1. Trang Chủ
  2. Nông nghiệp
  3. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh Bacteriocin

Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh Bacteriocin

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin, định hướng ứng dụng như chất bổ sung trong thức ăn nuôi trồng thủy sản nhằm thay thế việc sử dụng chất kháng sinh như hiện nay. Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 3: 370-380 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 370-380 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN Enterococcus faecium HN1 CÓ KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN Phạm Hồng Hiển1, Dương Văn Hoàn2, Trầ

Thể loại Tài liệu miễn phí Nông nghiệp

Số trang 11

Ngày tạo 4/7/2023 1:01:23 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.65 M

Tên tệp

Tải Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn E... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 3: 370-380 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2022, 20(3): 370-380 www.vnua.edu.vn PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN Enterococcus faecium HN1 CÓ KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN Phạm Hồng Hiển1, Dương Văn Hoàn2, Trần Thị Đào2, Phạm Thị Dung2, Nguyễn Thị Thu2, Phạm Thị Thu Trang2, Nguyễn Xuân Cảnh2* 1 Ban Khoa học và Hợp tác quốc tế, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2 Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: nxcanh@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 14.06.2021 Ngày chấp nhận đăng: 16.02.2021 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin, định hướng ứng dụng như chất bổ sung trong thức ăn nuôi trồng thủy sản nhằm thay thế việc sử dụng chất kháng sinh như hiện nay. Trên môi trường MRS, bằng phương pháp cấy trải kết hợp với quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, 16 chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ 18 mẫu ruột cá được thu thập ở các địa điểm khác nhau. Trong đó 08 chủng có khả năng sinh bacteriocin và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn với 02 chủng vi khuẩn kiểm định (Salmonella sp. và Escherichia coli). Trong số đó, chủng HN1 được phân lập từ mẫu ruột cá rô phi thu thập ở Hà Nội có khả năng sinh bacteriocin mạnh nhất và thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh đồng thời với vi khuẩn Salmonella sp. và Escherichia coli với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 16mm và 15mm. Môi trường MRS có bổ sung glucose và cao nấm men với tỉ lệ 3%, chủng HN1 có khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin cao nhất. Kết hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích trình tự gen mã hóa vùng 16S rRNA, chủng HN1 đã được xác định là Enterococcus faecium HN1. Từ khoá: Bacteriocin, Enterococcus, thuỷ sản Isolation, Selection and Identification of Strain of Enterococcus faecium HN1 Capable of Producing Bacteriocin ABSTRACT This study was carried out to identify lactic bacteria producing bacteriocin potentially as supplement in the aquaculture feeds to replace the antibiotics. Combining methods of spreading and observing morphological characteristics of the colony on MRS medium, 16 strains of lactic acid bacteria were isolated from 18 fish gut samples collected at different locations. Among these, 8 strains were able to produce bacteriocin showing antibacterial activity against Salmonella sp. and Escherichia coli. The strain HN1 isolated from Tilapia gut samples collected in Hanoi had the most vital bacteriocin - producing ability and exhibited strong antibacterial activity simultaneously against Salmonella sp. and Escherichia coli with antibacterial ring diameters of 16mm and 15mm, respectively. On MRS medium supplemented with 3% glucose as a carbon source and 3% yeast extract as a nitrogen source, the strain HN1 was able to grow and produce the highest amount of bacteriocin. The combination of morphological, physiological, biochemical characteristics and analysis of molecular biological sequences has identified the strain HN1 as Enterococcus faecium. Keywords: Aquaculture, bacteriocin, Enterococcus. (Sahoo & cs., 2014). Ở Việt Nam, sân lþợng nuôi 1. ĐẶT VẤN ĐỀ trồng thûy sân 6 tháng đæu nëm 2021 þĆc tính Nuôi trồng thûy sân là ngành sân xuçt thăc đät 2.104,8 nghìn tçn, tëng 4,1% so vĆi cùng kỳ phèm phát triển nhanh nhçt trên thế giĆi vĆi nëm trþĆc (quý II/2021 đät 1.164,5 nghìn tçn, tốc độ tëng trþćng trung bình hàng nëm là 8,8% tëng 4,9%), trong đò cá đät 1.456,7 nghìn tçn, 370
  2. Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh tëng 1,7%, tôm đät 392,9 nghìn tçn, tëng 10,7%. nhiều nëm trên toàn thế giĆi. Các chûng vi Sân lþợng cá tra nëm 2021 đät 705,1 nghìn tçn, khuèn có khâ nëng sinh bacteriocin đã đþợc tìm tëng 1,0% so vĆi cùng kỳ nëm trþĆc, sân lþợng thçy nhþ Lactobacillus helveticus PJ4 đþợc tôm thẻ chân tríng đät 254,6 nghìn tçn, tëng phân lêp tÿ hệ vi sinh vêt đþąng ruột cûa chuột 15,4%, sân lþợng tôm sú đät 113,1 nghìn tçn, có khâ nëng sinh bacteriocin PJ4 kháng läi tëng 1,9% so vĆi cùng kì nëm 2020 (Tổng cýc Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa Thống kê, 2021). Để đâm bâo ngành nuôi trồng (Jena & cs., 2013). Chûng Enterococcus faecium thûy sân phát triển bền vĂng thì vçn đề quân lý CJNU 2524 có khâ nëng kiểm soát mæm bệnh dðch bệnh trong nuôi trồng thûy sân cæn đþợc gây ra bći Listeria monocytogenes (Yang & kiểm soát chặt chẽ. Hiện nay một số bệnh do vi Moon, 2021). Chûng Bacillus sp. BV1 đþợc phân khuèn gây thiệt häi nghiêm trọng đối vĆi nghề lêp tÿ nþĆc sông có khâ nëng sinh bacteriocin nuôi cá nhþ bệnh nhiễm trùng máu ć cá (bệnh kháng läi vi khuèn Vibrio parahaemolyticus gây Vibriosis), bệnh tríng đuôi (bệnh columnaris), bệnh trên tôm thẻ chân tríng (Phäm Minh bệnh liên cæu, tý huyết trùng, bệnh lao cá và Tuçn & cs., 2018). Tuy việc sàng lọc các chûng bệnh nhiễm trùng đþąng ruột (Toranzo & cs., vi sinh vêt có khâ nëng sinh bacteriocin đþợc 2005; Mohanty & Sahoo, 2007; Noga, 2010). thăc hiện trên các đối tþợng khác nhau, nhþng Việc sā dýng kháng sinh đþợc xem là phþĄng nghiên cĀu tuyển chọn chûng vi khuèn phân lêp pháp điều trð phổ biến và có hiệu quâ trong nuôi tÿ ruột cá có khâ nëng kiểm soát nguồn bệnh trồng thûy sân. Tuy nhiên, việc läm dýng chçt thuỷ sân còn hän chế. Chính vì vêy nghiên cĀu kháng sinh có thể dén tĆi tình träng kháng này đþợc thăc hiện vĆi mong muốn phát hiện, thuốc cûa các mæm bệnh trong nuôi trồng thûy xác đðnh các chûng vi khuèn có khâ nëng sinh sân đồng thąi gây mçt an toàn thăc phèm và bacteriocin tÿ đþąng ruột cá đðnh hþĆng Āng ânh hþćng lĆn tĆi chçt lþợng nông sân. Do vêy dýng trong ngành nuôi trồng thuỷ sân. việc nghiên cĀu biện pháp phòng bệnh, hän chế sā dýng chçt kháng sinh trong nuôi trồng thûy sân để đâm bâo nëng suçt và chçt lþợng nông 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU sân hiện đang là vçn đề đþợc nhiều nhà khoa 2.1. Thu thập mẫu học quan tâm. Méu vêt đþợc thu thêp theo Sahoo & cs. Bacteriocin có bân chçt là các phân tā (2015): Các méu ruột cá đþợc thu thêp tÿ các protein đþợc tổng hợp ć ribosom cûa vi khuèn, chợ täi một số khu văc ć Hà Nội, Nghệ An, Hâi có khâ nëng kháng läi các tác nhân gây bệnh là Phòng và Hâi DþĄng sau đò đþợc bâo quân vi khuèn do să täo thành các kênh làm thay đổi tính thçm cûa màng tế bào. Một số loäi trong đá länh và vên chuyển nhanh về phòng bacteriocin còn có khâ nëng phån giâi DNA, thí nghiệm. Sau khi mang về phòng thí nghiệm, RNA và tçn công vào lĆp peptidoglycan để làm các méu ruột cá này đþợc xā lý riêng biệt và rāa suy yếu thành tế bào (Rattanachaikunsopon & säch bên ngoài bìng nþĆc muối sinh lý cs., 2010). Bacteriocin không đþợc coi là một Natriclorid 0,9% để lçy phæn vêt chçt bên trong. nhóm kháng sinh vì chúng thể hiện phổ kháng Quá trình thu méu và xā lý méu đþợc thăc hiện khuèn chống läi các chûng cûa các loài có quan tÿ tháng 08/2020 đến tháng 11/2020. hệ họ hàng gæn; trong khi kháng sinh phát huy Các chûng vi sinh vêt kiểm đðnh gồm chûng tác dýng Āc chế đối vĆi nhiều loäi vi sinh vêt Salmonella sp. đþợc phân lêp tÿ méu cá rô phi gây bệnh, ngay câ khi hoät tính cûa kháng sinh bð bệnh thu thêp t4äi Hâi Phòng và Escherichia bð hän chế, nó không cho thçy bçt kỳ tác dýng coli đþợc phân lêp tÿ méu cá lëng bð bệnh thu þu tiên nào đối vĆi các loài có họ hàng gæn thêp täi Nghệ An, đþợc bâo quân, lþu trĂ täi (Zacharof & Lovitt, 2012). phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh, Việc sàng lọc các chûng vi sinh vêt có khâ Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nëng sinh bacteriocin đã đþợc tiến hành trong nghiệp Việt Nam. 371
  3. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh bacteriocin 2.2. Phân lập vi khuẩn lactic đþợc xác đðnh bìng hiệu số giĂa đþąng kính vòng kháng khuèn và đþąng kính giếng thäch. PhþĄng pháp đþợc thăc hiện theo Sahoo & D = D – d (D: đþąng kính vòng kháng khuèn cs. (2015). Một gram méu ruột cá đã qua xā lý, (mm), d: đþąng kính giếng thäch (mm)). đþợc cít thành các mânh nhó trong cối sĀ vô trùng và đþợc nghiền mðn để giâi phóng vi sinh 2.4. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả vêt bên trong ruột, méu đã nghiền mðn đþợc chuyển vào bình tam giác bổ sung 99ml dung năng sinh bacteriocin dðch nþĆc muối sinh lý vô trùng, líc vĆi tốc độ 2.4.1. Phương pháp xử lý nhiệt 160 vñng/phút trong 30 phút, sau đò để líng đþợc PhþĄng pháp đþợc thăc hiện theo độ pha loãng 10-2. Dung dðch méu đþợc pha loãng Ogunbanwo & cs. (2003), Rajaram & cs. (2010): tĆi độ pha loãng 10-5. Lçy 100µl dung dðch méu ć Các chûng vi khuèn đã đþợc xác đðnh có khâ các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 cçy trâi trên đïa nëng kháng vi sinh vêt kiểm đðnh đþợc nuôi cçy môi trþąng MRS (g/l: Glucose 20,0; cao thðt 10,0; và xā lý dðch sau nuôi cçy theo phþĄng pháp mô cao nçm men 5,0; peptone 10,0; tween 80 1ml, tâ ć mýc 2.3 và đþợc xā lý ć các nhiệt độ 40C, triamonium citrate 2,0; K2HPO4.3H2O 2,0; 60C, 80C, 100C, trong 30 phút và 121C trong CH3COONa 5,0; MgSO4.7H2O 0,58; MnSO4.4H2O 15 phút sau đò xác đðnh khâ nëng kháng vi sinh 0,28; CaCO3 5,0; agar 15,0; pH = 6,5 ± 0,2), nuôi ć vêt kiểm đðnh nhþ phþĄng pháp mô tâ phía trên. 37C trong 48 gią trong điều kiện hiếu khí. Tÿ mỗi méu phân lêp chọn ra các khuèn läc đặc 2.4.2. Xử lý bởi enzyme phân giải protein trþng cho vi khuèn lactic. Các däng khuèn läc Thí nghiệm đþợc thăc hiện theo Marwa & tríng đýc, không màu, bą láng, lồi, bìa nguyên cs. (2015). Các chûng vi khuèn đã đþợc xác đðnh hoặc chia thùy, kích thþĆc nhó, có khâ nëng phån có khâ nëng kháng vi sinh vêt kiểm đðnh đþợc giâi CaCO3 đþợc cçy chuyển sang môi trþąng nuôi cçy và xā lý dðch sau nuôi cçy theo phþĄng MRS để làm thuæn. Các chûng phân lêp sau đò pháp mô tâ ć mýc 2.3 sau đò đþợc xā lý vĆi đþợc nhuộm Gram để quan sát đặc điểm hình proteinase K (Bio Basic): Hai trëm micro-lít thái tế bào (Barrow & Feltham 1993). dðch đþợc û vĆi 10µl proteinase K nồng độ 10 mg/ml, ć 37C trong 2 gią, sau đò đun nòng ć 2.3. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật 100C trong 3 phút để loäi bó các tác động còn kiểm định của các chủng vi khuẩn phân läi cûa proteinase K. Méu đþợc kiểm tra hoät lập được tính kháng khuèn bìng phþĄng pháp khuếch PhþĄng pháp đþợc thăc hiện theo tán trên đïa thäch nhþ đã mô tâ phía trên. Các Hernandez & cs. (2005). Các chûng vi khuèn giếng thäch không thể hiện khâ nëng kháng phân lêp đþợc nuôi cçy trong 5ml môi trþąng khuèn cho thçy chçt kháng khuèn có thể có bân MRS lóng ć 30C trong 48 gią. Sau đò, 1ml dðch chçt là protein nên đã bð phân giâi bći nuôi cçy đþợc ly tâm ć 4C vĆi tốc độ 10.000 proteinase K; ngþợc läi vòng kháng khuèn xuçt hiện quanh giếng thäch cho thçy chçt kháng vòng/phút trong 10 phút, thu phæn dðch nổi phía khuèn không phâi là protein. trên và điều chînh pH về 6,5 bìng NaOH để loäi bó tác dýng cûa axit lactic. Một trëm micro-lít 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần dðch nổi trên đþợc nhó vào các giếng thäch trên môi trường nuôi cấy lên khả năng sản xuất đïa petri đã cçy vi khuèn kiểm đðnh trþĆc đò bacteriocin của các chủng vi khuẩn đþợc nuôi trong ống nghiệm chĀa 3ml môi trþąng LB lóng ć 30C trong 24 gią. Đïa thäch Thí nghiệm đþợc thăc hiện theo Nguyễn sau đò đþợc đặt ć 4C trong 1 gią rồi đþợc Vën Thành & Nguyễn Ngọc Trai (2012). Chûng chuyển vào tû nuôi 30C và quan sát kết quâ vi khuèn có khâ nëng sinh bacteriocin mänh sau 12 gią nuôi cçy. Hoät tính kháng khuèn cûa nhçt đþợc nuôi cçy trong môi trþąng MRS lóng các chûng phân lêp đþợc thể hiện qua vòng có bổ sung Glucose vĆi hàm lþợng 1, 2, 3% w/v, kháng khuèn xuçt hiện quanh giếng thäch và cao nçm men vĆi hàm lþợng 1, 2, 3% w/v, NaCl 372
  4. Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh vĆi hàm lþợng 1, 2, 3% w/v đþợc dùng để khâo TCMTGGCTCAG-3’) và 1492R (5’- TACGG sát ânh hþćng cûa thành phæn môi trþąng nuôi YTACCTTGTTACGACTT-3’). Sân phèm PCR cçy lên să hình thành bacteriocin. Hoät tính đþợc giâi trình tă bìng phþĄng pháp Sanger câi bacteriocin đþợc xác đðnh bìng phþĄng pháp tiến. MĀc độ tþĄng đồng về trình tă gen mã hóa khuếch tán trên đïa thäch. 16S rRNA cûa chûng nghiên cĀu đþợc so sánh vĆi các chûng đã công bố trên Genbank sā dýng 2.6. Định danh chủng vi khuẩn công cý tra cĀu Blast. Sā dýng phæn mềm DNA cûa chûng vi khuèn tuyển chọn đþợc MEGAX để xây dăng cåy xác đðnh mối quan hệ tách chiết theo phþĄng pháp mô tâ bći Masoomi di truyền, vĆi độ tin cêy đþợc tính bìng thuêt & cs. (2016). Gen mã hóa cho vùng 16S rRNA toán Bootstrap vĆi 1.000 læn lặp läi. Dăa vào cây cûa chûng đþợc tuyển chọn đþợc nhân lên bìng phân loäi và giá trð Bootstrap để xác đðnh mối kỹ thuêt PCR vĆi cặp mồi 27F (5’-AGAGTTTGA quan hệ di truyền cûa chûng nghiên cĀu. Bảng 1. Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập Ký hiệu chủng Nguồn gốc phân lập Đặc điểm hình thái HN1 Cá rô phi - Hà Nội Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + HN2 Cá trắm - Hà Nội Khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bóng, lồi. Hình que ngắn, Gram + HN3 Cá trắm - Hà Nội Khuẩn lạc tròn nhỏ, bề mặt trơn bóng Trực khuẩn, Gram + NA1 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn màu trắng đục, bề mặt lồi Trực khuẩn, Gram + NA1.1 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng ngà, viền nhăn Cầu khuẩn, Gram + NA1.3 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng đục, dẹt Cầu khuẩn, Gram + NA2 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + NA3 Cá diêu hồng - Nghệ An Khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + HP1.1 Cá lăng - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn, bề mặt nhô, màu trắng ngà, có chấm ở tâm Trực khuẩn, Gram + HP1.2 Cá lăng - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng đục, bề mặt lồi Trực khuẩn, Gram + HP1.3 Cá lăng - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn nhỏ, màu trắng trong, bề mặt lồi Cầu khuẩn, Gram + HP2.1 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng đục, bề mặt lồi Trực khuẩn, Gram + HP2.2 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn, màu trắng đục Trực khuẩn, Gram + HP2.3 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng sữa, bề mặt trơn Trực khuẩn, Gram + HP2.4 Cá trắm - Hải Phòng Khuẩn lạc tròn nhỏ, bề mặt lồi, bóng Trực khuẩn, Gram + HD1 Cá rô phi - Hải Dương Khuẩn lạc tròn, màu trắng trong, dẹt Cầu khuẩn, Gram + 373
  5. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh bacteriocin 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chûng vi khuèn này đþợc chọn để sā dýng cho các nghiên cĀu tiếp theo. 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic Tÿ 18 méu ruột cá khác nhau bao gồm cá 3.2. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật lëng, cá trím, cá diêu hồng, cá rô phi đþợc thu kiểm định của các chủng phân lập thêp tÿ các đða phþĄng khác nhau nhþ Hà Nội, Các chûng phân lêp đþợc kiểm tra khâ nëng Hâi Phòng, Hâi DþĄng, Nghệ An trên môi Āc chế sinh trþćng đối vĆi hai chûng vi sinh vêt trþąng MRS có bổ sung 0,5% CaCO3, 16 chûng kiểm đðnh là Salmonella sp. và Escherichia coli vi khuèn cò đặc điểm hình thái khuèn läc đặc trþng cûa vi khuèn lactic đã đþợc phân lêp. Tçt bìng phþĄng pháp khuếch tán trên đïa thäch. câ các chûng đều có khuèn läc tròn, bóng, bìa Trong tổng số 16 chûng phân lêp, 9 chûng vi nguyên hoặc bìa viền, có màu tríng, tríng sĂa khuèn có khâ nëng đối kháng vĆi hai chûng vi hoặc tríng đýc có khâ nëng phån giâi CaCO3 khuèn kiểm đðnh (Hình 1). Trong đò chûng HN1 theo mô tâ cûa Kandler & Weiss (1986) cho thçy khâ nëng kháng mänh đồng thąi vĆi câ (Bâng 1). Mặt khác, các chûng phân lêp đþợc hai chûng vi khuèn kiểm đðnh vĆi đþąng kính đều là vi khuèn Gram dþĄng vĆi 07 chûng là vòng kháng khuèn læn lþợt là 16mm (Salmonella cæu khuèn và 09 chûng là trăc khuèn. Các sp.) và 15mm (Escherichia coli) (Hình 2). Escherichia coli Salmonella sp. Hình 1. Hoạt tính kháng khuẩn của 09 chủng phân lập Hình 2. Đường kính vòng kháng khuẩn của 09 chủng phân lập 374
  6. Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh Kết quâ này phù hợp vĆi kết quâ nghiên khâ nëng kháng khuèn sau khi xā lý dðch nuôi ć cĀu cûa nhiều tác giâ đã đþợc công bố trþĆc đåy. 100C trong 30 phút (Hình 3). Các nghiên cĀu Nghiên cĀu cûa Wakil & Osamwonyi (2012) cho trþĆc đò đều chî ra rìng chçt kháng khuèn sinh thçy Lactobacillus brevis có khâ nëng kháng ra bð mçt hoät tính ć nhiệt độ cao có bân chçt là Escherichia coli và Salmonella spp. vĆi đþąng bacteriocin. Marwa & cs. (2015) cho thçy chçt kính vòng kháng khuèn læn lþợt là 10 ± 0,1mm kháng khuèn sinh ra bći vi khuèn Lactobacillus và 5 ± 0,1mm; chûng Lactobacillus plantarum acidophilus DSM 20079 có bân chçt là có khâ nëng kháng Salmonella spp. vĆi đþąng bacteriocin qua thí nghiệm xác đðnh độ bền kính vòng kháng khuèn là 10 ± 0,1mm. Nwafor nhiệt cûa chçt kháng khuèn. Nëm 2011, Castro (2014) đã công bố rìng các loài vi khuèn lactic: & cs cüng đã chî ra rìng bacteriocin đþợc sinh Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis, ra tÿ các chûng vi khuèn lactic bền nhiệt ć các Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, nhiệt độ 70C trong 15 phút, 85C trong 30 Leuconotoc sp., Streptococcus thermophilus, phút, 100C trong 15 phút. Nhþ vêy, chçt kháng Streptococcus cremoris, Streptococcus pyogenes khuèn đþợc sinh ra bći 08 chûng vi khuèn bao đều thể hiện khâ nëng kháng vi khuèn gồm HP1.1, HP2.1, HP2.2, NA1.1, NA1.3, NA3, Escherichia coli vĆi đþąng kính vòng kháng HN1, HN2 có thể có bân chçt là protein và có khuèn dao động tÿ 3 ± 0,05mm đến 6 ± 0,25mm, thể là bacteiocin và đþợc sā dýng trong nghiên và có khâ nëng khuèn kháng Salmonella typhi cĀu tiếp theo. vĆi đþąng kính vòng kháng khuèn dao động tÿ 4 ± 0,2mm đến 10 ± 0,02mm. Do vêy, 09 chûng 3.3.2. Xử lí bằng enzyme phân giải protein phân lêp này đþợc tuyển chọn để sàng lọc chûng Chçt kháng khuèn cûa 08 chûng vi khuèn vi khuèn có khâ nëng sinh bacteriocin tuyển chọn đþợc xā lý vĆi proteinase K để tiếp týc xác đðnh bân chçt cûa chçt kháng khuèn. 3.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả Kết quâ cho thçy các méu sau khi û vĆi năng sinh bacteriocin proteinase K đều bð mçt hoät tính kháng khuèn Bacteriocin đþợc xác đðnhvà phân loäi dăa vĆi các chûng Salmonella sp. và Escherichia coli trên cçu trúc hoá học, khối lþợng phân tā, tính (Hình 4). Marwa & cs. (2015) đã kết luên rìng nhäy câm vĆi enzyme, cĄ chế diệt khuèn, khâ chçt kháng khuèn đþợc sinh ra bći chûng nëng chðu nhiệt, hoät tính kháng khuèn Lactobacillus acidophilus DSM 20079 có bân (Kaðkonienë & cs., 2017). Trong đò, xác đðnh chçt là protein. Do đò, khi chçt kháng khuèn khâ nëng chðu nhiệt và tính nhäy câm vĆi này đþợc xā lý vĆi proteinase K đã bð mçt hoàn enzyme là các phþĄng pháp hiệu quâ nhçt giúp toàn hoät tính kháng khuèn vĆi Staphylococcus xác đðnh bacteriocin. aureus, Bacillus subtilis và Escherichia coli. Nghiên cĀu cûa Zendo & cs. (2005) cüng chî ra 3.3.1. Xử lí nhiệt rìng chçt kháng khuèn sinh ra bći Dðch nuôi cçy cûa 09 chûng vi khuèn tuyển Enterococcus mundtii QU2 có bân chçt là chọn đþợc xā lý ć các mĀc nhiệt độ khác nhau protein nên bð mçt hoàn toàn hoät tính kháng để kiểm tra bân chçt cûa chçt kháng khuèn này khuèn sau khi đþợc xā lí vĆi proteinase K. Tÿ có phâi là protein hay không. Thí nghiệm cho các kết quâ nghiên cĀu đã đþợc công bố kết hợp thçy chçt kháng khuèn đþợc sinh ra bći 09 vĆi kết quâ đþợc thể hiện ć hình 4 có thể kết chûng tuyển chọn trên đều bền nhiệt trong luên rìng chçt kháng khuèn đþợc sinh ra bći 08 khoâng nhiệt độ tÿ 40C đến 80C, trÿ chûng chûng vi khuèn tuyển chọn có bân chçt là NA2 bð mçt hoät tính hoàn toàn khi xā lý ć protein và có thể là bacteriocin. nhiệt độ 60C và 80C. Hoät tính kháng khuèn Nhþ vêy, trong nghiên cĀu này, 08 chûng bð mçt hoàn toàn khi xā lý dðch nuôi cçy 09 tuyển chọn sinh ra chçt kháng khuèn bền ć chûng tuyển chọn ć 100C trong 30 phút và nhiệt độ cao, bð phân giâi bći proteinase K, thể 121C trong 15 phút, trÿ chûng HP2.1 vén còn hiện hoät tính kháng khuèn vĆi Salmonella sp. 375
  7. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh bacteriocin và Escherichia coli có thể theo cĄ chế täo ra các chûng HN1 tëng khâ nëng tổng hợp bacteriocin hợp chçt tþĄng tă nhþ bacteriocin. Trong đò, gây Āc chế să phát triển cûa vi sinh vêt kiểm chûng HN1 có khâ nëng sinh bacteriocin và thể đðnh. Tuy nhiên, ć môi trþąng bổ sung NaCl hiện hoät tính kháng khuèn mänh đồng thąi vĆi còn läi thì việc bổ sung thêm NaCl chî làm câ hai chûng vi khuèn kiểm đðnh đþợc tuyển giâm hoặc không tëng hoät tính cûa chọn để thăc hiện các nghiên cĀu tiếp theo. bacteriocin. Nghiên cĀu cûa Ogunbanwo & cs. (2003) cüng cho thçy, khi bổ sung glucose, yeast 3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường extract vào môi trþąng nuôi cçy làm tëng hoät nuôi cấy đến khả năng sinh bacteriocin tính kháng khuèn cûa bacteriocin đþợc sinh ra của chủng HN1 bći chûng Lactobacillus brevis OG1; trong khi bổ sung NaCl vào môi trþąng läi làm giâm hoät Chûng vi khuèn HN1 đþợc nuối cçy trên tính kháng khuèn cûa bacteriocin này. môi trþąng MRS có thay đổi nồng độ các chçt theo tî lệ khác nhau nhìm xác đðnh điều kiện 3.5. Định danh chủng vi khuẩn nuôi cçy thích hợp nhçt cho chûng HN1 sinh Đặc điểm hình thái, tế bào là một trong tổng hợp bacteriocin. nhĂng tiêu chí quan trọng góp phæn trong việc Kết quâ thí nghiệm cho thçy thành phæn phân loäi, xác đðnh vi sinh vêt. Trong nghiên môi trþąng nuôi cçy có ânh hþćng rçt lĆn đến cĀu này, chûng HN1 cò đặc điểm hình thái hoät tính bacteriocin cûa chûng HN1 (Hình 5). khuèn läc trñn đều, bề mặt lồi, có màu tríng Hoät tính kháng vi khuèn kiểm đðnh cûa sĂa, kích thþĆc nhó (Hình 6A). Kết quâ quan sát bacteriocin sinh ra bći chûng HN1 khi nuôi đặc điểm hình thái tế bào bìng kính hiển vi trong môi trþąng MRS có bổ sung 3% glucose quang học cò độ phòng đäi 1000x cho thçy, tëng 20% đối vĆi Salmonella sp. và 50% đối vĆi chûng HN1 là vi khuèn Gram dþĄng, hình cæu Escherichia coli so vĆi khi nuôi trong môi (Hình 6B). trþąng có bổ sung 1% glucose. TþĄng tă nhþ vêy, khi nuôi trong môi trþąng có bổ sung 3% Để đðnh danh bìng phþĄng pháp sinh học yeast extract, hoät tính kháng khuèn cûa phân tā, đoän gen mã hóa vùng 16S rRNA cûa bacteriocin này tëng 50% đối vĆi Salmonella chûng HN1 đþợc khuếch đäi bìng cặp mồi cặp sp. và 16,7% đối vĆi Escherichia coli vĆi khi mồi 27F và 1492R. Kết quâ điện di cho thçy chî nuôi trong môi trþąng có bổ sung 1% yeast có 1 väch bëng DNA duy nhçt cò kích thþĆc extract. Điều này có thể giâi thích là việc bổ khoâng 1.500bp phù hợp vĆi kích thþĆc lý sung glucose và yeast extract đã cung cçp thuyết có thể đät đþợc khi nhân bìng đoän mồi nguồn acid amin cüng nhþ nguồn nitĄ để này (Hình 7). Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất kháng khuẩn được sinh ra bởi 09 chủng tuyển chọn 376
  8. Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh Hình 4. Ảnh hưởng của proteinase K đến chất kháng khuẩn được sinh ra bởi 08 chủng tuyển chọn Ghi chú: G: Glucose; Y: Yeast extract; N: NaCl Hình 5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh bacteriocin của chủng HN1 (A) (B) Hình 6. Hình thái khuẩn lạc (A), hình thái tế bào (B) của chủng HN1 377
  9. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh bacteriocin Chûng vi khuèn HN1 nìm cùng nhánh vĆi đồng thì chûng HN1 vĆi chûng Enterococcus chûng Enterococcus faecium DSM 20477 vĆi giá faecium DSM 20477 là giống nhau. Chính vì vêy, trð Bootstap là 95% (Hình 8). Kết quâ so sánh kết hợp các đặc điểm sinh học và sinh học phân tā trình tă cho thçy, chûng HN1 có mĀc độ tþĄng có thể kết luên chûng HN1 có quan hệ họ hàng đồng vĆi chûng Enterococcus faecium DSM 20477 gæn güi vĆi Enterococcus faecium và đþợc đặt tên là 99,91%. Xét về giá trð tin cêy và mĀc độ tþĄng là Enterococcus faecium HN1. HN1 Marker ĐC - 1.500bp Hình 7. Sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa vùng 16S rRNA của chủng HN1 Enterococcus saigonensis VE80 Enterococcus hirae HN1 Enterococcus faecium DSM 20477 Enterococcus villorum NBRC 100699 Enterococcus avium ATCC 14025 Enterococcus malodoratus ATCC 43197 Enterococcus plantarum CCM 7889 Enterococcus sulfureus NBRC 100680 Enterococcus camelliae NBRC 101868 Enterococcus saccharolyticus subsp. Taiwanensis 812 Hình 8. Cây phân loại chủng HN1 378
  10. Phạm Hồng Hiển, Dương Văn Hoàn, Trần Thị Đào, Phạm Thị Dung, Nguyễn Thị Thu, Phạm Thị Thu Trang, Nguyễn Xuân Cảnh Các nghiên cĀu trþĆc đò đều chî ra rìng vi khâ nëng sinh bacteriocin kháng läi câ hai khuèn Enterococcus faecium có thể sā dýng để chûng vi sinh vêt kiểm đðnh. Chûng vi khuèn bổ sung vào các chế phèm và probiotic, một số HN1 thể hiện khâ nëng sinh bacteriocin và khâ hiện đã đþợc thþĄng mäi hoá cho thçy độ an nëng kháng vi sinh vêt kiểm đðnh (Salmonella toàn và hiệu quâ. Nghiên cĀu cûa Qiao & cs. sp. và Escherichia coli) tốt nhçt đã đþợc xác (2020) về đặc điểm cûa enterocin TJUQ1, một đðnh là Enterococcus faecium HN1. Đồng thąi, loäi bacteriocin đþợc sân xuçt bći vi khuèn nghiên cĀu cüng đã xác đðnh đþợc điều kiện môi Enterococcus faecium TJUQ1 có khâ nëng trþąng nuôi cçy thích hợp để chûng kháng khuèn rộng giúp kháng läi các mæm bệnh Enterococcus faecium HN1 sinh bacteriocin tốt nhþ Staphylococcus aureus, Listeria nhçt là môi trþąng MRS lóng có bổ sung glucose monocytogenes, Escherichia coli và Salmonella và cao nçm men vĆi tî lệ 3%. enterica. Nghiên cĀu cüng chî ra rìng enterocin TJUQ1 làm tëng độ dén điện ngoäi bào, kích LỜI CẢM ƠN hoät giâi phóng các vêt liệu hçp thý tia căc tím, ATP và LDH, và thêm chí gây phân giâi các Nghiên cĀu đþợc thăc hiện dþĆi să hỗ trợ thành phæn trong các tế bào cûa Listeria kinh phí cûa đề tài cçp Học viện nông nghiệp monocytogenes CMCC 1595 cho thçy enterocin Việt Nam mã số T2021-12-20VB. TJUQ1 là một chçt bâo quân tiềm nëng cho ngành công nghiệp thăc phèm. Nghiên cĀu cûa TÀI LIỆU THAM KHẢO Sonsa & cs. (2015) về đặc điểm cûa bacteriocin Barrow G.I. & Feltham R.K.A. (1993). Cowan and sinh ra bći Enterococcus faecium CN-25 cho Steel‘s manual for the indentification of medical thçy chûng vi khuèn này sć hĂu đồng thąi câ bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity Press, gen enterocin A và B có phổ kháng khuèn cao ć Cambridge. 262. pH 2, nồng độ Āc chế tối thiểu vĆi vi khuèn Castro M.P., Palavecino N.Z., Herman C., Garro O.A. & Campos C.A. (2011). Lactic acid bacteria Listeria monocytogenes TISTR 1327 là 2,38 isolated from artisanal dry sausages: µg/ml, an toàn đối vĆi các sân phèm cá lên men. Characterization of antibacterial compounds and Hanchi & cs. (2018) đã báo cáo rìng vi khuèn study of the factors affecting bacteriocin thuộc chi Enterococcus có khâ nëng sân xuçt production. Meat Science. 87: 321-329. bacteriocin có thể sā dýng để bổ sung vào các Hanchi H., Mottawea W., Sebei K & Hammami R. (2018). The genus Enterococcus: Between sân phèm nhþ chçt bâo quân tă nhiên, chế probiotic potential and safety concerns an update. phèm sinh học, thĀc ën chën nuôi hoặc các lăa Frontiers in Microbiology. 9: 1791. chọn giúp thay thế thuốc kháng sinh. Các tác Hernandez D., Cardell E. & Zarate V. (2005). giâ này cüng đã công bố chế phèm sinh học Antimicrobial activity of lactic acid bacteria Cernivet® và FortiFlora® có chĀa Enterococcus isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a faecium SF-68. bacteriocin-like substance produced by Do vêy, chûng Enterococcus faecium HN1 Lactobacillus plantarum TF711. Journal of Applied Microbiology. 99: 77-84. trong nghiên cĀu này có tiềm nëng trong việc sân Jena P.K., Trivedi D., Chaudhary H., Sahoo T.K. & xuçt bacteriocin, cæn có thêm các nghiên cĀu sâu Seshadri S. (2013). Bacteriocin PJ4 active against hĄn để có thể bổ sung vào các chế phèm sinh học enteric pathogen produced by Lactobacillus phýc vý trong ngành nuôi trồng thuỷ sân. helveticus PJ4 isolated from gut microflora of Wistar Rat (Rattus norvegicus): partial purification and characterization of bacteriocin. Applied 4. KẾT LUẬN Biochemistry and Biotechnology. 169: 2088-2100. Kandler O. & Weiss N. (1986). Regular, non-sporing Trong nghiên cĀu này, tÿ 18 méu ruột cá gram-positive rods. In Sneath H.A., Mair N.S., đþợc thu thêp ć các đða điểm khác nhau, 16 Sharpe M.E. & Holt J.G. (Eds.). Bergey’s manual chûng vi khuèn lactic đã đþợc phân lêp đþợc. of systematic bacteriology, Williams and Wilkins, Trong đò, 09 chûng vi khuèn đþợc xác đðnh có Baltimore. pp. 1208-1234. 379
  11. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng vi khuẩn Enterococcus faecium HN1 có khả năng sinh bacteriocin Kaðkonienë V., Stankevièius M., Survilienë B. K., characterization of a bacteriocin produced by Naujokaitytë G., Ðernienë L., Mulkytë K., Lactobacillus lactis isolated from marine Malakauskas M. & Maruðka A. (2017). Current environment. Advanced Journal of Food Science state of purification, isolation and analysis of and Technology. 2(2): 138-144. bacteriocins produced by lactic acid bacteria. Rattanachaikunsopon P. & Phumkhachorn P. (2010). Applied Microbiology and Biotechnology. 101: Lactic acid bacteria: their antimicrobial compounds 1323-1335. and their uses in food production. Annals of Marwa A.S., Hamdi M.A, Ekbal M.I.A., Adham M.A. Biological Research. 1(4): 218-228. & Sobhy A.El.S. (2015). Effect of pH, heat Sahoo T.K., Jena P.K., Nagar N., Patel A.K. & treatments and proteinase K enzyme on the activity Seshadri S. (2015). In vitro evaluation of probiotic of Lactobacillus acidophilus bacteriocin. Benha properties of lactic acid bacteria from the gut of Veterinary Medical Journal. 28(1): 210-215. Labeo rohita and Catla catla. Probiotics and Masoomi A.F., Jabbari L., Khayam N.R. & Aalami A. Antimicrobial Proteins. 7(2): 126-136. (2016). A simple and rapid system for DNA and Sahoo T.K., Jena P.K., Patel A.K. & Seshadri S. RNA isolation from diverse plants using handmade (2014). Bacteriocins and their applications for the kit. Protocol Exchange. treatment of bacterial diseases in aquaculture: a Mohanty B.R. & Sahoo P.K. (2007). Edwardsiellosis in review. Aquaculture Research. 47(4): 1013-1027. fish: A brief review. Journal of Biosciences. Sonsa A.N., Rodthong S., Chikindas M.L. & 32: 1331-1344. Yongsawatdigul J. (2015). Characterization of Nguyễn Văn Thành & Nguyễn Ngọc Trai (2012). Phân bacteriocin produced by Enterococcus faecium lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp. Có CN-25 isolated from traditionally Thai fermented khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và fish roe, Food Control. 54: 308-316. đốm đỏ trên cá tra. Tạp chí khoa học, Trường Đại Tổng cục thống kê (2021). Thông cáo báo chí về tình học Cần Thơ. 23a: 224-234. hình kinh tế - xã hội quý II và 6 tháng đầu năm Noga E.J. (2010). Fish Disease: Diagnosis and 2021. Truy cập từ https://www.gso.gov.vn/du-lieu- Treatment, Second Edition. Wiley-Blackwell: va-so-lieu-thong-ke/2021/06/thong-cao-bao-chi- Ames, IA. pp. 13-48, 143-147, 375-420. ve-tinh-hinh-kinh-te-xa-hoi-quy-ii-va-6-thang-dau- nam-2021 ngày 04/08/2021. Nwafor O.E. (2014). Isolation and identification of lactic acid bacterial (LAB) from yoghurt and Toranzo A.E., Magarinos B. & Romalde J.L. (2005). A antibacterial activity against some clinical isolates. review of the main bacterial fish diseases in International Journal of Food Nutrition and Safety. mariculture systems. Aquaculture. 246: 37-61. 5(1): 31-38. Wakil S.M. & Osamwonyi U.O. (2012). Isolation and Ogunbanwo S.T., Sanni A.I. & Onilude A.A. (2003). screening of antimicro-bial producing lactic acid Influence of cultureal conditions on the production bacteria from fermenting millet gruel. International of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1. Research Journal of Microbiology. 3(2): 72-79. African Journal of Biotechnology. 2(7): 179-184. Yang J.M. & Moon G.S. (2021). Partial Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thị Hồng Phấn & Trần Anh characterization of an anti-listerial bacteriocin from Thư (2018). Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh Enterococcus faecium CJNU 2524. Food Science bacteriocin kháng Vibrio parahaemolyticus gây of Animal Resources. 41(1): 164-171. bệnh trên tôm. Tạp chí Khoa học công nghệ và Zacharof M.P. & Lovitt R.W. (2012). Bacteriocins Thực phẩm. 15(1): 46-56. produced by lactic acid bacteria: A review article. Qiao X., Du R., Wang Y., Han Y. & Zhou Z. (2020). APCBEE Procedia. 2: 50-56. Purification, characterization and mode of action of Zendo T., Eungruttanagorn N., Fujioka S., Tashiro Y., enterocin, a novel bacteriocin produced by Nomura K., Sera Y., Kobayashi G., Nakayama J., Enterococcus faecium TJUQ1. International Journal Ishizaki A. & Sonomoto K. (2005). Identification of Biological Macromolecules. 14(1): 151-159. and production of a bacteriocin from Enterococcus Rajaram G., Manivasagan P., Thilagavathi B. & mundtii QU 2 isolated from soybean. Journal of Saravanakumar A. (2010). Purification and Applied Microbiology. 99: 1181-1190. 380
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng