- Trang Chủ
- Ngư nghiệp
- Phân lập và khảo sát đặc tính probiotic của các chủng Bacillus spp. từ môi trường ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng Tháp
Xem mẫu
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC
CHỦNG BACILLUS spp. TỪ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI CÁ TRA
TẠI TỈNH ĐỒNG THÁP
Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh1, Văn Thị Thúy1, Nguyễn Văn Chắc2
TÓM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6/2013 đến tháng 8/2013 tại Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên
cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. Vật liệu cho quá trình phân lập (bao gồm 40 mẫu hệ tiêu hóa cá tra giống và
thương phẩm, 6 mẫu nước và 6 mẫu bùn ao nuôi cá tra) được thu thập từ hai huyện Thanh Bình và Hồng Ngự
thuộc tỉnh Đồng Tháp. Quá trình phân lập các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic thuộc nhóm Bacillus spp.
được thực hiện theo 3 bước. Sàng lọc bước một dựa trên đặc điểm hình thái (Gram dương, trực khuẩn, sinh
nội bào tử) và phản ứng catalase dương tính, kết quả có 76 chủng có được các đặc điểm hình thái tiêu biểu
cho nhóm Bacillus. Kết quả sàng lọc bước hai dựa trên khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào (protease,
amylase, lipase, cellulase) cho thấy có 46 chủng có khả năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên. Kết quả sàng lọc
bước ba dựa vào khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi,
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus) bằng phương pháp thạch khuếch tán và vạch thẳng vuông góc, cho thấy
có 11 chủng đối kháng với ít nhất 1 trong 4 chủng vi khuẩn kiểm định. 11 chủng Bacillus đã tuyển chọn được
lưu giữ trong bộ sưu tập giống của Phòng Sinh học Thực nghiệm và có tiềm năng ứng dụng làm probiotic
trong nuôi trồng thủy sản.
Từ khóa: Bacillus, cá tra, đối kháng, enzyme ngoại bào, probiotic.
I. MỞ ĐẦU spp. có mặt trong đa số các chế phẩm vi sinh lưu
Nhóm vi khuẩn Bacillus spp. là một hành trên thị trường trong nước và trên thế giới.
chi lớn (với 51 loài đã được định danh chính Hiện nay, trên thế giới có hàng trăm sản phẩm
xác và nhiều loài chưa được phân loại rõ ràng), thương mại của các chế phẩm vi sinh có chứa
thuộc họ Bacillaceae. Đặc điểm chung của chi nhóm Bacillus trong thành phần, được sử dụng
Bacillus là vi khuẩn hình que, Gram dương, cho người, động vật nuôi và nuôi trồng thủy sản
catalase dương tính, là vi khuẩn hiếu khí hoặc (Hong và ctv., 2005).
kỵ khí tùy nghi, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, Nhóm Bacillus spp. đã và đang được ứng
độ muối rộng. Đa số các loài vi khuẩn thuộc dụng rất rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản. Việc
chi Bacillus có khả năng sinh nội bào tử, giúp sử dụng Bacillus spp. như là vi khuẩn probiotic
cho chúng đạt được những ưu thế khi sử dụng đã giúp nâng cao tăng trưởng, tăng sức đề kháng
làm chế phẩm vi sinh như thời gian bảo quản bệnh và tăng cường hoạt động của hệ enzyme
dài, dễ dàng vận chuyển, sức đề kháng cao với đường ruột đối với các đối tượng giáp xác và
điều kiện khô hạn và chịu được nhiệt độ cao đến cá biển như tôm thẻ chân trắng Litopenaeus
60-70oC. Với những ưu điểm nêu trên, Bacillus vannamei (Liu và ctv., 2010; Nimrat và ctv.,
1
Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
Email: tinhntn.ria2@mard.gov.vn
2
Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013 71
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
2012; Zokaeifar và ctv., 2012), ấu trùng tôm được nuôi cấy trong môi trường chứa 30 g L-1
hùm Homarus gammarus (Daniels và ctv., chất thải từ ao nuôi tôm như là nguồn cacbon
2010), ấu trùng cá tráp (Avella và ctv., 2010), ấu và nitơ duy nhất. Dịch protease thô thu được
trùng cá bống mú Epinephelus coioides (Sun và có chứa ít nhất 7 loại protease khác nhau, được
ctv., 2013), cá bơn Paralichthys olivaceus (Cha ứng dụng trong việc tách đạm để thu hồi chitin
và ctv., 2013). từ chất thải ao nuôi tôm và trong quá trình phân
Có khá nhiều báo cáo về các chủng Bacillus hủy lông vũ của gia cầm, và có tiềm năng ứng
spp. được phân lập từ môi trường nuôi trồng dụng trong nhiều quá trình công nghệ sinh học
thủy sản. Chúng được tìm thấy trong môi trường khác (Haddar và ctv., 2011).
nước, lớp bùn đáy ao, hệ tiêu hóa của cá, giáp Khả năng sản sinh các hợp chất kháng
xác, nhuyễn thể hai mảnh vỏ và tôm (Sharmila khuẩn được xem như là một trong những cơ
và ctv., 1996; Gatesoupe, 1999). chế chủ yếu để ức chế và loại trừ các nhóm vi
Hai cơ chế tác động chủ yếu của nhóm sinh vật gây bệnh trong hệ tiêu hóa cũng như
Bacillus spp., đó là khả năng sinh các enzyme trong môi trường. Nhóm vi khuẩn Bacillus
ngoại bào giúp hỗ trợ tiêu hóa và khả năng có khả năng tiết ra một số lượng lớn các hợp
sinh các hợp chất kháng khuẩn đối kháng với chất kháng khuẩn. Nhóm hợp chất này bao
vi sinh vật gây bệnh. Trong số các nghiên cứu gồm bacteriocin, các hợp chất ức chế tương
về khả năng sinh enzyme ngoại bào của nhóm tự bacteriocin (Subtilin, Coagulin), các chất
Bacillus spp., có thể kể đến các nghiên cứu của kháng sinh (Surfactin, Iturins A, C, D, E,
Ghosh và ctv. (2002), Nejad và ctv. (2006) và Bacilysin) (Urdaci và Pinchuk, 2004). Nhiều
Wang (2007). chủng Bacillus chứa trong thành phần của các
Các enzyme ngoại bào có khả năng tiết chế phẩm vi sinh thương mại được biết đến với
ra bởi Bacillus spp. bao gồm 4 loại enzyme khả năng sản xuất chất kháng khuẩn. Chủng B.
chính: protease, amylase, lipase và cellulase. clausii trong sản phẩm Enterogermina® có khả
Trong số đó các protease kiềm nhận được sự năng tiết ra các hợp chất kháng khuẩn với hoạt
quan tâm lớn do khả năng ứng dụng cao của
tính ức chế các vi khuẩn Gram dương (Duc và
nhóm enzyme này. Theo nghiên cứu của Dias
ctv., 2004). Chủng B. polyfermenticus chứa
và ctv. (2008), hai chủng Bacillus, B. subtilis
trong sản phẩm Bispan của Hàn Quốc sản xuất
và một chủng hoang dại Bacillus sp. phân lập một loại bacteriocin nhạy cảm với protease và
từ quá trình lên men cà phê ở Brazil, được không bền với nhiệt, polyfermenticum, cũng
đánh giá khả năng tiết ra các protease kiềm. có đặc tính đối kháng với nhóm vi khuẩn Gram
Các chủng này được nuôi cấy trong môi trường dương (Lee và ctv., 2001). Chủng B. subtilis
dinh dưỡng có chứa các nồng độ khác nhau của var. natto có khả năng ức chế nấm gây bệnh
bột phô mai trong 72 giờ. Hoạt tính protease (Candida albicans) trong đường ruột, thông
cực đại đạt được sau 24 giờ (tương ứng với giai qua việc tiết ra hợp chất kháng khuẩn surfactin
đoạn cuối của pha tăng trưởng), đạt 839,8 U (Nagal và ctv., 1996).
mg-1 đối với B. subtilis và 975,9 U mg-1 đối với Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành
chủng hoang dại. Chủng B. licheniformis RP1 phân lập một số chủng Bacillus spp. từ môi
72 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
trường ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng Tháp theo 2.1. Vật liệu
hai tiêu chí là khả năng sinh enzyme ngoại bào Vật liệu cho quá trình phân lập bao gồm
và khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, mẫu bùn, nước thu từ ao nuôi cá tra giống và
nhằm đánh giá khả năng sử dụng các chủng này thương phẩm, hệ tiêu hóa cá tra giống và thương
làm chế phẩm vi sinh cho nuôi trồng thủy sản. phẩm, thu từ huyện Thanh Bình và huyện Hồng
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Ngự thuộc tỉnh Đồng Tháp. Số lượng mẫu thu
NGHIÊN CỨU được mô tả trong Bảng 1.
Bảng 1: Số lượng mẫu thu từ môi trường ao nuôi cá tra, tỉnh Đồng Tháp
Địa điểm Loại mẫu
Nước Bùn Hệ tiêu hóa
Thanh Bình, Đồng Tháp (cá thương phẩm) 3 3 10
Hồng Ngự, Đồng Tháp (cá giống) 3 3 30
Tổng 6 6 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu dương, sinh nội bào tử và catalase dương tính.
2.2.1. Sàng lọc các chủng Bacillus từ các Tiến hành nhuộm Gram các chủng đã phân lập
mẫu đã thu được và quan sát hình thái và sự hiện diện của
nội bào tử dưới kính hiển vi (vật kính 100X).
Trước tiên các mẫu được xử lý để thu thập
Các tế bào Gram dương sẽ bắt màu tím, nội bào
các hỗn hợp vi sinh vật. Mẫu hệ tiêu hóa (chỉ thu
tử (thường nằm ở vị trí trung tâm) không bắt
phần ruột non) được cắt nhỏ, cho vào ống falcon
màu. Phản ứng catalase được thực hiện bằng
có chứa 1ml nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) và
cách nhỏ một giọt dung dịch hydrogen peroxide
nghiền bằng chày cho đến khi mẫu được đồng
(H2O2) lên khuẩn lạc đặt trên lame kính. Bọt khí
nhất. Mẫu bùn được pha loãng trong nước muối
xuất hiện trong vòng 10 giây thể hiện phản ứng
sinh lý (1 g bùn trong 9 ml nước muối sinh lý),
catalase dương tính.
để lắng và thu phần dịch nổi. Mẫu nước được
lấy trực tiếp từ mẫu đã thu. 2.2.2. Phân lập dựa vào khả năng sinh các
enzyme ngoại bào
Tiếp theo, tiến hành loại bỏ các tế bào sinh
dưỡng bằng cách gia nhiệt mẫu trong bể ổn nhiệt a. Thử nghiệm amylase
ở 75oC trong 15 phút. Hút 100 µl dịch đã gia nhiệt Phản ứng sinh amylase (có tác dụng phân
trải trên môi trường DSM (Difco Sporulation hủy tinh bột thành các đường đơn) được nhận
Medium) agar và ủ ở 30oC trong 24 giờ. Lựa biết khi nhỏ dung dịch lugol vào trong môi
chọn các khuẩn lạc riêng lẻ dựa vào sự khác biệt trường thạch nuôi cấy có chứa tinh bột. Phản
về hình thái và màu sắc, làm thuần bằng cách cấy ứng dương tính thể hiện qua việc tạo thành vòng
ria lặp lại trên môi trường DSM agar. trong suốt xung quanh khóm khuẩn lạc. Trong
Bước chọn lọc chính dựa trên các tiêu chí trường hợp phản ứng âm tính thì môi trường sẽ
sau đây: chọn lọc các chủng trực khuẩn Gram có màu xanh đậm xung quanh khuẩn lạc.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013 73
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
b. Thử nghiệm lipase b. Phương pháp thạch khuếch tán (agar
Môi trường thử nghiệm được bổ sung CaCl2 diffusion) (Vaseeharan và Ramasamy, 2003)
và Tween 80 (một loại hợp chất béo). Nếu vi 50 µl dịch vi khuẩn gây bệnh được tráng
khuẩn có khả năng tiết ra enzyme lipase sẽ phân trên đĩa NA. Sau đó dùng ống sắt hình trụ tiệt
giải Tween 80 tạo các acid béo tự do, các acid trùng khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch, dùng nhíp
béo này sẽ kết tủa khi có mặt Ca2+, tạo nên vùng tiệt trùng gắp bỏ các khối thạch để tạo thành các
mờ đục bên dưới và xung quanh khuẩn lạc. giếng.
c. Thử nghiệm protease (thử nghiệm hai 50 µl dịch vi khuẩn khảo sát được tráng trên
loại enzyme gelatinase và caseinase) đĩa NA trước đó 24 giờ, ủ ở 30oC. Dùng ống sắt
Đối với những vi khuẩn sinh enzyme hình trụ tiệt trùng khoan 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch,
gelatinase, enzyme này sẽ phân hủy gelatine (bổ dùng nhíp tiệt trùng gắp các khối thạch chuyển
sung trong môi trường nuôi cấy) tạo vòng trong sang các giếng bên đĩa NA đã tráng vi khuẩn
xung quanh khóm khuẩn lạc khi có mặt dung gây bệnh.
dịch TCA (Trichloric Acetic Acid) 25%.
Ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC. Tiến
Đối với những vi khuẩn sinh enzyme hành đo khoảng cách vòng kháng khuẩn (D) tạo
caseinase, enzyme này sẽ phân hủy casein hiện thành xung quanh các giếng (nếu có) sau 24 giờ
diện trong môi trường Skim Milk Agar 1%, tạo và 48 giờ.
vùng phân giải trong suốt xung quanh khóm
Đánh giá mức độ đối kháng theo 3 mức:
khuẩn lạc.
D > 5 mm: Đối kháng mạnh (+++);
d. Thử nghiệm cellulase
5 ≥ D > 2 mm: Đối kháng trung bình (++);
Chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy
trên môi trường có bổ sung 1% CMC (Carbonyl D ≤ 2 mm: Đối kháng yếu (+).
Methyl Cellulose). Những chủng sinh enzyme III. KẾT QUẢ
cellulase sẽ phân giải CMC, sau khi nhuộm với 3.1. Kết quả sàng lọc dựa trên đặc điểm
lugol sẽ tạo các vòng trong suốt xung quanh hình thái, phản ứng catalase và khả năng
khóm khuẩn lạc. sinh enzyme ngoại bào
2.2.3. Phân lập dựa vào khả năng đối kháng Từ 52 mẫu thu ban đầu, sau khi gây sốc
với vi khuẩn gây bệnh nhiệt và trải đĩa trên môi trường DSM, kết
Sử dụng phương pháp vạch thẳng vuông góc quả chọn được 123 khuẩn lạc dựa vào sự khác
(cross-streak) và phương pháp thạch khuếch tán nhau về địa điểm thu mẫu, hình thái và màu sắc
(agar diffusion). Thực hiện trên 4 chủng gây bệnh khuẩn lạc. Sau đó các khuẩn lạc được cấy ria
kiểm định: Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, làm thuần trên môi trường NA. Tiếp theo tiến
V. alginolyticus, Edwardsiella ictaluri. hành sàng lọc bước một dựa vào hình thái vi
a. Phương pháp vạch thẳng vuông góc khuẩn và phản ứng catalase. Chúng tôi chọn lọc
(cross-streak) (Jayaseelan và ctv., 2013) được 76 chủng Gram dương, hình que, sinh nội
Chủng vi khuẩn khảo sát được cấy thành bào tử và phản ứng catalase dương tính.
một đường thẳng và ở giữa đĩa thạch Nutrient Các chủng này tiếp tục được chọn lọc
Agar (NA). Tiếp tục cấy vi khuẩn gây bệnh bước hai, khảo sát khả năng sinh 5 loại enzyme
theo các đường vuông góc với đường cấy của vi ngoại bào (gelatinase, caseinase, amylase,
khuẩn khảo sát. Ủ ở 30oC. Tiến hành đo khoảng lipase và cellulase). Kết quả sinh các enzyme
cách kháng khuẩn sau 24 giờ và 48 giờ. ngoại bào được minh họa trong hình 1.
74 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hình 1: Kết quả khảo sát khả năng sinh 3.2. Kết quả sàng lọc dựa vào khả năng đối
enzyme ngoại bào của các chủng Bacillus spp. kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh
A) Các khuẩn lạc sinh gelatinase; 46 chủng đã được sàng lọc ở bước hai (có
B) Các khuẩn lạc sinh caseinase; khả năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên), tiếp tục
được sàng lọc bước ba, dựa trên khả năng đối
C) Các khuẩn lạc sinh amylase;
kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết
D) Các khuẩn lạc sinh cellulase. quả cho thấy có 11 chủng có khả năng đối kháng
Kết quả trong bảng 2 cho thấy tổng cộng với ít nhất 1 trong 4 chủng vi khuẩn gây bệnh
có 46/76 chủng khảo sát có khả năng sinh từ 3 kiểm định (Bảng 3). Trong đó có 6 chủng đối
kháng mạnh với E. ictaluri (khoảng cách vòng
loại enzyme trở lên. Trong đó có 14 chủng sinh
kháng khuẩn 8-18 mm), 2 chủng đối kháng
3 loại enzyme, 9 chủng sinh 5 loại enzyme. Số mạnh với V. harveyi (khoảng cách vòng kháng
chủng sinh 4 enzyme là 23 chủng, chiếm 50% khuẩn 7,5-8 mm), 2 chủng đối kháng mạnh với
trên tổng số chủng vi khuẩn khảo sát. V. parahaemolyticus (khoảng cách vòng kháng
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013 75
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
khuẩn 11-11,5 mm) và 2 chủng đối kháng mạnh Từ 123 khuẩn lạc ban đầu, chúng tôi đã
với V. alginolyticus (khoảng cách vòng kháng sàng lọc được 11 chủng Bacillus (chiếm 8,9%)
khuẩn 9-10 mm). Đặc biệt chủng B14 đối kháng
sau quá trình sàng lọc qua ba bước. Các chủng
mạnh với hai chủng E. ictaluri và V. harveyi,
chủng B98 đối kháng mạnh với E. ictaluri và V. này được giữ giống trong Ngân hàng vi sinh vật
parahaemolyticus, chủng B90 đối kháng mạnh và có tiềm năng được sử dụng làm probiotic
với V. parahaemolyticus và V. alginolyticus. trong nuôi trồng thủy sản.
Bảng 2: Các chủng Bacillus spp. có khả năng sinh từ 3 loại enzyme ngoại bào trở lên
KH chủng Khả năng sinh enzyme ngoại bào Số enzyme
Amylase Cellulase Lipase Caseinase Gelatinase ngoại bào
B1 + + - + + 4
B4 + + - + + 4
B6 + + - + + 4
B7 + + - + + 4
B8 + + - + + 4
B13 + + + + + 5
B14 - - + + + 3
B15 - - + + + 3
B18 - - + + + 3
B19 + + - + + 4
B23 + + + + + 5
B26 + + + + + 5
B27 + + - + + 4
B29 + + + + + 5
B30 + + - + + 4
B32 + - - + + 3
B35 + + - + + 4
B36 - - + + + 3
B38 + + - + + 4
B39 + + - + + 4
B48 + + + - - 3
B51 + + - + + 4
B56 + + + + + 5
B58 + + + + + 5
B61 + + + + + 5
B68 + + - + + 4
B70 + + - + + 4
76 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
B75 + + - + + 4
B78 + + - + + 4
B80 + + - + + 4
B81 + + + + + 5
B84 + - - + + 3
B86 + + - + + 4
B87 + - - + + 3
B89 + + + + + 5
B90 + + - + + 4
B92 - + + + + 4
B93 + - - + + 3
B97 + + - + + 4
B98 + + - + + 4
B99 + - - + + 3
B102 - + - + + 3
B103 - + - + + 3
B110 + + + - - 3
B122 + + + - - 3
B123 - + + + + 4
A B
Hình 2: Khả năng đối kháng bởi các chủng Bacillus spp. với các chủng vi khuẩn kiểm định bằng
phương pháp vạch thẳng vuông góc (chủng B14 đối kháng với chủng E. ictaluri (A) và phương
pháp thạch khuếch tán (chủng B90 đối kháng với chủng V. parahaemolyticus) (B).
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013 77
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 3: Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp sau 48 giờ
Thạch khuếch tán Vạch thẳng vuông góc
E. V. para- V. V. E. V. para- V. V.
KH Nguồn gốc icta- haemo har- algino- icta- haemo- har- algino-
luri lyticus veyi lyticus luri lyticus veyi lyticus
B7 Mẫu nước ao cá thịt +++ - - - - - - -
B14 Mẫu nước ao cá giống +++ - +++ - +++ - - -
B15 Mẫu nước ao cá giống - - +++ - - - - -
B27 Mẫu bùn ao cá thịt +++ - + - +++ - - +
B30 Mẫu bùn ao cá thịt ++ - - - - - - -
B35 Mẫu bùn ao cá giống +++ - - - - - - -
B51 Hệ tiêu hóa cá thịt + + - - - - - -
B56 Hệ tiêu hóa cá thịt +++ - - - +++ - - -
B90 Hệ tiêu hóa cá giống - +++ - +++ +++ - - -
B97 Hệ tiêu hóa cá giống + - - +++ - - - +
B98 Hệ tiêu hóa cá giống +++ +++ - - +++ - - -
IV. THẢO LUẬN bờ biển tây nam Ấn Độ. Trong số 4.870 khuẩn
Với những đặc điểm ưu việt như khả năng lạc được sàng lọc, chỉ có khoảng 1% thể hiện
tạo bào tử, khả năng sinh enzyme ngoại bào đặc tính đối kháng mạnh đối với 6 chủng gây
và khả năng tiết ra các hợp chất kháng khuẩn, bệnh trong nuôi trồng thủy sản (Vibrio harveyi,
nhóm vi khuẩn Bacillus spp. được nghiên cứu V. anguillarum, V. alginolyticus, V. vulnificus,
nhiều nhất trong số các nhóm vi sinh vật có tiềm V. parahaemolyticus, Aeromonas hydrophila).
năng ứng dụng làm probiotic. Theo một nghiên Theo kết quả định danh bằng phương pháp
cứu gần đây thực hiện bởi nhóm tác giả Nair và sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA, các
ctv. (2012) nhằm khảo sát sự đa dạng của quần chủng đối kháng thuộc hai nhóm Bacillus và
xã vi sinh vật có đặc tính đối kháng từ các mẫu Pseudomonas, trong đó nhóm Bacillus chiếm
thu thập từ vùng cửa sông ở Cochin, dọc theo đến 81%.
78 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Có khá nhiều nghiên cứu tiến hành phân lập nuôi tôm. Kết quả cho thấy trong số 7 chủng
các chủng Bacillus từ môi trường thủy sản hoặc khảo sát chủng Dahb1 cho vùng đối kháng
với mục tiêu ứng dụng trong nuôi trồng thủy mạnh nhất (6-12 mm, phương pháp vạch thẳng
sản. Phương pháp sàng lọc chủ yếu được sử vuông góc) đối với 162 chủng Vibrio spp. phân
dụng là thử khả năng đối kháng với các chủng vi lập từ trại giống và ao nuôi tôm sú, bao gồm V.
khuẩn gây bệnh cần quan tâm. Chủng Bacillus harveyi (53 chủng), V. anguillarum (42 chủng),
subtilis VSG1, phân lập từ hệ tiêu hóa của cá V. vulnificus (31 chủng) và V. damselae (36
trôi Labeo rohita, có khả năng đối kháng rất chủng). Điều đáng lưu ý là kết quả khoảng cách
mạnh với 6 chủng Aeromonas hydrophila gây vùng đối kháng trong nghiên cứu của các nhóm
bệnh trên cá, với khoảng cách vùng đối kháng tác giả Nair và ctv. (2011), Luis-Villasenor và
19-21 mm theo phương pháp thạch khuếch tán ctv. (2011) và Jayaseelan và ctv. (2013) là tương
(Giri và ctv., 2011). Tương tự, chủng B. cereus tự với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Còn
TC-2 phân lập từ chất thải phụ phẩm trái dừa, khoảng cách vùng đối kháng trong nghiên cứu
thể hiện hoạt tính kháng khuẩn khá mạnh (theo của nhóm tác giả Giri và ctv. (2011) là cao hơn
phương pháp vạch thẳng vuông góc) đối với nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi.
V. harveyi (khoảng cách vùng đối kháng 13 Các nghiên cứu của một số nhóm tác giả đã
mm) và V. parahaemolyticus (khoảng cách
khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của
vùng đối kháng 12 mm) (Nair và ctv., 2011).
nhóm vi khuẩn Bacillus spp. cũng như khả năng
Theo Yilmaz và ctv. (2006), B. cereus có khả
kích thích vật chủ tiết ra các enzyme tiêu hóa.
năng tiết ra các chất kháng sinh như cerexin và
zwittermicin, điều này giải thích cho hoạt tính Wang (2007) và Nejad và ctv. (2006) đã chứng
kháng khuẩn mạnh ở loài vi khuẩn này. Luis- minh khi bổ sung một lượng vi khuẩn Bacillus
Villasenor và ctv. (2011) nghiên cứu đặc tính vào thức ăn nuôi tôm thì hoạt tính các enzyme
đối kháng với nhóm Vibrio gây bệnh bởi 4 tiêu hóa lipase, cellulase, protease và amylase
chủng Bacillus sp. phân lập từ hệ tiêu hóa của của tôm đều tăng có khác biệt về mặt thống kê
tôm chân trắng, bằng phương pháp đổ thạch so với nghiệm thức đối chứng. Các tác giả này
lớp kép và phương pháp thạch khuếch tán. Kết cũng cho rằng chính sự hiện diện của Bacillus
quả của phương pháp thạch lớp kép cho thấy đã kích thích vật chủ sản xuất ra một lượng lớn
chỉ có hai chủng (YC5-2 và YC2-a) ức chế sự enzyme ngoại bào. Ngoài ra, nghiên cứu của
phát triển của V. campbellii và V. vulnificus, với Ghosh và ctv. (2002) cho thấy Bacillus pumilus
khoảng cách vòng đối kháng từ 5-18 mm. Kết có khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào bao
quả của phương pháp thạch khuếch tán cho thấy gồm amylase và cellulase, là những enzyme
có 4 chủng (YC5-2, YC2-a, YC3-b và C2-2) ức quan trọng trong hoạt động tiêu hóa của cá bột.
chế sự tăng trưởng của V. parahaemolyticus và Với khả năng tiết ra các enzyme tiêu hóa ngoại
V. harveyi, với khoảng cách vòng đối kháng từ bào nói trên, nhóm Bacillus spp. có thể được sử
11-17,5 mm. Cả 4 chủng khảo sát đều không dụng thông qua con đường bổ sung vào thức ăn
thể hiện sự ức chế đối với V.alginolyticus. Mới để đưa vào hệ tiêu hóa của vật chủ, tại đó chúng
đây, Jayaseelan và ctv. (2013) khảo sát hoạt có thể thể hiện các đặc tính probiotic của mình,
tính đối kháng với nhóm Vibrio của 7 chủng cụ thể là hỗ trợ cho hệ tiêu hóa và nâng cao sức
probiotic B. licheniformis được phân lập từ ao tăng trưởng của vật chủ.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013 79
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
V. KẾT LUẬN iniae and as water additives. Aquaculture 402-
1. Từ 52 mẫu thu thập từ hệ tiêu hóa cá 403, 50-57.
tra, nước và bùn ao nuôi cá tra tại tỉnh Đồng Daniels, C.L., Merrifield, D.L., Boothroyd, D.P., Davies,
Tháp trong năm 2013, chúng tôi chọn lọc ban S.J., Factor, J.R., Arnold, K.E., 2010. Effect of
đầu được 76 chủng với những đặc điểm hình dietary Bacillus spp. and mannan oligosaccharides
thái tiêu biểu cho nhóm Bacillus: Gram dương, (MOS) on European lobster (Homarus gammarus
hình que, sinh nội bào tử và phản ứng catalase L.) larvae growth performance, gut morphology
dương tính. and gut microbiota. Aquaculture 304, 49-57.
2. Kết quả phân lập dựa vào khả năng sinh Dias, D.R., Vilela, D.M., Silvestre, M.P.C., Schwan,
enzyme ngoại bào cho thấy có 46 chủng có khả R.F., 2008. Alkaline protease from Bacillus sp.
năng sinh từ 3 loại enzyme trở lên. Trong đó có isolated from coffee bean grown on cheese whey.
23 chủng sinh 4 enzyme, chiếm 50% trên tổng
World J. Microbiol. Biotechnol. 24, 2027-2034.
số chủng vi khuẩn khảo sát.
Duc, L.H., Hong, H.A., Barbosa, T.M., Henriques,
3. Kết quả phân lập dựa vào khả năng đối
A.O., Cutting, S.M., 2004. Characterization of
kháng với vi khuẩn gây bệnh bằng phương
Bacillus probiotics available for human use. Appl.
pháp thạch khuếch tán và phương pháp vạch
Environ. Microbiol. 70, 2161-2171.
thẳng vuông góc, chúng tôi sàng lọc được 11
chủng có khả năng đối kháng với ít nhất 1 Gatesoupe, F.J., 1999. The use of probiotics in
trong 4 chủng vi khuẩn gây bệnh (Edwardsiella aquaculture. Aquaculture 180, 147-165.
ictaluri, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, Ghosh, K., Sen, S.K., Ray, A.K., 2002. Characterization
V. alginolyticus). 11 chủng Bacillus spp. được of Bacilli isolated from gut of rohu, Labeo rohita,
tuyển chọn có tiềm năng được sử dụng làm fingerlings and its significance in digestion. J.
probiotic trong nuôi trồng thủy sản. Appl. Aquaculture 12(3), 33-42.
Giri, S.S., Sukumaran, V., Sen, S.S., Vinumonia,
J., Banu, B.N., Jena, P.K., 2011. Antagonistic
LỜI CÁM ƠN
activity of cellular components of potential
Tác giả chân thành cảm ơn các bạn cộng probiotic bacteria, isolated from the gut of Labeo
tác viên của đề tài và các bạn đồng nghiệp của rohita, against Aeromonas hydrophila. Probiotics
Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên & Antimicro. Prot. 3, 214-222.
cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 đã hỗ trợ cho
nghiên cứu thành công. Haddar, A., Hmidet, N., Ghorbel-Bellaaj, O., Fakhfakh-
Zouari, N., Sellami-Kamoun, A., Nasri, M.,
2011. Alkaline proteases produced by Bacillus
licheniformis RP1 grown on shrimp wastes:
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Application in chitin extraction, chicken feather-
Avella, M.A., Gioacchini, G., Decamp, O., Makridis, degradation and as a dehairing agent. Biotechnol.
P., Bracciatelli, C., Carnevali, O., 2010.
Bioprocess Engineer. 16, 669-678.
Application of multi-species of Bacillus in sea
bream larviculture. Aquaculture 305, 12-19. Hong, H.A., Duc, L.H., Cutting, S.M., 2005. The use
of bacterial spore formers as probiotics. FEMS
Cha, J.-H., Rahimnejad, S., Yang, S.-Y., Kim, K.-W.,
Microbiol. Rev. 29, 813-835.
Lee, K.-J., 2013. Evaluations of Bacillus spp. as
dietary additives on growth performance, innate Jayaseelan, B.D., Vaseeharan, B., Maharajan, A.,
immunity and disease resistance of olive flounder Shanthi, S., Vinoj, G., 2013. Vibriostatic effects
(Paralichthys olivaceus) against Streptococcus of probiotic Bacillus licheniformis Dahb1 and its
80 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
molecular phylogeny resolved through RAPD the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus.
markers. Ann. Microbiol., DOI 10.1007/s13213- Aquaculture 252, 516-524.
013-0623-z. Nimrat, S., Suksawat, S., Boonthai, T., Vuthiphandchai,
Lee, K.H., Jun, K.D., Kim, W.S., Paik, H.D., 2001. V., 2012. Potential Bacillus probiotics enhance
Partial characterization of polyfermenticin bacterial numbers, water quality and growth during
SCD, a newly identified bacteriocin of Bacillus early development of white shrimp (Litopenaeus
polyfermenticus. Lett. Appl. Microbiol. 32, 146- vannamei). Vet. Microbiol. 159, 443-450.
151. Sharmila, R., Jawahar Abraham, T., Sundararaj, V.,
Liu, K.-F., Chiu, C.-H., Shiu, Y.-L., Cheng, W., Liu, 1996. Bacterial flora of semi-intensive pond
C.-H., 2010. Effects of the probiotic, Bacillus reared Penaeus indicus and the environment. J.
subtilis E20, on the survival, development, stress Aquaculture Tropics 11, 193-203.
tolerance, and immune status of white shrimp, Sun, Y.-Z., Yang, H.-L., Huang, K.-P., Ye, J.-D.,
Litopenaeus vannamei larvae. Fish & Shellfish Zhang, C.-X., 2013. Application of autochthonous
Immunol. 28, 837-844. Bacillus bioencapsulated in copepod to grouper
Luis-Villasenor, I.E., Macías-Rodríguez, M.E., Gómez- Epinephelus coioides larvae. Aquaculture 392-
Gil, B, Ascencio-Valle, F., Campa-Córdova, A.I., 395, 44-50.
2011. Beneficial effects of four Bacillus strains on Urdaci, M.C., Pinchuk, I., 2004. Antimicrobial activity
the larval cultivation of Litopenaeus vannamei. of Bacillus probiotics. In: Bacterial spore formers:
Aquaculture 321, 136-144. probiotics and emerging applications (Ricca, E.,
Nagal, S., Okimura, K., Kaizawa, N., Ohki, K., Henriques, A.O. and Cutting, S.M., Eds.), pp.
Kanatomo, S., 1996. Study on surfactin, a cyclic 171-182. Horizon Bioscience.
depsipeptide. II. Synthesis of surfactin B2
Vaseeharan, B., Ramasamy, P., 2003. Control of
produced by Bacillus natto KMD 2311. Chem.
pathogenic Vibrio sp. by Bacillus subtilis BT23, a
Phar. Bull. Tokyo 44, 5-10.
possible probiotic treatment for black tiger shrimp
Nair, A.G.H., Donio, M.T.B.S., Viji, V.R.T.,
Penaeus monodon. Lett. Appl. Microbiol. 36, 83-87.
Michaelbabu, M., Citarasu, T., 2011. Isolation
Wang, Y.B., 2007. Effect of probiotics on growth
from coconut retting effluent of Bacillus cereus
performance and digestive enzyme activity of the
TC-2 antagonistic to pathogenic Vibrios. Ann.
shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture 269, 259-
Microbiol. 61, 631-637.
264.
Nair, A.V., Vijayan, K.K., Chakraborty, K., Antony,
Yilmaz, M., Soran, H., Beyatli, Y., 2006. Antimicrobial
M.L., 2012. Diversity and characterization of
activities of some Bacillus sp. strains isolated
antagonistic bacteria from tropical estuarine
from the soil. Microbiol. Res. 161, 127-131.
habitats of Cochin, India for fish health
Zokaeifar, H., Balcázar, J.L., Saad, C.R., Kamarudin,
management. World J. Microbiol. Biotechnol. 28,
M.S., Sijam, K., Arshad, A., Nejat, N., 2012.
2581-2592.
Effects of Bacillus subtilis on the growth
Nejad, S.Z., Rezaei, M.H., Takami, G.A., Lovett, D.L., performance, digestive enzymes, immune gene
Mirvaghefi, A.R., Shakouri, M., 2006. The effect expression and disease resistance of white shrimp,
of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on Litopenaeus vannamei. Fish & Shellfish Immunol.
digestive enzyme activity, survival and growth in 33, 683-689.
TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013 81
- VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
ISOLATION AND EVALUATION OF PROBIOTIC PROPERTIES OF Bacillus
spp. FROM STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) POND
ENVIRONMENT IN DONG THAP PROVINCE
Nguyen Thi Ngoc Tinh1, Van Thi Thuy1, Nguyen Van Chac2
ABSTRACT
This study was conducted since June to August 2013, at the Department of Experimental Biology, Research
Institute for Aquaculture No2. The material for isolation (40 samples from striped catfish’s gut, 6 water
samples and 6 sediment sample from the nursing and grow-out striped catfish’s ponds) was collected from
Thanh Binh district and Hong Ngu district, Dong Thap province. The screening process for probiotic Bacillus
bacteria was undertaken in 3 steps. Step 1 which was based on morphological screening (Gram-positive, rod
shape and the presence of endospores) combined with catalase reaction, resulted in 76 isolates. Step 2 which
was based on the ability to excrete exogenous enzymes (protease, amylase, lipase, cellulase), resulted in 46
isolates excreting at least 3 enzymes. Step 3 was based on the antagonistic ability toward the aquatic patho-
gens (Edwardsiella ictaluri, Vibrio harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus) and resulted in 11 isolates
which antagonized at least one pathogenic strain. These 11 isolates are being preserved in the culture collec-
tion of the Department of Experimental Biology and have potential to be used as probiotics in aquaculture.
Keywords: antagonistic ability; Bacillus; exogenous enzymes; probiotic; striped catfish.
Người phản biện: TS. Đặng Tố Vân Cầm
Ngày nhận bài: 12/9/2013
Ngày thông qua phản biện: 20/9/2013
Ngày duyệt đăng: 15/10/2013
1
Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2.
Email: tinhntn.ria2@mard.gov.vn
2
Nong Lam University, Ho Chi Minh City
82 TAÏP CHÍ NGHEÀ CAÙ SOÂNG CÖÛU LONG - 2 - THAÙNG 11/2013
nguon tai.lieu . vn
