1. Trang Chủ
  2. Ngư nghiệp
  3. Nghiên cứu vi khuẩn không thuộc nhóm vibrio có khả năng kết hợp với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan

Nghiên cứu vi khuẩn không thuộc nhóm vibrio có khả năng kết hợp với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan

Bài viết trình bày việc lựa chọn Delftiaacidovorans (NCCB 28024) làm chủng tham khảo (RDA) được mua từ Viện CBS của Hà Lan để so sánh với 2 phân lập Delftia giả định (Sh2-4 và So1-40) được sàn lọc từ các trại nuôi tôm ở Thái Lan bằng nuôi cấy và phân tích PCR. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II NGHIÊN CỨU VI KHUẨN KHÔNG THUỘC NHÓM Vibrio CÓ KHẢ NĂNG KẾT HỢP VỚI Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ở THÁI LAN Trương Hồng Việt1*, Ajaree Nilawongse2, Kall

Thể loại Tài liệu miễn phí Ngư nghiệp

Số trang 17

Ngày tạo 12/29/2020 11:50:08 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.92 M

Tên tệp

Tải Nghiên cứu vi khuẩn không thuộc nhóm vibrio có khả... (.pdf)

Xem mẫu

  1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II NGHIÊN CỨU VI KHUẨN KHÔNG THUỘC NHÓM Vibrio CÓ KHẢ NĂNG KẾT HỢP VỚI Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ở THÁI LAN Trương Hồng Việt1*, Ajaree Nilawongse2, Kallaya Sritunyalucksana2, Timothy W. Flegel3, Siripong Thitamadee2,3 TÓM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease: AHPND) ở tôm nuôi nước lợ đã được báo cáo ở Thái Lan từ năm 2012. Phân tích đoạn trình tự của gen 16S rRNA thu được từ các mẫu tôm bình thường và tôm bệnh cho thấy có sự hiện diện một số vi khuẩn khác nhóm Vibrio, bao gồm Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp., Acidovorax sp., Sphingomonas sp., Lei- fsonia sp., và Rhodococcus sp. ở ao tôm bị AHPND nhiều hơn so với ao tôm bình thường. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn Delftiaacidovorans (NCCB 28024) làm chủng tham khảo (RDA) được mua từ Viện CBS của Hà Lan để so sánh với 2 phân lập Delftia giả định (Sh2-4 và So1-40) được sàn lọc từ các trại nuôi tôm ở Thái Lan bằng nuôi cấy và phân tích PCR. Kết quả phân tích trình tự một phần đoạn gen 16S rRNA cho thấy có sự tương đồng cao giữa phân lập Sh2-4 và RDA (92,6%), điều này cho thấy rằng phân lập này có thể là loài Delftia mới. Ngược lại, So1-40 chỉ có tỷ lệ tương đồng 78,9%, có thể là một chủng khác. Đối với cảm nhiễm kết hợp, tôm được tiêm Sh2-4 với mật độ 103 CFU/3g tôm được theo dõi 7 ngày, sau đó được ngâm với Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) ở mật độ 104 CFU/ml (thấp hơn 10 lần so với LC50=105 CFU/ml). Kết quả cho thấy phân lập này có thể nhiễm cộng hợp với VPAHPND nhưng gây ra dấu hiệu mô bệnh học khác với AHPND (với biểu hiện bong tróc hàng loạt của các tế bào biểu mô của ống gan tụy). Các dấu hiệu này bao gồm các tế bào biểu mô của ống gan tụy bị tan vỡ, hình thành các không bào trong tế bào E của ống gan tụy và không bào trong tế bào kẻ của cơ quan lymphô, và có sự hiện diện của các thể vùi bắt màu eosin trong tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu. Từ khóa: 16S rRNA, AHPND, EMS, Delftiaacidovorans, Vibrio parahaemolyticus I. ĐẶT VẤN ĐỀ Thái Lan bao gồm các tỉnh Chonburi, Rayong, Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) ở tôm Chantaburi, và Trad vào cuối năm 2011. Tuy nuôi đã được tìm thấy lần đầu tiên ở miền Nam nhiên, dịch bệnh này được báo cáo chính thức Trung Quốc (NACA-FAO, 2011) vào năm vào đầu năm 2012 bao gồm cả hai tỉnh miền 2009. Sau đó, các trường hợp tương tự được Nam (Surattani và Songkhla) (FAO, 2013). báo cáo ở Việt Nam năm 2010 (Mooney, 2012), Các dấu hiệu chung của tôm bị AHPND Malaysia năm 2011 (Lightner & ctv., 2012), và bao gồm vỏ bị mềm, gan tụy bị teo và mất sắc tố ở Thái Lan năm 2012 (Flegel, 2012), (Leaño (FAO, 2013). Ở mức độ mô bệnh học, gan tụy và Mohan, 2012). Tại Thái Lan, EMS/AHPND có biểu hiện bong tróc hàng loạt của các tế bào xảy ra đầu tiên ở các trại nuôi tôm ở miền Đông biểu mô của ống gan như là tế bào bài tiết (tế 1 Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 2 Khoa Công Nghệ Sinh học - Đại học Mahidol - Thái Lan 3 Centex Shrimp - Đại học Mahidol - Thái Lan * Email: truonghongviet@yahoo.com 26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bào B), tế bào sợi (tế bào F), tế bào hấp thụ và II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP dự trữ (tế bào R), và tế bào phôi hay tế bào mầm 2.1. Chuẩn bị vi khuẩn (tế bào E) (www.enaca.org). Mặc dù chủng phân Chủng tham khảo Delftia acidovorans lập duy nhất Vibrio parahaemolyticus được (RDA) được cấy ria trên môi trường TSA xác định là tác nhân chính của EMS/AHPND (tryptic soy agar) được bổ sung 0,5% NaCl, ủ (Tran & ctv., 2013)first reported in 2009, was ở 30oC, trong 18-20 giờ. Một khuẩn lạc đơn initially named early mortality syndrome (EMS, được chọn để tăng sinh trong 5 ml môi trường tuy nhiên kết quả phân tích trình tự 16S rRNA TSB (tryptic soy broth) có bổ sung 0,5% NaCl, chỉ ra rằng nhiều chủng vi khuẩn khác như ủ 30oC, lắc 230 rpm trong 18 giờ. Dịch vi là Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp., khuẩn được giữ trong 15% glycerol ở nhiệt độ Acidovorax sp., Sphingomonas sp., Leifsonia -80oC đến khi sử dụng. Đối với chủng Vibrio sp., và Rhodococcus sp. hiện diện trong các parahaemolyticuscũng được nuôi cấy tương tự. mẫu tôm bệnh EMS cao hơn trong các mẫu tôm Tuy nhiên, môi trường TSA và TSB được bổ bình thường (Prachumwat và ctv., 2012)then sung 1,5% NaCl. Vietnam since 2010 and more recently in 2011 to the eastern coast of Malaysia and the eastern 2.2. Tách chiết ADN vi khuẩn coast of the gulf of Thailand. So far no potential Quy trình tách chiết ADN bằng phương causative pathogen has been found and possible pháp phenol-chloroform (Sambrook và ctv., etiologies include toxins (biotic or abiotic. Điều 1989) đối với dịch nuôi cấy vi khuẩn hoặc gan này có thể gợi ý rằng chúng cũng có thể liên tụy tôm. Dịch vi khuẩn được ly tâm 12.000 rpm quan đến EMS. trong 10 phút để thu hạt vi khuẩn. Các hạt vi Bởi vì Delftia sp. chiếm tỷ lệ tương đối khuẩn được tái huyền phù trong 1000 μl đệm cao khi được so sánh với các vi khuẩn khác tách chiết ADN (pH = 8,0) có chứa 10 μl enzym (Prachumwat và ctv., 2012)then Vietnam since proteinase K. Đối với mẫu gan tụy được cố định 2010 and more recently in 2011 to the eastern trong dung dịch RNA-later trước khi chuyển coast of Malaysia and the eastern coast of the sang đệm tách chiết ADN. Hỗn hợp huyền phù gulf of Thailand. So far no potential causative được ủ ở 56oC trong 1 giờ. Sau đó phenol được pathogen has been found and possible thêm vào (1:1) và tiếp tục ủ 56oC trong 1 giờ etiologies include toxins (biotic or abiotic, trước khi ly tâm ở 12.000 rpm trong 15 phút. một chủng chuẩn Delftia acidovorans (NCCB Thu nhận dịch nổi và thêm Chloroform (1:1) 28024) được mua từ Viện CBS của Hà Lan làm vào. Hỗn hợp được trộn đều và ly tâm 12.000 chủng tham khảo (RDA) để nghiên cứu đặc rpm trong 15 phút. Dịch nổi được thu nhận và tính sâu hơn. Kết quả sơ bộ từ gây nhiễm thực tiến hành kết tủa ADN bằng isopropanol lạnh nghiệm bằng phương pháp tiêm vào cơ bụng (1:1). Hỗn hợp được làm lạnh ở -20oC trong 20 của Penaeus vannamei đã chỉ ra rằng RDA có phút trước khi ly tâm 12.000 rpm ở 4oC trong thể gây ra những thay đổi mô bệnh học ở tôm 15 phút. Hạt ADN được rửa với ethanol 75% và thí nghiệm bao gồm sự tan vỡ các tế bào biểu để khô ở nhiệt độ phòng trước khi tái huyền phù mô của ống gan tụy, sự xuất hiện các không trong 30 μl đệm TE (pH = 8,0). Nồng độ ADN bào trong tế bào E của ống gan và không bào được xác định nồng độ bằng máy quang phổ ở trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô, và bước sóng 260 nm. Dung dịch ADN được bảo có sự hiện diện của các thể vùi bắt màu eosin quản -20oC đến khi sử dụng. trong tế bào chất của các tế bào thuộc mô 2.3. Khuyếch đại ADN bằng PCR tạo máu. Tuy nhiên, chưa có chủng phân lập Các mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) (Bảng 1) Delftia đã từng được phân lập từ các trại tôm cho phân tích PCR được thiết kế để khuyếch đại ở Thái Lan mà có dịch bệnh EMS hay AHPND. ADN của chủng RDA (F1 và R1) và mồi dùng Vì vậy, nghiên cứu nhóm vi khuẩn mới này có để xây dựng cây phát sinh loài (F6 và R6) dựa ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các tác vào trình tự đoạn gene 16S rRNA của Delftia từ nhân góp phần gây bệnh EMS. ngân hàng gene (NCBI). Dựa vào trình tự IGS TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 27
  3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II (intergenic spacer) để thiết kế các mồi bao gồm khuyếch đại để so sánh phân loại (F3 và R3); và khuyếch đại ADN để sàng lọc các loài Delftia khuyếch đại ADN đặc hiệu cho RDA (F4 và R4) giả định thu được từ các trại tôm (F2 và R2); và Delftia giả định (Sh2-4) (F5 và R5). Bảng 1: Các cặp mồi dùng để khuyếch đại Mồi Trình tự (5’---3’) Kích thước F1 Random primer (oligohexamer) 1000 bp R1 CCG AGG CAT TAC TCA CCC G F2 CTT GCG AGA TTT CGC CGT TT 347 bp R2 GGA GGG AGC GAA AAG AGC AT F3 CTC TTT CCG TCA GCA ACG CTG ATT 515 bp (RDA) R3 AGT CGT AAC AAG GTA GCC GTA TCG 598 bp (Sh2-4) F4 CTT GCG AGA TTT CGC CGT TTC 373 bp R4 TGG TGG CAG CAG CTT GAA AA F5 CAG ACG CTC AAC AAC TTG AG 360 bp R5 ATG AGC AAG GTC CAC AAA CG F6 CAC GAC TAC CAG GGT ATC TA 756 bp R6 GCC TAA ACA CAT GCA AGT CG 2.4. Phân lập loài Delftia từ tôm và mẫu - Chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm gây môi trường nhiễm Để sàng lọc Delftia sp. giả định từ các trại Vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria tôm, môi trường TSA không chứa NaCl được trên TSA+0,5% NaCl, ủ 30oC trong 24 giờ. sử dụng, bởi vì môi trường này thích hợp cho Một khuẩn lạc đơn được tăng sinh trong 2 ml sự tăng trường của RDA nhưng ức chế sự tăng TSB+0,5% NaCl, ủ 30oC, lắc 230 rpm trong 1 trưởng của Vibrio parahaemolyticus. Mẫu tôm giờ. Sau đó chuyển tất cả dịch nuôi cấy vào 50 và mẫu môi trường từ 2 tỉnh Samutsakorn và ml TSB+0,5% NaCl mới, ủ cùng điều kiện trên. Trad (3 mẫu tôm EMS, 2 mẫu cặn, và 2 mẫu Kiểm tra OD ở bước sóng 600nm bằng máy đất) được cấy ria trực tiếp trên môi trường TSA quang phổ cho đến khi đạt OD600nm = 0,65 (2,01 không chứa NaCl. Đĩa cấy được ủ ở 30oC trong x 108 CFU/ml) đối với RDA và OD600nm = 0,7 vòng 24-48 giờ. Các khuẩn lạc đơn được chọn (2,02 x 108 CFU/ml) đối với 5HP. và cấy tăng sinh trong TSB, rồi được giữ trong - Xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) glycerol 15% và bảo quản -80oC cho thí nghiệm của V. parahaemolyticus sâu hơn. Thí nghiệm được thực hiện như mô tả bởi 2.5. Thí nghiệm sinh học Joshi và ctv., 2014. Gây nhiễm bằng cách ngâm - Chuẩn bị tôm với các nồng độ vi khuẩn khác nhau bao gồm Tôm thẻ SPF (specific-pathogen free) sạch 103, 104, 105, và 106 CFU/ml trong 15 lít nước bệnh có trọng lượng 2-3g được mua từ trại biển nhân tạo có độ mặn 20 ppt. Mỗi mật độ giống và được nuôi thuần trong bể nhựa chứa vi khuẩn được lặp lại 2 lần với 10 tôm/bể. Hai nước biển nhân tạo 20 ppt (Marinium) và có sục bể nhóm đối chứng được ngâm với 150 ml khí từ 3-5 ngày. TSB+1,5% NaCl vô trùng. Tôm sắp chết được 28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ghi nhận và cố định trong dung dịch Davidson chết được cố định trong 24 giờ bằng dung dịch để phân tích mô bệnh học. Davidson (Cồn 95%: 330 ml; Formalin 100%: - Thí nghiệm gây nhiễm đơn và gây 220 ml; axit acetic 115 ml; và nước cất: 335 ml), nhiễm kết hợp rồi chuyển qua cồn 70% để bảo quản lâu hơn. Mô tôm được khử nước, đúc vào khối paraffin, * Thí nghiệm gây nhiễm đơn được chia làm được cắt thành miếng mỏng 5 μm, và được 2 nhóm. Nhóm 1 được tiêm với 100 μl RDA với nhuộm với hematoxylin và eosin. nồng độ 103 CFU/3g tôm. Nhóm 2 được tiêm với 100 μl PBS làm nhóm đối chứng. Thí nghiệm 2.6. Phân tích thống kê được thực hiện với 3 lần lặp lại và mỗi bể chứa Số liệu các thí nghiệm được phân tích thống 10 con tôm. Tôm sắp chết được cố định trong kê bằng phần mềm SPSS 20.0. Thống kê được dung dịch Davidson để phân tích mô bệnh học. thực hiện bao gồm phân tích ANOVA để tìm sự khác nhau về tỷ lệ chết giữa các nồng độ vi khuẩn * Thí nghiệm gây nhiễm kết hợp được chia theo thời gian thí nghiệm và xây dựng phương làm 2 nhóm. Nhóm 1 được tiêm với 0,1 ml PBS trình hồi quy tuyến tính để xác định LC50. làm đối chứng âm; nhóm 2 được tiêm 0,1 ml Delftia giả định (Sh2-4) với nồng độ 103 CFU/3g III. KẾT QUẢ tôm. Sau khi tiêm, tôm được nuôi trong 7 ngày 3.1. Kết quả gây nhiễm Delftia acidovo- trước khi gây nhiễm ngâm V. parahaemolyticus rans (RDA) (5HP) với mật độ 104 CFU/ml. Mỗi bể chứa 10 Để xác định xem Delftia acidovorans tôm trong 15 lít nước biển nhân tạo có độ mặn 20 (NCCB 28024) có thể gây chết tôm hay không, ppt. Mỗi nhóm thí nghiệm được lặp lại 2 bể. Tôm vi khuẩn này được tiêm vào tôm thẻ với nồng hấp hối sắp chết được vớt ra và cố định trong độ 103 CFU/3g tôm. Kết quả thí nghiệm chỉ ra dung dịch Davidson để phân tích mô bệnh học. rằng tôm bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm và đạt - Phương pháp mô học đến tỷ lệ chết tích lũy 100% sau 12 ngày, trong Quy trình được dựa theo phướng pháp khi nghiệm thức đối chứng chỉ có tỷ lệ chết 10% của Bell & Lightner (1998). Tôm hấp hối sắp (Hình 1). Hình 1. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của tôm sau gây nhiễm với D. acidovorans - Kết quả phân tích mô học Gan tụy của tôm hấp hối sắp chết cho thấy do nhiễm khuẩn, và xuất hiện nhiều không bào rằng không có dấu hiệu điển hình của bệnh hoại trong tế bào E (hình 2A, B, và C). Ngược lại, tử gan tụy cấp (AHPND) như là sự bong tróc gan tụy của tôm đối chứng có biểu hiện bình các tế bào biểu mô của ống gan. Thay vào đó, thường (Hình 2D). Nhìn chung, kết quả chỉ ra các tế bào biểu mô của ống gan có biểu hiện rằng D. acidovorans có thể gây chết tôm và thay bị tan vỡ, xuất hiện nhiều u hạt trong ống gan đổi cấu trúc mô bệnh học. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 29
  5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 2. Vi ảnh của mô gan tôm bị tiêm D. acidovorans. Các biểu mô bị tan vỡ (A), hình thành nhiều u hạt (B), nhiều không bào trong tế bào E (C), gan bình thường của tôm đối chứng (D). Các mũi tên chỉ dấu hiệu mô bệnh học. Hình A (độ phóng đại 10X), hình B, C, và D (độ phóng đại 20X). 3.2. Dòng hoá đoạn trình tự của gen 16S 16S). Kích thước sản phẩm thu được khoảng rRNA và vùng IGS của Delftia acidovorans 1.000 bp (Hình 3A). Đoạn DNA thu được Để phát triển phương pháp phát hiện D. làm đối tượng để dòng hoá bằng cách nối vào acidovorans dựa vào PCR, các cặp mồi F1 và vector pGEM-T và được chuyển vào chủng E. R1 (Bảng 1) được thiết kế để phát hiện đặc coli (DH5α). Ba dòng được thu nhận và khẳng hiệu dựa vào trình tự của gen 16S rRNA và định lại bằng PCR với các mồi T7 và SP6 của vùng IGS (đoạn trình tự nằm giữa gen 23S và vector (Hình 3B). Hình 3. Kết quả điện di trên gel agarose của các sản phẩm PCR. (giếng 1) kích thước sản phẩm 1.000 bp; (giếng 2) đối chứng âm; (giếng 3, 4, và 5) sản phẩm PCR sau khi được dòng hoá 1.100 bp. Giếng M là thang chỉ thị phân tử. - Phân tích trình tự sự tương đồng với đoạn trình tự chứa một phần Ba dòng có chứa đoạn ADN với kích thước trình tự của gen 23S, vùng trình tự IGS, và một khoảng 1100 bp được gửi đến công ty Macrogen phần gen 16S rRNA của Delftia acidovorans (Hàn Quốc) để giải trình tự. Kết quả giải trình SPH-1 (CP000884.1) và Delftia sp. Cs1-4 tự thu được 1 đoạn trình tự có kích thước 945 (CP002735.1) với độ tương đồng 99%, độ phủ bp. Khi so sánh trình tự với ngân hàng gen đoạn trình tự 98%, và giá trị kỳ vọng E=0,0 (GenBank) bằng Blastn, kết quả chỉ ra rằng có (Hình 4 và 5). 30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCCAAGGCATCCACCACATGCTCTTAGTC 53 ACTTGACCCTATAACTTTGATCTCTCTTGCGAGATTTCGCCGTTTTCTTTCAA 106 GGACTTGCGAGGTCTCTCACCTCGCGCGTTATGCCGTAATGTGAATGAATTCT 159 TTGACATTTCTGCCAAGAGAACAATTCGTCATTACTTGAATAAAACAAAGTTT 212 CATTCGTTTTGACGCAATCAAAATGTTGCTGACGGCACGGTGAGATTGAAATC 265 TCTTTCCGTCAGCAACGCTGATTTCGACTCTATGAATTTTTAAAGAACAGCCG 318 ATTGATGGTTAGATAACTATCAACACTAAAGCAGTCTCACACGAGACTGCTTT 371 AGTGTTGAGTCAAATATTATAGCACGCTTTTTTCATGCTCTTTTCGCTCCCTC 424 CAGCCGCTTTTTCAAGCTGCTGCCACCAGCGCGATCTTGGTGGAGGATGACGG 477 GATCGAACCGACGACCCCCTGCTTGCAAAGCAGGTGCTCTCCCAGCTGAGCTA 530 ATCCCCCGGGATCCTCGACAACCAGATATTGGAATCTTGGTGGGTCTAGTTGG 583 GCTCGAACCAACGACCCCCGCCTTATCAAGACGGTGCTCTAACCAGCTGAGCT 636 ACAGACCCAGTCCACCCACCCTGCAACCAGGGCACATGGCTTGTTCCAACAAC 689 CGATAAGTGTGGGCGTTCAACTTGAACAGCAGTTTTCCAGAAAGGAGGTGATC 742 CAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACGAA 795 CCCCGCCGTGGTAAGCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTACCTACTTCTGGCGAGA 848 CCCGCTCCCATGGTGTGACGGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGGAACGTATTC 901 ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCAT 945 Hình 4. Trình tự 945 bp thu được từ PCR của D. acidovorans bao gồm một phần trình tự của gen 23S (1 gạch dưới), vùng IGS (không gạch dưới), và một phần trình tự của gen 16S (2 gạch dưới). Hình 5. Kết quả Blastn của đoạn trình tự 945 bp trên GenBank 3.3. Các mồi phát hiện đặc hiệu cho thiết kế mồi phát hiện đặc hiệu cho Delftia (F2 Delftia acidovorans và R2) (Bảng 1) bằng PCR. Kết quả cho thấy Kết quả Blastn của đoạn trình tự ở vị trí 350 rằng sản phẩm PCR với kích thước 347 bp được đến 450 nucleotide chỉ ra khác biệt với các loài phát hiện đặc hiệu với D. acidovorans (Hình 6). vi khuẩn khác (Hình 5). Dựa vào vùng này để TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 31
  7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 6. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose. Ảnh trên, Đối chứng âm (giếng 1), Sản phẩm khếch đại DNA bộ gen của D. acidovorans(giếng 2), Leifsonia sp. (3), Rhodococcus sp.(4), Shewanella sp. (5), V. parahaemolyticus (VPAHPND) (6) và Ralstonia sp. (lane7). Ảnh dưới chỉ kết quả PCR của đối chứng nội tại của gen 16S rRNA của vi khuẩn với mồi chung (40F và 802R). Giếng M là thang chỉ thị phân tử. 3.4. Tối ưu môi trường nuôi cấy để sàn môi trường chọn lọc lần lượt để sàn lọc các vi lọc Delftia sp ở trại tôm Thái Lan khuẩn đường ruột và các vi khuẩn Pseudomonas. - Môi trường MacConkey (MAC) và môi Vì vậy, hai môi trường này được sử dụng để sàn trường phân lập Pseudomonas (PIA) lọc Deftia sp. từ trại tôm. Tuy nhiên, kết quả D. acidovorans được cho là quan hệ gần chỉ ra rằng V. parahaemolyticus có thể mọc cả 2 với nhóm Pseudomonas và có tên trước đây là môi trường, trong khi D. acidovorans không thể Pseudomonas acidovorans hoặc Comamonas mọc (Hình 7). acidovorans (Jong, 1926). MAC và PIA là các Hình 7. Sự phát triển của V. parahaemolyticus (5HP) và D. acidovorans (NCCB 28024) được nuôi cấy ở 30oC trong 24 giờ trên MAC (A) hoặc PIA (B). - Môi trường TSA không chứa NaCl của V. parahaemolyticus bị ức chế (Hình 8A). Môi trường TSA không chứa NaCl rõ ràng Ngược lại, TSA bổ sung 1,5% NaCl ức chế sự thúc đẩy sự phát triển của D. acidovorans sau phát triển của Delftia khi so sánh với sự phát 24 giờ nuôi cấy ở 30oC trong khi sự phát triển triển của V. parahaemolyticus (Hình 8B). 32 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 8. Sự phát triển của V. parahaemolyticus (chủng 5HP) và D.acidovorans (NCCB 28024) nuôi cấy ở 30oC trong 24 giờ. (A) TSA không chứa NaCl, (B) TSA bổ sung 1,5% NaCl. 3.5. Phân lập Delftia sp. từ ao tôm bị PCR bao gồm 1 chủng phân lập từ mẫu đất (So1- EMS ở Thái Lan 40), một chủng phân lập từ mẫu cặn (Se1-91), Môi trường TSA không chứa NaCl được và một chủng phân lập từ tôm (Sh2-4) (Hình 9). dùng để sàn lọc Delftia sp. từ các mẫu thu được Chủng phân lập Se1-91 bị loại khỏi nghiên cứu ở trại tôm bị EMS. Các chủng phân lập được bởi vì khuẩn lạc có màu xanh trên môi trường sàn lọc bằng PCR với mồi đặc hiệu cho Delftia chứa X-gal thay vì màu vàng như Delftia. (F2 và R2). Những dòng cho kết quả dương tính Hình 9. Sàn lọc các Delftia sp. giả định dựa vào PCR từ mẫu tôm và môi trường thu được từ các trại tôm. Đối chứng (-) (giếng 1), D. acidovorans(+) (2), Sh2-4 (+) (3), Se1-46 (-) (4), So1-87 (-) (5), Se1-91 (+) (6), So2-108 (-) (7), và So1-40 (+) (8). Chỉ thị phân tử (M). 3.6. Xác định 2 chủng phân lập So1-40 và 756 bp. trong khi đoạn khuyếch đại của So1-40 Sh2-4 bằng trình tự gen 16S rRNA là 770 bp. (Hình 10, 11, và 12). So sánh trên Để thực hiện phân loại đối với 2 chủng phân NCBI bằng Blastn chỉ ra rằng RDA tương đồng lập So1-40 và Sh2-4, đoạn gen 16S rRNA được 99% với chủng D. acidovorans B201, Sh2-4 thì khuyếch đại bằng PCR và được gửi giải trình tự tương đồng 99% với vi khuẩn không nuôi cấy với mồi (F6 và R6) (Bảng 1). Chủng RDA được cD0267 (AJ617899.1), và So1-40 tương đồng dùng như là đối chứng. Các đoạn khuyếch đại 99% với Bacillus (KU921070.1). thu được từ RDA và Sh2-4 có cùng kích thước TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 33
  9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 10. Đoạn gen 16S rRNA của RDA (756 bp). Các mồi giải trình tự (gạch dưới) Hình 11. Đoạn gen 16S rRNA của Sh2-4 (756 bp). Các mồi giải trình tự (gạch dưới) Hình 12. Đoạn gen 16S rRNA của So1-40 (770 bp). Các mồi giải trình tự (gạch dưới) So sánh đoạn trình tự 16S giữa RDA và Sh2-4 hoặc So1-40 bằng cách sắp thẳng hàng các trình tự bởi phần mềm CLUSTAL 2.1. Kết quả chỉ ra rằng điểm số sắp thẳng hàng lần lượt là 92,6% và 78,9% (Hình ảnh sắp thẳng hàng của 2 trình tự không trình bày). Điều này gợi ý rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia mới. - Xây dựng cây phân loài dựa vào trình giữa nhánh Delftia và Ralstonia. Kết quả này gợi tự gen 16S rRNA ý rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia thuộc họ Cây phân loài được xây dựng từ các trình tự Comamonadaceae, bộ Burkhodariales với chỉ đoạn gen 16S rRNA thu được của RDA, Sh2-4, số bootstrap 86%. Ngược lại, So1-40 nằm cùng và So1-40 bằng phần mềm MEGA 6.06. Kết quả nhánh với họ Bacillaceae với chỉ số bootstrap cho thấy rằng RDA là thành viên của nhánh các 100% (Hình 13). Vì vậy, So1-40 không được loài Delftia được biết bao gồm D. acidovorans. tiếp tục nghiên cứu sâu hơn. Tuy nhiên, chủng phân lập Sh2-4 nằm ở vị trí 34 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 13. Cây phân loài của các loài vi khuẩn dựa và trình tự 16S rRNA. RDA ở trong nhánh của các loài Delftia, trong khi Sh2-4 rơi vào giữa nhánh Delftia và Ralstonia. Chủng So1-40 ở trong nhánh các loài Bacillus. Các số tại các nốt nhánh thể hiện tỷ lệ phần trăm của chỉ số bootstrap. Chiều dài thước (bên dưới cây phân loại) biểu thị số khác biệt nucleotide. 3.7. Thiết kế mồi đặc hiệu riêng biệt cho tự có độ dài 515 bp đối với RDA (Hình 14) và 598 RDA và Sh2-4 dựa vào vùng IGS bp đối với Sh2-4 (Hình 15). Hai trình tự này được Để kiểm tra vùng IGS có thể dùng để phân dùng để thiết kế mồi đặc hiệu để phát hiện riêng loại giữa các chủng riêng biệt hay không, các trình biệt cho RDA với cặp mồi F4 & R4 (Bảng 1) cho tự cả đoạn IGS của RDA và Sh2-4 được khếch đại kích thước sản phẩm 373 bp (Hình 16) và Sh2-4 bằng PCR với cặp mồi F3 và R3 (Bảng 1). Kết quả với cặp mồi F5 & R5 (Bảng 1) cho kích thước sản giải trình tự của sản phẩm PCR thu được các trình phẩm 360 bp. (Hình 17). CTCTTTCCGTCAGCAACGCTGATTTCGACTCTATGAATTTTTAAAGAACAGCCGATTGATAGTTAGATAACTATCAACACTAAAG CAGTCTCACACGAGACTGCTTTAGTGTTGAGTCAAATATTATAGCACGCTTTTTTCGTGCTCTTTTCGCTTCCTCCAGCTGCTTTTTC AAGCTGCTGCCACCAGCGCGATCTTGGTGGAGGATGACGGGATCGAACCGACGACCCCCTGCTTGCAAAGCAGGTGCTCTCCCAGCTG AGCTAATCCCCCGGGATCCTCGACAACCAGATATTGGAATCTTGGTGGGTCTAGTTGGGCTCGAACCAACGACCCCCGCCTTATCAAG ACGGTGCTCTAACCAGCTGAGCTACAGACCCAGTCCACCCACCCTGCAACCAGGGCACATGGCTTGTTCCAACAACCGATAAGTGTGG GCGTTCAACTTGAACAGCAGTTTTCCAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACT Hình 14. Trình tự đoạn khuyếch đại của vùng IGS của RDA (515 bp.). Đoạn trình tự được gạch dưới là trình tự mồi cho cả PCR và giải trình tự. Hình 15. Trình tự đoạn khuyếch đại của vùng IGS của Sh2-4 (598 bp.). Đoạn trình tự được gạch dưới là trình tự mồi cho cả PCR và giải trình tự. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 35
  11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 16. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose. Đối chứng âm (giếng 1), Sản phẩm khuyếch đại ADN bộ gen của Sh2-4 (2), RDA(3), So1-40 (4), V. parahaemolyticus gây AHPND (5), Leifsonia sp. (6), Rhodococcus sp.(7), Ralstonia sp. (8), và Shewanella sp. (9). Giếng M là thang chỉ thị phân tử. Kích thước sản phẩm 373 bp Hình 17. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn được điện di trên gel agarose. Đối chứng âm (giếng 1), Sản phẩm khuyếch đại ADN bộ gen của Sh2-4 (2), RDA(3), So1-40 (4), V. parahaemolyticus gây AHPND (5), Leifsonia sp. (6), Rhodococcus sp. (7), Ralstonia sp. (8), và Shewanella sp. (9). Giếng M là thang chỉ thị phân tử. Kích thước sản phẩm 360 bp. 3.8. Xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) của Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) LC50 của VPAHPND được xác định trước khi thực hiện gây nhiễm kết hợp vớ Sh2-4 trong nghiên cứu này. Kết quả chỉ ra rằng thời gian chết của tôm thí nghiệm ở 48 giờ có khác biệt ý nghĩa thống kê (P
  12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 19. Mô bệnh học của nghiệm thức ngâm 105 CFU/ml5HP. Sự bong tróc của các tế bào biểu mô của ống gan được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10X (A) và 40X (B). 3.9. Gây nhiễm kết hợp giữa VPAHPND và lũy đạt đến 100% ở ngày thứ 2 sau khi kết hợp. Sh2-4 Không có tôm bị chết ở nhóm đối chứng. Ngược Thí nghiệm này được thực hiện bằng cách lại, tôm ở nhóm đối chứng dương chỉ ngâm tiêm Sh2-4 với nồng độ 103 CFU/3g tôm. Tôm 5HP, tôm bị chết 100% sau 5 ngày thí nghiệm được giữ trong 7 ngày trước khi được ngâm với (Hình 20). Kết quả này có thể suy ra rằng Sh2- 104 CFU/ml VPAHPND (5HP). Đây là nồng thấp 4 có khả năng nhiễm cộng hợp với 5HP. Thời hơn LC50 để xác định xem vi khuẩn kết hợp có gian gây chết 50% (LT50) của nhóm kết hợp giữa khả năng nhiễm cộng hợp với 5HP hay không. Sh2-4 và 5HP là 1 ngày, trong khi LT50 của 5HP Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng tỷ lệ chết tích là 4 ngày. Hình 20. Thời gian chết trung bình của tôm sau khi gây nhiễm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP. - Kiểm tra mô học của tôm hấp hối sắp hiện trong tất cả các nhóm thí nghiệm, bao gồm chết từ thí nghiệm gây nhiễm kết hợp cả nhóm đối chứng âm. Tuy nhiên, ở nhóm đối Tôm hấp hối sắp chết từ các nhóm thí chứng âm có cường độ và tỷ lệ thấp hơn (Hình nghiệm được thu mẫu để kiểm tra mô bệnh học. 24A và 24B). Ở nhóm chỉ ngâm 5HP ở 104 CFU/ Các tổn thương chính được tìm thấy trong gan ml, gan tụy của tôm hấp hối có dấu hiệu bong tôm bao gồm tế bào biểu mô bị tan vỡ (Hình tróc các tế bào biểu mô của ống gan (hình 2C), 21B), xuất hiện nhiều không bào trong tế bào tế bào E có dấu hiệu của bệnh AHPND (Hình kẻ của cơ quan lymphô (Hình 22B), và sự xuất 24C). Tuy nhiên, cơ quan lymphô (Hình 22C) hiện của các thể vùi bắt màu eosin trong tế bào và mô tạo máu (Hình 23C) có dấu hiệu bình chất của các tế bào thuộc mô tạo máu (Hình thường. 23B). Ngoài ra, Tế bào E bị không bào hoá xuất TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 37
  13. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 21. Mô học của gan tụy. (A) Gan tụy bình thường của tôm không gây nhiễm có nhiều tế bào B và tế bào R, (B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có dấu tế bào biểu mô bị tan vỡ, và (C) Nhóm 5HP chỉ ra tế bào biểu mô bị bong tróc. Độ phóng đại 10X. Hình 22. Mô học của cơ quan lymphô. (A) Lymphô bình thường ở nhóm không gây nhiễm, (B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều không bào trong tế bào kẻ (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra lymphô bình thường. Độ phóng đại 40X. Hình 23. Mô học của mô tạo máu. (A) Mô tạo máu bình thường ở nhóm không gây nhiễm, (B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều thể vùi bắt màu eosin trong tế bào chất (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra mô tạo máu bình thường. Hình A và B (độ phóng đại 40X); hình C (độ phóng đại 100X). Hình 24. Mô học của vùng tế bào E. (A) Tế bào E ở nhóm không gây nhiễm có ít không bào (mũi tên). (B) Nhóm kết hợp giữa Sh2-4 và 5HP có nhiều không bào (mũi tên), và (C) Nhóm 5HP chỉ ra tế bào E bị bong tróc (mũi tên). Độ phóng đại 40X. 38 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  14. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II IV. THẢO LUẬN lọc cho Delftia sp. và kết hợp với sàn lọc bằng Dữ liệu từ kết quả phân tích gen 16S rRNA PCR. Môi trường TSA không chứa NaCl có thể của tôm bị nhiễm AHPND so với tôm khoẻ ức chế tốt đối với V. parahaemolyticus trong khi khám phá ra rằng khả năng vi khuẩn thuộc bộ nó cho phép các vi khuẩn khác phát triển. Các vi Burkholdeirales có thể liên quan đến AHPND khuẩn này được tiếp tục sàn lọc bằng PCR với ở ô tôm nuôi ở Thái Lan (Prachumwat và các mồi đặc hiệu để khuyếch đại vùng IGS của ctv., 2012). Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào D. acidovorans. Cường độ vạch sản phẩm PCR trước đây trình bày về các vi khuẩn thuộc bộ thu được từ các chủng phân lập khi được so sánh Burkholderiales gây bệnh trên tôm. với đối chứng dương (D. acidovorans) là tương đối thấp. Giải thích cho điều này thì không rõ Nghiên cứu này là đầu tiên chỉ ra rằng vi ràng nhưng có thể do có sự khác biệt một số khuẩn thuộc giống Delftia (bộ Burkholderiales) nucleotide trong trình tự mồi nên số lượng bản có thể gây chết tôm thẻ chân trắng. Kiểm tra sơ sao của đoạn trình tự đích cho khuyếch đại PCR bộ với chủng Delftia acidovorans mua từ Viện bị thấp. CBS của Hà Lan khám phá ra rằng tỷ lệ chết của tôm có thể bị gây ra bởi vi khuẩn này với nồng Hai chủng phân lập Sh2-4 và So1-40 được độ tiêm 103CFU/3g tôm. Các tôm hấp hối sắp chọn cho nghiên cứu sâu hơn. Theo phân tích chết có dấu hiệu mô bệnh học khác với dấu hiệu hoá sinh bằng kít API 20 NE, hai chủng này mô bệnh học của AHPND như là sự tan vỡ của được xác định là gần nhất với Pseudomonas các tế bào biểu mô của ống gan tụy và sự không luteola (kết quả không trình bày). Tuy nhiên, báo hoá các tế bào E. Ngoài ra, những đặc tính phân tích trình tự gen 16S rRNA chỉ ra rằng phụ không được mô tả ở tôm bị AHPND bao chủng phân lập Sh2-4 tương đồng vi khuẩn gồm sự có sự hiện những không bào bất thường không được nuôi cấy, trong khi So1-40 thì trong gan tụy và cơ quan lymphô và các thể vùi tương đồng với chủng Bacillus. Kết quả này cho trong tế bào chất bắt màu eosin hiện diện ở mô thấy sự hạn chế trong phân tích hoá sinh do số vi tạo máu. khuẩn cố định trong cơ sở dữ liệu của API. Theo so sánh trình tự một phần của gen 16S rRNA, Bởi vì chủng D. acidovorans tham khảo sự giống nhau trình tự giữa D. acidovorans và được mua từ CBS, nó không thể phản ánh bản Sh2-4 (92,6%) cao hơn sự giống nhau trình tự chất thực sự của Delftia giả định mà được chỉ ra giữa D. acidovorans và So1-40 (78,9%). Kết trong phân tích PCR từ các trại tôm địa phương quả này có thể đề nghị rằng Sh2-4 có thể là một ở Thái Lan. Đối với chủng phân lập của tác thành viên của giống Delftia. Xây dựng cây nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND), phát sinh loài dựa vào trình tự một phần của gen môi trường TSA được sử dụng để phân lập và 16S rRNA chỉ ra rằng Sh2-4 nằm ở vị trí giữa nó mang lại thành công trong phân lập Vibrio nhánh Delftia và Ralstonia. Kết quả này gợi ý parahaemolytius gây AHPND (VPAHPND) ở Thái rằng Sh2-4 có thể là một loài Delftia thuộc họ Lan (Joshi và ctv., 2014). Một đặc tính của V. Comamonadaceae, bộ Burkhodariales với chỉ parahaemolyticus là mọc rất mạnh khi được số bootstrap 86%. Theo Felsenstein (1985) chỉ nuôi cấy trên TSA có bổ sung 1,5% NaCl. Sự số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự quan hệ phát triển nhanh chóng của V. parahaemolyticus gần gũi giữa các thành viên của nhóm trong cây có thể lấn át các loài khác. Điều này có thể dẫn phân loài. Ngược lại, So1-40 nằm cùng nhánh đến thất bại trong việc phân lập các loài vi khuẩn với họ Bacillaceae. Vì vậy, So1-40 không được liên quan khác như là các vi khuẩn đã khám phá tiếp tục nghiên cứu sâu hơn. từ phân tích gen 16S rRNA. Thí nghiệm sinh học bằng cách sử dụng Để tránh vấn đề như vậy, việc sàn lọc các chủng tham khảo D. acidovorans (RDA) chủng Delftia từ các trại tôm được chia thành cho kết quả chết tôm khác nhau ở các lần thí hai bước bao gồm sàn lọc bằng môi trường chọn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 39
  15. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II nghiệm. Hiện tượng này có thể được giải thích có biểu hiện của bong tróc cấp tính của các tế do trạng thái sức khoẻ của tôm ở các đợt thí bào biểu mô của ống gan tụy như đặc tính của nghiệm bởi vì chúng có thể khác nhau ở các lô AHPND. Thay vào đó, mô tôm có biểu hiện tan tôm. Tỷ lệ chết ở tôm cũng xảy ra tương tự khi vỡ các tế bào biểu mô cùng với những dấu hiệu quan sát thí nghiệm cảm nhiễm của VPAHPND (dữ mô bệnh học bao gồm xuất hiện nhiều không liệu không trình bày). Ở thí nghiệm gây nhiễm bào trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô và kết hợp, tôm được tiêm Sh2-4 trước khi ngâm có sự hình thành các thể vùi bắt màu eosin trong V. parahaemolyticus (5HP). Tôm chết nhanh tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu. hơn ở nhóm kết hợp khi so sánh với nhóm chỉ 5.2. Đề xuất ngâm 5HP. Ở mức độ mô học, tôm hấp hối sắp chết của nhóm gây nhiễm kết hợp không có biểu Để hiểu sâu hơn mối tương quan giữa dấu hiện của bong tróc cấp tính của các tế bào biểu hiệu mô bệnh học riêng biệt và sự hiện diện của mô của ống gan tụy như đặc tính của AHPND. D. acidovorans ở trong các mô tương ứng, thì Thay vào đó, mô tôm có biểu hiện tan vỡ các kỹ thuật lai in situ với mẫu dò phân tử đặc hiệu tế bào biểu mô cùng với những dấu hiệu mô cho Delftia nên được thực hiện. Kế hoạch thí bệnh học bao gồm xuất hiện nhiều không bào nghiệm trong tương lai nên thực hiện gây nhiễm trong các tế bào kẻ của cơ quan lymphô và có kết hợp bằng phương pháp ngâm cả hai vi khuẩn sự hình thành các thể vùi bắt màu eosin trong để khẳng định có tác động bổ trợ hay không. tế bào chất của các tế bào thuộc mô tạo máu. Ngoài ra, để nghiên cứu đặc tính sâu hơn đối Cùng với đó, kết quả này cho thấy rằng Sh2-4 với Sh2-4, thì cần thiết phải giải trình tự toàn bộ có thể nhiễm cộng hợp với V. parahaemolyticus chiều dài của gen 16S rRNA hoặc giải toàn bộ (5HP). Điều này có thể dẫn đến một sự đánh giá trình tự của bộ gen. thấp về tần suất xuất hiện AHPND trong việc LỜI CẢM ƠN chẩn đoán bệnh. Những quan sát gần đây cũng Đề tài này được sự hỗ trợ bởi học bổng cho thấy rằng mẫu tôm từ các ao bị EMS thường Công nghệ Sinh học của Chính Phủ Việt Nam thiếu các dấu hiệu bong tróc các tế bào trong (Số 1254/QĐ-BGDĐT), Trung tâm Quốc gia ống gan tụy, nhưng thay vào đó nó có dấu hiệu Công nghệ Di truyền và Công nghệ Sinh học tan vỡ của tế bào biểu mô. Thái Lan (BIOTECH Thái Lan), và Hội đồng V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Nghiên cứu Quốc gia Thái Lan. 5.1. Kết luận Các kết quả cho thấy rằng loài Delftia có TÀI LIỆU THAM KHẢO thể liên quan đến EMS ở tôm nuôi. Chúng tôi đã Bell, T. A., & Lightner, D. V., 1998. Technique. thiết lập được phương pháp PCR phát hiện đặc In A Handbook of Normal Penaeid Shrimp hiệu cho Delftia sp. và Delftia acidovorans dựa Histology. Baton Rouge, Louisiana: World vào trình tự của vùng IGS (intergenic spacer). Aquaculture Society. Chủng phân lập Delftia giả định mà sàn lọc Chen, W.-M., Lin, Y.-S., Sheu, D.-S., Sheu, S.- từ các trại tôm địa phương được thực hiện thí Y., 2011. Delftia litopenaei sp. nov., a poly- nghiệm sinh học bằng phương pháp gây nhiễm β-hydroxybutyrate-accumulating bacterium kết hợp với VP(AHPND) (5HP). Kết quả cho thấy isolated from a freshwater shrimp culture rằng Delftia sp. có liên quan đến EMS/AHPND pond. International Journal of Systematic and do nó có tác động bổ trợ đến tỷ lệ chết của tôm. Evolutionary Microbiology, 62(Pt 10), 2315– Thời gian gây chết 50% (LT50) của nhóm kết 21. hợp giữa Sh2-4 và 5HP là 1 ngày, trong khi LT50 FAO., 2013. Report of FAO/MARD Technical của 5HP là 4 ngày. Ở mức độ mô học, tôm hấp Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) hối sắp chết của nhóm gây nhiễm kết hợp không or Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome 40 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
  16. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II (AHPNS) of Cultured Shrimp (under TCP/ in Vietnam, microsporidiosis or liver disease? VIE/3304). Hanoi, Viet Nam, 25–27 June 2013 Available at: http:// aquatichealth.net/ Felsenstein, J., 1985. Confidence limits on issues/38607 (accessed 24 Feb 2012). phylogenies: an approach using the bootstrap. NACA-FAO., 2011. Network of Aquaculture Evolution 39:783 – 791 . Centers in Asia- Pacific — Food and Agriculture Flegel, T. W., 2012. Historic emergence, impact Organization of the United Nations) (2011). and current status of shrimp pathogens in Asia. Quarterly Aquatic Animal Disease Report Journal of Invertebrate Pathology, 110(2), (Asia and Pacific Region), 2011/2, April-June 166–73. 2011. NACA, Bangkok, (April). Joshi, J., Srisala, J., Truong, V. H., Chen, I.- Prachumwat, A., Thitamadee, S., Sriurairatana, T., Nuangsaeng, B., Suthienkul, O., … S., Chuchird, N., Limsuwan, C., Jantratit, Thitamadee, S., 2014. Variation in Vibrio W., Chaiyapechara, S., Flegel, T. W., 2012. parahaemolyticus isolates from a single Thai Shotgun Sequencing of Bacteria from AHPNS shrimp farm experiencing an outbreak of acute A New Shrimp Disease Threat for Thailand. hepatopancreatic necrosis disease (AHPND). , Poster, National Institute for Aquaculture Aquaculture, 428-429, 297–302. Biotechnology, Mahidol University, Bangkok, Thailand (Poster available for free download at Leaño, E. M., Mohan, C., 2012. Early mortality www.enaca.org). syndrome threatens Asia’s shrimp farms. Global Aquaculture Advocate, July/Aug Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., 1989. 2012:38−39. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Lightner, D. V., Redman, R. M., Pantoja, C. R., Cold Spring Harbor, USA. Tang, K. F. J., Noble, B. L., Schofield, P., Mohney L. L., Nunan L. M., Navarro, S. A., Tran, L., Nunan, L., Redman, R. M., Mohney, L. 2012. Historic emergence, impact and current L., Pantoja, C. R., Fitzsimmons, K., Lightner, status of shrimp pathogens in the Americas. D. V., 2013. Determination of the infectious Journal of Invertebrate Pathology, 110(2), nature of the agent of acute hepatopancreatic 174–83. necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Diseases of Aquatic Organisms, 105, 45–55. Mooney, A., 2012. An emerging shrimp disease TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017 41
  17. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II STUDY OF NON-Vibrio BACTERIA AS POTENTIAL ASSOCIATES OF Vibrio parahaemolyticus IN CAUSING AHPND IN WHITE-LEG SHRIMP IN THAILAND Trương HongViet1*, Ajaree Nilawongse2, Kallaya Sritunyalucksana3, Timothy W. Flegel2, Siripong Thitamadee2,3 ABSTRACT Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) in penaeid shrimp has been reported in Thai- land since 2012. Analysis of PCR amplified 16S rRNA gene fragments obtained from normal ver- sus diseased shrimp samples revealed several bacterial candidates including Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp., Acidovorax sp., Sphingmonas sp., Leifsonia sp., and Rhodococcus sp. were proportionally higher in EMS ponds than in normal ponds. In this study, we selected a reference Delftia acidovorans (NCCB 28024) (RDA) purchased from a culture collection to compare with two putative Delftia isolates (Sh2-4 and So1-40) screened from local Thai farms by culture and PCR screening. The 16S rRNA gene analysis revealed high similarity between the 16S rRNA gene sequence of Sh2-4 and that of D. acidovorans (92.6%) indicating that it may be a new Delftia spe- cies. In contrast, So1-40 showed an alignment score of only 78.9%, suggesting that it was from a different genus. For co-challenge tests, shrimp were injection-challenged with Sh2-4 at concentra- tions of 103 CFU per 3 gram shrimp followed by culture for 7 days before immersion challenge with Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) at 104 CFU/ml (101 lower than the normal LC50 quantity). The co-challenge test results suggested that this isolate exhibited increased the virulence of VPAHPND but gave histopathologies different from AHPND (with sloughed signals of hepatopancreatic epithelial cells). These consisted of collapsed hepatopancreatic epithelial cells, vacuole formation in E cells of the hepatopancreas and lymphoid organ, and the presence of eosinophilic cytoplasmic inclusions in hematopoietic tissue. Keywords: 16S rRNA, AHPND, EMS, Delftiaacidovorans, Vibrio parahaemolyticus Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 25/11/2016 Ngày thông qua phản biện: 13/12/2016 Ngày duyệt đăng: 05/01/2017 1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment &Epidemic, Research Institute for Aquaculture No.2 2 Faculty of Biotechnology - Mahidol University - Thailand 3 Faculty of Biotechnology - Mahidol University - Thailand * Email: truonghongviet@yahoo.com 42 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 9 - THÁNG 02/2017
nguon tai.lieu . vn
Nông nghiệp Ngư nghiệp Lâm nghiệp Sinh học Hoá học Ngôn ngữ học Ngân hàng - Tín dụng