Xem mẫu
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
NGHIÊN C U TÁI SINH GI NG LÚA DT22
VÀ KHANG DÂN Đ T BI N (KDĐB)
PH C V CHO K THU T CHUY N GEN
Phí Công guyên, guy n Thuý i p,
Ki u Th Dung, Tr n Minh Hoa,
Tr n Duy Dương, ng Tr ng Lương
SUMMARY
Study on the plant regeneration of DT22 and mutant Khang dan (KD B) rice
cultivars
from matured embryo calli for rice transformation
Two rice cultivars DT22 and KD B were used to induce calli and plant regeneration
from matured embryo calli. Callus induction, callus proliferation and regeneration ratio
were evaluated on MS (Murashige Skoog, 1962) and 6 (Chu et al, 1978) media
supplemented with different concentrations of phytohormon. 6D supplemented with 2
mg/l 2,4D was the most effective on callus induction and callus proliferation of both DT22
and KD B cultivars. DT22 cultivar was highest regenerated on MS medium supplemented
with 2 mg/l BAP (BL2 medium). Regeneration ratio equal to 74.1% and regenerated shoot
were healthy and uniform. Healthy and uniform shoot were induced as 72.6% of
regeneration ratio on MS medium supplemented with 2 mg/l BAP and 0.1 mg/l AA (A4
medium).
Keywords: Rice, Callus, Plant regeneration.
1997). Do v y, các chi n lư c nh m c i
I. TV N
thi n hi u qu tái sinh lúa ư c ti n hành
ã có r t nhi u lo i mô khác nhau ư c nhi u trong nh ng th p k qua (Kyozuka và
dùng trong nghiên c u tái sinh lúa cs., 1988; Raman và cs., 1999). Các gi ng
(Bhaskaran và Smith, 1988). Tuy nhiên, các lúa Japonica thư ng có kh năng tái sinh
mô phôi thư ng ư c ng d ng nhi u trong cao trong khi ó s thành công c a các
nuôi c y in vitro nh có kh năng tái sinh gi ng lúa Indica v n còn h n ch , c bi t
cao c a các callus ư c t o thành là i v i nhóm 1 (Kyozuka và cs., 1988;
(Maggioni và cs., 1989). S tái sinh t Raman và cs., 1994). Kh năng tái sinh liên
callus t ư c t r t lâu i v i các gi ng quan nhi u n hi u qu bi n n p. Vì v y,
thu c Japonica spp. (Nishi và cs., 1973). nâng cao hi u qu c a quá trình bi n n p
Ti m năng t o thành callus và s tái sinh ã gen vào lúa, chúng tôi ti n hành: “ ghiên
ư c nhi u báo cáo nh c n như m t c c u tái sinh gi ng lúa DT22 và Khang dân
i m khác bi t và hi u qu tái sinh các t bi n (KD B) ph c v cho k thu t
gi ng lúa Indica v n g p nh ng v n khó chuy n gen”.
khăn do c tính di truy n c a chúng (Toki,
1
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
II. V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Kh trùng m u
NGHIÊN C U S d ng 2 hóa ch t kh trùng h t khác
1. V t li u nghiên c u nhau là HgCl2 1‰ trong 10 phút và NaClO
Gi ng lúa DT22 và gi ng lúa Khang 10% trong 2 l n x 20 phút.
dân t bi n (KD B) có ngu n g c và xu t
2.2. Phát sinh và nhân callus
x t Vi n Di truy n Nông nghi p.
- Môi trư ng N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D +
Nuôi c y mô tái sinh s d ng môi 3000 mg/l proline + 300 mg/l Casein + 3%
trư ng cơ b n MS (Murashige Skoog, ư ng + 0,3% phytagel).
1962) và môi trư ng N6 (Chu và cs., 1978) - Sau 10 ngày các callus ư c tách ra
b sung các ch t i u hoà sinh trư ng và chuy n vào các môi trư ng sau:
n ng khác nhau. + LD: Môi trư ng MS (Murashige and
Skoog, 1962) b sung 3% ư ng, 0,3%
2. Phương pháp nghiên c u phytagel, 100 ml/l nư c d a và các lo i
vitamin, casein,...
Phương pháp nuôi c y mô t o callus và
+ N6D: Môi trư ng N6 (Chu, 1978) b
tái sinh cây s d ng phôi trư ng thành ư c
sung 3% ư ng, 0,3% phytagel và các lo i
k t h p t phương pháp c a IRRI và phòng vitamin, nư c d a, casesin,...
thí nghi m Ch n gi ng cây tr ng, ih c
Kyushu, Nh t B n.
Công th c 2,4D (mg/ml) Casein Thiamin Tryptophan Proline (mg/ml)
thí nghi m (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
LD1 1,5 300 10 0 0
LD2 2 300 10 0 0
LD3 2 0 0 50 0
LD4 2 300 0 0 3000
LD5 2,5 300 10 0 0
LD6 2,5 0 0 50 0
LD7 2,5 500 0 0 500
LD8 3 300 10 0 0
Công th c 2,4D Casein Tryptophan Proline Glutamin Asparagin Nư c d a
thí nghi m (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (ml/l)
N6D 2 300 0 3000 0 0 0
N6D1 1,5 0 0 0 100 100 100
N6D2 2,5 0 0 0 0 0 100
N6D3 3,0 0 100 0 0 0 0
N6D4 3,5 300 0 3000 0 0 0
2.3. Tái sinh ch i và t o cây hoàn ch nh trư ng nhân callus sau 4 tu n ư c c y
Callus lúa ư c nuôi c y trên môi chuy n sang môi trư ng tái sinh và t o ch i.
Công th c BAP Kinetin NAA Công th c BAP Kinetin NAA
thí nghi m (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) thí nghi m (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
2
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
A1 2,0 1,0 0,1 BL5 3,5 0 0
A2 2,0 0 0,5 BL6 4,0 0 0
A3 2,5 0 0,5 K1 0 1,0 0
A4 2,0 0 0,1 K2 0 1,5 0
BL1 1,5 0 0 K3 0 2,0 0
BL2 2,0 0 0 K4 0 2,5 0
BL3 2,5 0 0 K5 0 3,0 0
BL4 3,0 0 0
III. K T QU VÀ TH O LU N 0,5% DT22 so v i 7,0 ± 5,0%) nhưng t
l t o callus phương pháp này l i th p
1. K t qu vào m u nuôi c y in vitro
hơn so v i khi kh trùng b ng NaClO (65,0
Trong thí nghi m vào m u in vitro, ± 2,0% so v i 77,0 ± 0,5% KD B; 74,0 ±
chúng tôi s d ng 2 hóa ch t kh trùng h t 2,0% so v i 86,0 ± 1,5% DT22. S d ng
khác nhau là HgCl2 và NaClO và ánh giá 2 HgCl2 kh trùng m u cho t l nhi m
ch tiêu là m c nhi m và m c phát th p thích h p khi thi t l p m u in vitro v i
tri n callus t h t trư ng thành. K t qu s lư ng m u nh . Tuy nhiên, khi s d ng
B ng 1 cho th y phương pháp kh trùng s lư ng m u l n, chúng tôi khuy n cáo
b ng HgCl2 cho t l nhi m th p hơn so v i nên s d ng NaClO v i m c ích thân thi n
phương pháp kh trùng b ng NaClO (2,0 ± hơn v i môi trư ng.
0,5% KD B so v i 9,0 ± 1,5%; 2,5 ±
B ng 1. K t qu vào m u in vitro
KDĐB DT22
Hóa ch t
kh trùng T l t o T l t o
S lư ng m u T l nhi m S lư ng m u T l nhi m
callus callus
HgCl2 500 2,0 ± 0,5% 65,0 ± 2,0% 500 2,5 ± 0,5% 74,0 ± 2,0%
NaClO 500 9,0 ± 1,5% 77,0 ± 0,5% 500 7,0 ± 5,0% 86,0 ± 1,5%
thêm casein và proline nh m tăng cư ng
2. ánh giá s phát sinh và nhân callus
kh năng t o callus và s d ng phytagel
Quá trình thi t l p m u nuôi c y in thay vì s d ng agar-agar. Callus ư c hình
vitro ban u s d ng môi trư ng N6D thành sau 10 ngày nuôi c y in vitro ư c
(N6D: N6 + 2 mg/l 2,4D + 3000 mg/l tách ra và ti n hành ánh giá kh năng nhân
proline + 300 mg/l casein + 3% ư ng + callus khi s d ng các môi trư ng nhân
0,3% phytagel). Môi trư ng N6 b sung callus khác nhau. Kh năng nhân callus
2 mg/l 2,4D thư ng ư c s d ng trong ư c ánh giá và cho i m theo thang (+);
nuôi c y mô lúa và t o callus t phôi (++); (+++); (++++), căn c vào kh năng
trư ng thành. Tuy nhiên chúng tôi b sung nhân callus tăng d n.
B ng 2. Cho i m và ánh giá kh năng nhân callus trên n n môi trư ng MS
Môi trư ng
LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 LD6 LD7 LD8
Gi ng
3
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
DT22 + ++ ++ +++ ++ ++ + ++
KDĐB + ++ ++ ++ ++ ++ + ++
B ng 3. Cho i m và ánh giá kh năng nhân callus trên n n môi trư ng 6
Môi trư ng
N6D N6D1 N6D2 N6D3 N6D4
Gi ng
DT22 ++++ ++ +++ ++ ++
KDĐB +++ ++ +++ ++ ++
Trong các n ng 2,4D ư c s d ng 2,4D ngo i sinh ư c b sung trong môi
c 2 công th c môi trư ng, thì n ng 2 trư ng nuôi c y là 2 mg/l. Do v y, n ng
mg/l 2,4D cho kh năng t o callus cao nh t 2 mg/l 2,4D có b sung các h p ch t như
c 2 gi ng DT22 và KD B. N ng này casein (300 mg/l) và proline (3000 mg/l) có
ã ư c s d ng nhi u trong các thí nghi m th áp d ng t o và nhân callus cho các
t o callus. i u ó g i ý r ng, các gi ng lúa thí nghi m t o callus ph c v k thu t tái
có kh năng t o callus cao nh t khi n ng sinh và chuy n gen.
DT22 KDĐB KDĐB
nh 1. M u lúa DT22 và KD B trên môi trư ng phát sinh và nhân callus
Trong m t s tài li u, môi trư ng MS nhà khoa h c tìm ra ư c môi trư ng thích
ư c cho là có hi u qu cao hơn so v i N6 h p nh t trong công tác nghiên c u này.
t o callus (A.S.M.T. Bayawickrama và
Toyoaki Anai, 2006). Nhưng k t qu thu 3. K t qu tái sinh cây t callus
ư c c a chúng tôi ch ng minh i u ngư c Trong các t h p các ch t i u hoà sinh
l i. Trong m i n ng 2,4D khác nhau, môi trư ng ư c s d ng, BAP và kinetin thu c
trư ng N6 cho k t qu t o callus cao hơn so nhóm cytokinin ư c k t h p ho c không
v i MS tương ng. Vì th chúng tôi cho k t h p v i NAA thu c nhóm auxin. D a
r ng các gi ng lúa khác nhau có th có ph n vào ánh giá v m t hình thái, BAP cho kh
ng khác nhau trong i u ki n dinh dư ng năng t o ch i tái sinh các n ng khác
có nhi u khác bi t. Vi c s d ng c 2 lo i nhau cao hơn so v i kinetin.
môi trư ng t o callus lúa s giúp các
4
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
DT22 KDĐB
nh 2. M u lúa tái sinh c a gi ng DT22 và KD B
n ng BAP 2 mg/l kh năng t o trư ng K3 (2 mg/l kinetin) (b ng 4). Trong
ch i và ch t lư ng các ch i ư c t o thành khi ó, cũng v i môi trư ng này, t l t o
t t nh t. môi trư ng BL2 (2 mg/l BAP), ch i c a gi ng KD B ch t ư c là
gi ng DT22 ph n ng t t hơn so v i gi ng 53,7%. Ch t lư ng ch i t o thành cũng
KD B v i hình thái c m ch i xanh, kho và không cao khi ch i thư ng b xoăn, y u và
ng nh t. T l t o ch i trung bình là có t o r . Vì v y, trong tái sinh cây c a 2
74,1% i v i gi ng DT22 và 66,1% i v i gi ng DT22 và KD B s d ng môi trư ng
gi ng KD B. ây cũng là môi trư ng cho tái sinh v i ch t kích thích sinh trư ng là
t l t o ch i cao nh t so v i các môi trư ng BAP s cho hi u qu cao hơn môi trư ng có
còn l i ư c s d ng tái sinh gi ng s d ng kinetin. S khác bi t là i v i môi
DT22. V i các t h p môi trư ng có b trư ng tái sinh A4 có b sung BAP 2 mg/l,
sung thành ph n kinetin thì n ng 2 mg/l gi ng KD B có kh năng t o c m ch i
kinetin kh năng t o ch i và t l t o ch i xanh, ng nh t và kho hơn khi trong môi
cũng cao nh t trong c 2 gi ng ư c nghiên trư ng có k t h p v i NAA n ng
c u. Tuy nhiên, xét trên c 2 tiêu chuNn là t 0,1 mg/l. Do v y, môi trư ng thích h p
l t o ch i và ch t lư ng ch i ư c t o thành tái sinh gi ng DT22 là môi trư ng BL2 có
u không cao b ng s d ng môi trư ng v i b sung 2 mg/l BAP còn môi trư ng A4 có
n ng 2 mg/lBAP. T l t o ch i ch t b sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/lNAA thích
cao nh t là 58,4% i v i gi ng DT22 môi h p tái sinh gi ng KD B.
B ng 4. ánh giá t l tái sinh cây t callus và hình thái ch i
T l tái sinh và t o ch i (%)
Môi trư ng
DT22 KDĐB
(%) Hình thái ch i (%) Hình thái ch i
A1 60,3 ± 3,2 C m ch i xanh, kho 57,1 ± 1,8 C m ch i xanh, kho
A2 66,1 ± 2,6 C m ch i xanh, kho , 61,4 ± 2,7 C m ch i xanh, v a ph i,
có t o r xu t hi n nhi u r
A3 67,2 ± 3,0 C m ch i xanh, kho , 60,4 ± 2,8 C m ch i xanh, v a ph i,
có t o r xu t hi n nhi u r
A4 70,1 ± 1,8 Ch i xanh, kho 72,6 ± 1,1 C m ch i xanh, đ ng nh t, kho
BL1 68,3 ± 2,0 Ch i xanh, th ng, s c s ng 64,6 ± 1,5 Ch i xanh, th ng, s c s ng
trung bình trung bình
BL2 74,1 ± 2,5 C m ch i xanh, đ ng nh t, 66,1 ± 3,1 Ch i xanh, th ng, s c s ng
5
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
kho trung bình
BL3 71,4 ± 3,3 C m ch i xanh, đ ng nh t, 65,8 ± 2,3 Ch i xanh, th ng, s c s ng
kho trung bình
BL4 69,9 ± 2,1 Ch i xanh, nh , y u 63,7 ± 1,9 C m ch i xanh, kích thư c v a,
y u
BL5 66,4 ± 1,5 Ch i xanh, xoăn, y u 61,8 ± 2,7 Ch i xanh, kích thư c v a, y u
BL6 64,2 ± 3,0 Ch i xanh, xoăn, y u 60,3 ± 2,9 Ch i xanh, kích thư c v a, y u
K1 49,7 ± 3,0 Ch i xanh, ng n, y u 52,7 ± 2,3 Ch i xanh, xoăn, y u
K2 51,0 ± 2,2 Ch i xanh, ng n, y u 54,6 ± 1,2 Ch i xanh, ng n, y u
K3 53,7 ± 1,4 Ch i xanh, dài, kho 58,4 ± 1,6 Ch i xanh, dài, kho
K4 50,8 ± 2,2 Ch i xanh, ng n, có r 54,1 ± 2,3 Ch i xanh, m nh, y u
K5 49,1 ± 1,6 Ch i xanh, m nh, xo n, có r 52,2 ± 3,1 Ch i xanh, m nh y u, có r
nghi m”. K t qu nghiên c u khoa h c
IV. K T LU N (2000-2001). Vi n Di Truy n Nông
1. Hi u qu kh trùng t t nh t i v i nghi p, B NN & PTNT.
gi ng DT22 và KD B là s d ng 2 A.S.M.T. Abayawickrama and Toyoaki
NaClO 10% trong th i gian 20 phút; Anai, 2006. Coparison of Regeneration
2. Môi trư ng t o callus thích h p cho 2 Efficiency of Different Genotype of
gi ng DT22 và KD B là: N6 + 2 mg/l Indica Rice cultivars. Bull. Fac. Agr.,
2,4D + 3000 mg/l proline + 300 mg/l Saga Univ. 92: 17-23.
casein + 3% ư ng + 0,3% phytagel 3 Bhaskaran S, Smith RH., 1988.
3. Môi trư ng tái sinh gi ng DT22: Môi Enhanced somatic embryogenesis in
trư ng cơ b n MS ( a lư ng, vi lư ng, Sorghum biocolor L. from shoot tip
vitamin) + 2 mg/l BAP + 100 mg/l nư c culture. In vitro Cell Dev. Biol.
d a + 8 g/l agar + 30 g/l ư ng; 24:65-70.
4. Môi trư ng tái sinh gi ng KD B: Môi 4 Hossain, M.A. and M. asreen., 1997.
trư ng cơ b n MS ( a lư ng, vi lư ng, In vitro regeneration of six Indica rice
vitamin) + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA cultivars. Bangladesh J. Biochem., 3:
+ 100 mg/l nư c d a + 8 g/l agar + 30 95-98.
g/l ư ng. 5 Kyozuka J, Otoo E, et al., 1988. Plant
regeneration from protoplast of
TÀI LI U THAM KH O Indica rice: genotype differences in
1 H u t, Bùi Huy Thu , Tr n Duy culture response. Theor. Appl. Genet.
Quý, guy n Minh Công, 2001. ″C i 76:887-890.
ti n gi ng lúa thu n ch t lư ng nh p n i
b ng phương pháp t bi n th c
6
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6 Toki S., 1997. Rapid and efficient
Agrobacterium-mediated transformation
of rice. Pl. Mol. Biol. Rep. 15: 16-21.
gư i ph n bi n: GS.TSKH. Tr n Duy Quý
7
- T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8
nguon tai.lieu . vn
