NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƯA VÀO TRÌNH TỰ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS

Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Trong sản xuất nông nghiệp ngƣời nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là việc phòng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng. Hiện nay trên thị trƣờng xuất hiện rất nhiều loại thuốc hóa học dùng trong nông nghiệp. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦ A NÂM ́ ́ Met

Thể loại Tài liệu miễn phí Khoa học tự nhiên

Số trang 76

Ngày tạo 8/30/2018 3:35:34 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 0.94 M

Tên tệp

Tải NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarh... (.pdf)

Xem mẫu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦ A NÂM ́ ́ Metarhizium anisopliae DƢ̣A VÀO TRÌNH TƢ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thƣ ̣c hiên: TRẦN NHẬT NAM ̣ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢU SƢ̣ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦ A NÂM ́ ́ Metarhizium anisopliae DƢ̣A VÀO TRÌNH TƢ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc hiên: ̣ ̣ ThS. VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHẬT NAM TS. LÊ ĐÌ NH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007
LỜI CẢM ƠN  Con xin cảm ơn Ba Mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn:  Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học.  Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.  TS. Lê Đình Đôn, ThS. Võ Thị Thu Oanh , CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.  Anh Nguyễn Văn Lẫm đã hết lòng hƣớng dẫn em trong quá trình thực hiện khóa luận.  Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, chia sẻ kinh nghiê ̣m và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.  Xin cám ơn cuô ̣c số ng đã đem la ̣i cho tôi nhƣ̃ng ngƣời ba ̣n , nhƣ̃ng ngƣờ i đã cùng tôi chia sẻ và động viên tôi trong suố t quá trinh thƣ̣c hiê ̣n khóa ̀ luâ ̣n. Xin chân thành cảm ơn! ̀ TRÂN NHẬT NAM iii
TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sƣ̣ tính đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA-ITS “ đƣợc thực hiện từ ngày 26 tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm 2007 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trầ n Nhâ ̣t Nam thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS . Võ Thị Thu Oanh và TS. Lê Đình Đôn. Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây hại. Đây là giố ng nấ m có hoa ̣t tính tiêu diê ̣t côn trùng ma ̣nh . Mục đích đề tài nhằm nghiên cƣ́u sƣ̣ đa da ̣ng về mă ̣t di truyề n giƣ̃a các dòng nấ m dƣ̣a trên cơ sở trinh tƣ̣ ̀ nucleotide của gen Pr1 và vùng rDNA-ITS Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Xác định đƣợc những dòng nấm Metarhizium anisopliae sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u thuô ̣c dòng Metarhizium anisopliae var. anisopliae. - Phát hiện gen Pr1 ở trên 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae. Tiế n hành giải trình tự gen Pr1 của10 mẫu nấ m. Kích thƣớc của gen Pr1 ở 7 mẫu nấ m là 1091bp. - Có sự khác biê ̣t về mă ̣t di truyề n giƣ̃a các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và giƣ̃a các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank .Tỉ lệ tƣơng đồng giữa các dòng trong nƣớc khoảng 95-100%, và giữa các dòng trong nƣớc so với các dòn g trên thế giới là 94-99% khi so sánh trinh tƣ̣ gen Pr1 ̀ - Phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 so với nhƣ̃ng dòng còn lại. Nhƣ̃ng đô ̣t biế n này đề u xảy ra ở vùng ITS 1. - Có sự bảo tồn cao trong vùng 5.8S và vùng ITS2 giƣ̃a nhƣ̃ng dòng nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong đề tài . Tỉ lệ tƣơng đồng giữa những dòng trong nƣớc là 99- 100% và giữa các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank là 92-100% khi so sánh trinh tƣ̣ ̀ vùng rDNA-ITS. iv
MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .............................................................................................................iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt...................................................................................viii Danh sách các bảng ............................................................................................... ix Danh sách các hình ................................................................................................ x 1. ̉ ̀ MƠ ĐÂU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài .................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu đề tài .............................................................................................. 2 1.3.Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1. Giới thiê ̣u nấ m Metarhizium anisopliae ............................................................... 3 2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. ................. 6 2.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................................. 7 2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm .................................................... 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. ............... 8 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................... 8 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................... 9 2.6. Giới thiê ̣u gen Pr1 .............................................................................................. 10 2.7. Vai trò của Protease Pr1 ..................................................................................... 10 v
2.8.Tổ ng quan về ITS-rDNA ..................................................................................... 10 2.8.1. Giới thiê ̣u về vùng rDNA và vùng ITS ...................................................... 10 2.9. Mô ̣t số nghiên cƣ́u trong nƣớc và nƣớc ngoài về sƣ̣ đa da ̣ng của nấ m Metarhizium anisopliae dƣ̣a vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ................................. 12 2.9.1. Nghiên cƣ́u nƣớc ngoài ............................................................................. 12 2.9.2. Nghiên cƣ́u trong nƣớc .............................................................................. 14 2.10. Phƣơng pháp phát hiê ̣n gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ....................................... 14 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 16 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 16 3.1.1. Thời gian ................................................................................................... 16 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................... 16 3.2. Vật liệu và hoá chất............................................................................................. 16 3.2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 16 3.2.2. Hoá chất .................................................................................................... 17 3.2.3. Các thiết bị chính ...................................................................................... 17 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 18 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 18 3.4.1.Kiể m tra DNA tổ ng số đƣơ ̣c ly trich tƣ̀ các dòng nấ m ́ Metarhizium anisopliae ............................................................................................................. 18 3.4.2. Khuếch đại gen Pr1 ................................................................................. 18 3.4.3. Khuế ch đa ̣i vùng rDNA-ITS ..................................................................... 21 3.5. Tiế n hành giải trinh tƣ̣ gen gây đô ̣c Pr1 và vùng ITS .................................... 22 ̀ 3.6. Tinh sa ̣ch sản phẩ m PCR ................................................................................ 22 3.7. Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự..................................................................... 24 3.8. Phƣơng pháp phân tich trinh tƣ̣ ...................................................................... 24 ́ ̀ 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 26 4.4. DNA của các mẫu nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c dùng trong nghiên vi
cƣ́u ............................................................................................................................. 26 4.5. Kế t quả tinh sa ̣ch DNA tổ ng số ...................................................................... 28 4.6. Kế t quả khuế ch đa ̣i vùng ITS1-5.8S-ITS2. .................................................... 28 4.7. Kế t quả giải trình tƣ̣ vùng ITS1-5.8S-ITS2 .................................................... 29 4.8. Kế t quả khuếch đại gen Pr1………………………………………………...36 4.9. Kế t quả đo ̣c trình tƣ̣ gen Pr1………………………………………………………36 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 42 5.4. Kết luận .......................................................................................................... 42 5.4.2. Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 ............................................................. 42 5.4.3. Phát hiện và đọc trình tự vùng rDNA-ITS ................................................ 42 5.5. Đề nghị ........................................................................................................... 43 5.6. Hạn chế của đề tài ........................................................................................... 43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 44 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................... 47 vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BXĐTG : Bọ xít đen Tiền Giang BXĐTV : Bọ xít đen Trà Vinh RBCQ9 : Rầy bông cúc Quận 9 BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTV5 : Bọ dừa Trà Vinh 5 BDTN : Bọ dừa Tây Ninh BDBD7 : Bọ dừa Bình Định 7 SCLLLA : Sâu cuốn lá lúa Long An RNBT : Rầy nâu Bến Tre RNLA : Rầ y nâu Long An ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction Rpm : Revolutions per minute viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giới thiê ̣u nấ m Metarhizium anisopliae ............................................... 3 Bảng 3.1 Nguồ n nấ m Metarhizium anisopiae đƣơ ̣c thu thâ ̣p ở mô ̣t số điạ phƣơng dùng trong thí nghiê ̣m ........................................................................................ 16 Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với că ̣p primer METPR1/METPR4 ......................................................................................................... 19 Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với că ̣p primer METPR2/METPR5 ......................................................................................................... 20 Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA -ITS .... .21 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng đọc trình tự ................................................ 23 Bảng 4.1 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơ ̣c dùng để so sánh trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS..................................................................................... 30 ̀ Bảng 4.2 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi dƣ̣a vào trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS..................................................................... 31 ̀ Bảng 4.3 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS.................................................33 ̀ Bảng 4.4 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơ ̣c dùng để so sánh trình tự gen Pr1 ....................................................................................................... 37 Bảng 4.5 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi dƣ̣a vào trình tƣ̣ gen Pr1 .................................................................................. 38 Bảng 4.6 Ma trâ ̣n khoảng cách giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ gen Pr1..............................................................40 ̀ ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau ........................................................................................................ 5 Hình 2.2 Sơ đồ của các vùng trên rDNA ............................................................. 12 Hình 3.1 Sơ đồ primer đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để khuế ch đa ̣i gen Pr1 .............................. 18 Hình 3.2 Sơ đồ primer đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng để khuế ch đa ̣i vùng ITS ........................... 21 Hình 3.3 Nhƣ̃ng phƣơng pháp đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong phân tích trình tự ................ 24 Hình 3.4 Sơ đồ phân tich trinh tƣ̣ có đô ̣ tƣơng đồ ng cao ..................................... 25 ́ ̀ Hình 4.1 DNA tổng số của nấm Metarrhizium anisopliae ...................................... 26 Hình 4.2 Sơ đồ tinh sa ̣ch DNA tổ ng số của các mẫu nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u ......................................... 27 Hình 4.3 DNA tổ ng số của nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c tinh sa ̣ch ........... 28 Hình 4.4 Hình khuếch đại vùng rDNA-ITS ........................................................ 28 Hình 4.5 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS ........................................................ 32 Hình 4.6 So sánh quan hê ̣ giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ vùng rDNA-ITS.................................... 34 ̀ Hình 4.7 Hình khuếch đại gen Pr1 ..................................................................... 36 Hình 4.8 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự gen Pr1...................................................................... 39 Hình 4.9 So sánh quan hê ̣ giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣ̣a vào trinh tƣ̣ gen Pr1 ................................................. 41 ̀ x
1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề. Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Trong sản xuất nông nghiệp ngƣời nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là việc phòng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng. Hiện nay trên thị trƣờng xuất hiện rất nhiều loại thuốc hóa học dùng trong nông nghiệp.Tuy nhiên việc sử dụng những sản phẩm này trong một thời gian dài cộng với liều lƣợng ngày càng tăng đã và đang ảnh hƣởng nặng nề đến môi trƣờng, làm xuất hiện nhiều loại sâu bệnh và côn trùng kháng thuốc, làm giảm chất lƣợng đất.Và nguy hiểm hơn cả là việc thuốc trừ sâu xuất hiện trong sản phẩm sau khi thu hoạch đã ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Trƣớc thực trạng này các nhà khoc học đã nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp mới trong việc phòng trừ và tiêu diệt các loài gây hại cho côn trùng. Một trong những phƣơng pháp đó là kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ nấm, virus, vi khuẩn hoặc sử dụng ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thảo mộc để phòng trừ và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại một cách hiệu quả và an toàn hơn. Trong các loại vi sinh vật gây hại cho côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ nấm bất toàn mà đại diện tiêu biểu là nấm Metarhizium anisopliae-một trong những loài có đặc tính diệt côn trùng mạnh nhất. Trên thế giới nấm Metarhizium anisopliae là đối tƣợng nghiên cứu của rất nhiều công trình khoa và đã đƣợc thƣơng mại hóa từ lâu – nhƣ là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại côn trùng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau.
2 Trƣớc đây việc nghiên cứu về đa dạng sinh học chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá hình thái nên còn nhiều hạn chế. Ngày nay với sự ra đời của nhiều kĩ thuật mới nhƣ kĩ thuật PCR và những ứng dụng từ PCR nhƣ RAPD, RFLP, AFLP, Southern blot, Sequence v.v.. đã giúp cho quá trình nghiên cứu nhanh và chính xác hơn.Tuy nhiên những nghiên cứu nhƣ vậy ở nƣớc ta còn rất ít. Xuất phát từ những đặc điểm trên, đƣợc sự cho phép và phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA- ITS “. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài. 1.2.1.Mục tiêu Nghiên cƣ́u sƣ̣ đa da ̣ng di truyề n của nhƣ̃ng dòng nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c phân lâ ̣p trên nhiề u đố i tƣơ ̣ng cây trồ ng khác nhau ở các tỉnh th ành trên cả nƣớc dƣ̣a vào trình tƣ̣ của gen gây đô ̣c Pr1 và vùng rDNA-ITS. 1.2.2. Yêu cầu đề tài. - Kiể m tra DNA đƣơ ̣c ly trích tƣ̀ nhƣ̃ng dòng nấ m Metarhizium anisopliae đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u. - Xác định gen gây độc Pr1 và vùng rDNA-ITS bằ ng kỹ thuâ ̣t PCR. - Xác định trình tự gen Pr1 và vùng rDNA -ITS và tìm sƣ̣ khác biê ̣t về trình tƣ̣ giƣ̃a các dòng nấ m Metarhizium anisopliae. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu. Nấm Metarhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Đinh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại ̣ cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau.
3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae. Bảng 2.1: Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae. Kingdom (Giới) Fungi Phylum (Ngành) Ascomycota Class (Lớp) Sordariomycetes Order (Bộ) Hypocreles Family (Họ) Clavicipitaceae Genus (Giống) Metarhizium Species (Loài) Metarhizium anisopliae Nấm này đƣợc Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì. Nấm thƣờng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất, thuộc vi sinh vật đất trong tự nhiên. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong. Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết.
4 Nấm Metarhizium anisopliae có 2 dạng chính: M. anisopliae var. major có bào tử dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9,0 (thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh (nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000). Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ: Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể nuôi cấy trên môi trƣờng thức ăn nhân tạo. Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm bệnh bởi Metarhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Ngoài ra Metarhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân bố rộng trong tự nhiên. M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng OA sau 10 ngày nuôi cấy ở 20oC có đƣờng kính 2 cm. Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ). Ở những nơi không có côn trùng cũng phân lập đƣợc Metarhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất
5 rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông, đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân lập đƣợc Metarhizium anisopliae. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarhizium anisopliae: - Không thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất không có chitin. - Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và O2 chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). - Ở dƣới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. - Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin (lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004). Hình 2.1: Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau
6 2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ không qua đƣờng miệng, mà qua lớp vỏ cơ thể, nghĩa là phải có sự tiếp xúc của nguồn nấm với bề mặt cơ thể vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh đƣợc. Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng. Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nƣớc. Dƣới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Thí dụ, trƣờng hợp bào tử nấm Aspergillus trong ruột ong mật. Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhƣng rất ít. Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng là một quá trình phức tạp, gồm 3 giai đoạn chính sau đây Sự xâm nhập Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng bằng sự xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin, theo cách này thì nấm tiết ra enzyme phân hủy lớp cutin để có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Ngoài ra nấm ký sinh côn trùng còn có thể xâm nhập gián tiếp vào cơ thể vật chủ qua thành ống tiêu hoá, qua lổ thở, qua vết thƣơng trên cơ thể côn trùng.
7 Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấm gây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau. Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào. 2.3. Hoạt tính sinh học. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine (ví dụ nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana, nấm Muscardine xanh : Metarhizium anisopliae có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn các enzyme.Trong đó có ý nghĩa lớn nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chitinase, proteinase, lipase và amylase. 2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với
8 rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghiệm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong vụ. Dùng nấm B. bassiana để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ 19 – 95% so với đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004). Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều. (Trần Văn Mão, 2004). 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarhizium để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium sau khi đã thử nghiệm trong phòng, trong nhà lƣới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho các chủng Metarhizium anisopliae là môi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau một năm xử lý. Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm , sản xuất và
9 ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Ngoài ra, ở nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành. Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng – Hemiptera. 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Theo Juntin L. Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawsski và Ray M.Miller (1999), các nghiên cứu về các nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng từ 1995-1998, và cho biết trong 8 loài nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết chết rầy mềm, gồm 6 loài thuộc Entomophthorales (Pandora neoaphidis, connidiobolus thromboides, C.coronatus, Entomophthora planchoniana và neozygites fresenii) và hai loài thuộc Hyphomycetes (Beauveria basssiana, Verticillium lecanii). Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm, 3mm, 4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì không đáng kể.
10 Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố ở nấm Metarhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể. 2.6. Giới thiệu gen Pr1 Những nấm gây bệnh trên côn trùng xâm nhập vào côn trùng bằng cách xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin. Chúng sản xuất những enzyme ngoại bào ảnh hƣởng trực tiếp lên lên lớp vỏ bọc của côn trùng. Nấm Metarhizium sản xuất một protease subtilisinlike ngoại bào đƣợc gọi là Pr1. Pr1 gây thoái hoá protein của lớp cutin. Pr1 đƣợc tổng hợp nhƣ là một tiền chất lớn (40.3 kDa) chứa một peptide tín hiệu, một tiền peptide và một protein hoàn thiện . Cấu trúc sơ cấp của Pr1 có độ tƣơng đồng lớn (30- 60%) với những enzyme của phân lớp subtilisin của serine endopeptidase và serine, histidine và aspartyl. 2.7. Vai trò của protease Pr1 Những enzyme tác nhân gây bệnh hội tụ ngoài tế bào có thể làm suy thoái cấu trúc polymer của biểu bì (protein, chitin và lipid) trong suốt giai đoạn phát sinh bệnh, giúp cho quá trình thâm nhập của nấm đƣợc dễ dàng và cung cấp những dinh dƣỡng cho nấm phát triển nhanh hơn. Sản phẩm của những enzyme làm phân hủy biểu bì này thì thƣờng đƣợc phân lập bởi sự nuôi cấy trên môi trƣờng chứa biểu bì hoặc chitin (Raymond và ctv, 1995). 2.8. Tổng quan về ITS-rDNA 2.8.1. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA đƣợc nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặt biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá. Ribosome hầu nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc. Phần lớn phân tử rDNA tƣơng

nguon tai.lieu . vn

Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược