 ngày, tơ nấm kết quả cho thấy chủng nấm thử nghiệm mọc rất nhanh, dày và lan rộng trên phiến có khả năng gây bệnh trên dòng cao su lá làm cho lá cao su chuyển màu sắc mạnh IAN 873. Tình trạng nhiễm bệnh nghiêm từ vàng nhạt sang nâu (Hình 7). Trong quá trọng dần theo thời gian: sau 24 giờ gây trình tiến triển của bệnh, khu vực xung nhiễm lá vẫn có biểu hiện bệnh ở cấp 0 tức quanh vùng bệnh bị hư hại có thể do ảnh là chưa bị bệnh. Sau 48 giờ bắt đầu xuất hưởng của độc tố cassiicolin, chuyển dần hiện đốm đen và viền vàng nhỏ. Sau 72 sang màu vàng rồi chuyển sang nâu. giờ đã xuất hiện vết bệnh và liên tục phát Hình 7. Triệu chứng và cấp bệnh tính theo ngày trên mẫu lá cắt rời 48
  8. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 Ngoài ra, khi cắt lát vùng bệnh mẫu lá vào và các tế bào mất đi sự liên kết. Sợi nấm ngày thứ 2, quan sát dưới kính hiển vi, có có thể quan sát dễ dàng ở khu vực bị xâm thể nhận thấy C. cassiicola dần xuyên qua nhiễm (Hình 8A). Vào ngày thứ 4, sợi nấm lớp cutin và xâm nhập vào các mô lá bên mọc dày đặc và lớn hơn trong khi đó nhiều trong. Các vết hoại tử xuất xuất hiện sau 4 đốm sẫm màu bắt đầu xuất hiện, chứng tỏ ngày lây nhiễm khiến vách tế bào mỏng đi mô lá bắt đầu bị phân hủy (Hình 8B). Hình 8. Mô lá nhiễm bệnh dưới thị trường kính hiển vi. (A) Sau 2 ngày và (B) sau 4 ngày nhiễm bệnh. Mũi tên chỉ ra sợi nấm C. cassiicola đang xâm nhiễm Xử lý vết bệnh với dịch chiết xạ khuẩn TT54, PT2 có khả năng kháng mạnh làm Lô xử lý vết bệnh sau 3 ngày (D3) cho cho nấm không thể phát triển ở những thấy: khả năng kiểm soát nấm gây bệnh ngày tiếp theo. Điều này là do khi nấm chỉ trên lá cao su C. cassiicola khi vết bệnh chỉ mới hình thành vết bệnh với mật độ nấm mới hình thành của bảy chủng xạ khuẩn là chưa đủ dày và mạnh và độ đậm đặc của khá tốt, trong đó đáng chú ý là những dịch chiết khiến cho nấm bị ức chế, không chủng xạ khuẩn TKH12, TKH14, TT37, thể mọc trở lại hoặc phát triển mạnh hơn. Hình 9. So sánh độ tiến triển của bệnh khi điều trị bằng các dịch chiết xạ khuẩn ở ngày thứ 3 (D3) và ngày thứ 6 (D6) sau 0-24-72 giờ 49
  9. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 Lô xử lý vết bệnh sau 6 ngày (D6) cho có kết quả kháng nấm trên đĩa giấy khá tốt thấy: đa phần các chủng xạ khuẩn chỉ làm nhưng trong điều kiện ex vivo thì khả năng chậm sự phát triển của C. cassiicola, nấm kháng không cao, sau 24 giờ sau khi nhỏ có thể mọc lại sau 72 giờ nên hiệu quả dịch chiết thì vết bệnh vẫn lan ra và ngày kiểm soát nấm không cao. Khi mà nấm càng phát triển. Ngược lại, chủng PT2 cho bệnh đã đạt cấp độ 4 với mật độ dày và kết quả kháng nấm rất tốt, ức chế hoàn phát triển rất nhanh dịch chiết khó có thể toàn sự phát triển và không để nấm mọc ức chế hoàn toàn nấm phát triển hoặc mọc trở lại. trở lại. Điều đáng chú ý là chủng TKH08 18 D3 0h D3 24h 16 D3 72h D6 0h ĐƯỜNG KÍNH VÙNG BỆNH (mm) 14 12 10 8 6 4 2 0 TKH08 TKH11 TKH12 TKH14 TT37 TT54 PT2 Đối chứng CHỦNG THỬ NGHIỆM Hình 10. Hiệu quả điều trị CLF trên mô hình ex vivo của dịch chiết PT2 trên lá cao su ở lô gây nhiễm 3 ngày. Lô điều trị bằng dịch chiết PT2 (lô A) sau 24 giờ (A1) và 72 giờ (A2) so với đối chứng (lô B) tại thời điểm 24 giờ (B1) và 72 giờ (B2) Những kết quả trên chứng tỏ rằng: chất Hầu hết các chủng khi nuôi cấy trên môi kháng nấm được tách chiết từ chủng PT2 trường L4 đều cho lượng chất thu được có khả năng kiểm soát nấm C. cassiicola tăng so với ISP2. Việc này có thể liên quan tốt nhất. Các chất kháng nấm từ các chủng tới thành phần môi trường. Đối với ISP2, TKH12, TKH14, TT37 và TT54 có khả có nhiều thành phần dễ chuyển hóa như năng kháng nấm mạnh khi nấm còn yếu, cao malt, cao nấm men, glucose, cộng với vết bệnh mới xuất hiện, khả năng kiểm việc không thay đổi môi trường so với lúc soát nấm giảm khi nấm đã mạnh, tốc độ nhân mầm thuần nên xạ khuẩn chỉ biểu lan bệnh nhanh và vết bệnh lớn. Hai chủng hiện ít gen cần thiết; ngược lại, môi trường còn lại TKH08 và TKH11 cho kết quả L4 có thành phần khó sử dụng hơn là kháng nấm yếu nhất. Maltose và đậu nành khiến xạ khuẩn phải Khảo sát môi trường nuôi cấy tăng thay đổi để thích ứng với môi trường mới, cường sản sinh hợp chất thứ cấp thông nhiều khả năng đã làm biến đổi quá trình qua HPLC chuyển hóa. Ngoài ra, các tiền chất trong 50
  10. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 đậu nành cũng có thể giúp kích thích tạo đỉnh này cao hơn hẳn so với các đỉnh khác nhiều hợp chất thứ cấp. Đơn cử như (đỉnh lớn 2.20 là của môi trường). Khi trường hợp chủng PT2: đỉnh 5.45 phút quét phổ UV-Vis của đỉnh 5.54 phút, có tăng mạnh cùng với hoạt tính kháng khi hai bước sóng được hấp thu mạnh nhất là chuyển sang nuôi trên môi trường L4 và 288.5 nm và 399.2 nm (Hình 11). Hình 11. Kết quả phân tích HPLC cao chiết tổng của chủng PT2 khi nuôi thuần trong L4 và ISP2. (A) tín hiệu thu được khi phân tích ở bước sóng 254 nm và (B) phổ quét UV-Vis của đỉnh 5.45 phút Định danh xạ khuẩn bằng phương pháp năng là một loài mới (Bảng 1). Tuy nhiên, sinh học phân tử để khẳng định điều này, cần tiến hành Dựa vào kết quả giải trình tự và đối chiếu tham chiếu thêm với một số chủng lân cận. với cơ sở dữ liệu của NCBI, bảy chủng Nhìn chung, các chủng phân lập được đều tiềm năng đã được định danh. Trong đó 3 thuộc chi Streptomyces. Điều này có thể chủng TKH08, TKH11 và TKH14 thuộc dự đoán trước vì quy trình, bao gồm các loài Streptomyces naganishii; Các chủng bước tiền xử lý, môi trường, thời gian ủ,… TKH12 và PT2 lần lượt thuộc các loài phù hợp với chi này. Mặt khác, tỷ lệ Strep. diastaticus và Strep. misionensis. Streptomyces trong đất chiếm tỉ lệ rất cao, Riêng chủng TT54 tương đồng cao với rất sức sống mạnh hơn so với các loài khác. nhiều loài nên chỉ mới khẳng định được Chính vì vậy, chúng tôi sẽ thử nghiệm một thuộc chi Streptomyces. Đặc biệt, chỉ có số quy trình khác để phân lập các chi khác một trình tự duy nhất tương đồng 100% nhau đặc biệt là xạ khuẩn hiếm với hy với chủng TT37 và vẫn chưa được đặt tên vọng tìm ra thêm nguồn hợp chất mới. chính thức (Streptomyces VK), đây có khả 51
  11. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số 4 (1), 2018 Bảng 1. Kết quả định danh và đối chiếu với cơ sở dữ liệu đã công bố trên NCBI Chủng xạ khuẩn Tên loài tương đồng Độ tương đồng TKH08 100% TKH11 Streptomyces naganishii 100% TKH14 100% TKH12 Streptomyces distaticus 100% TT37 Streptomyces VK 100% 100% TT54 Streptomyces sp. (trùng nhiều loài) PT2 Streptomyces misionensis 100% KẾT LUẬN được phát triển để thu nhận hợp chất phục Chúng tôi đã phân lập thành công nấm C. vụ nghiên cứu sâu hơn, góp phần phát cassiicola từ lá cao su nhiễm bệnh. Nấm triển các nông dược có nguồn gốc sinh phân lập có khả năng tái nhiễm lên lá cao học, không chỉ phục vụ cho việc điều trị su khỏe mạnh. Bên cạnh đó, 7 chủng xạ CLF mà còn cho các loại nấm bệnh khác khuẩn tiềm năng đã được chọn thông qua trên cây trồng. các thử nghiệm kháng nấm in vitro. Trong Lời cảm ơn số này, chỉ có chủng PT2 cho hoạt tính Đề tài này được thực hiện nhờ kinh phí của kháng ex vivo hiệu quả trên mô hình lá cao Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí su cắt rời khi ngăn vết bệnh phát triển Minh, Chương trình Vườn ươm Sáng tạo trong 72 giờ. Chủng PT2 có thể tiếp tục Khoa học và công nghệ Trẻ 2016 – 2017. TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐỖ THỊ THANH DUNG, LÊ THANH BÌNH, PHAN THỊ PHƯỢNG TRANG, et al., (2015), Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi nấm có khả năng đối kháng với nấm Corynespora cassiicola gây bệnh vàng lá, rụng lá ở cây cao su. Tạp chí khoa học Trường Đại học Sư phạm TP.HCM. 9(75): p. 82-94. NGUYỄN ĐÔN HIỆU, NGUYỄN ANH NGHĨA VÀ PHANH THÀNH DŨNG, (2011), Xác định tính gây bệnh của nấm Corynespora cassiicola phân lập từ cây cao su và một số cây ký chủ khác bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo trên lá cắt rời. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn. 22: p. 46-50. NGUYỄN VĂN MINH, MAI HỮU PHÚC, VÕ NGỌC YẾN NHI, et al., (2014), Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây cao su có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicola. Tạp chí Sinh học. 36(1se): p. 173-179. PU JINJI, ZHANG XIN, QI YANGXIAN, et al., (2007), First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China. Australasian Plant Disease Notes. X. WANG, M. SONG, C. GAO, et al., (2009), Carbendazim induces a temporary change in soil bacterial community structure. J Environ Sci (China). 52
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng