- Trang Chủ
- Nông - Lâm - Ngư
- NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG
Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
DƯƠNG HẢI TOÀN
NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE
GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ
VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus)
GIAI ĐOẠN GIỐNG
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN
2006
- TÓM TẮT
Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ
tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn
giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định
thời gian tồn lưu của Malachite Green và một số biến đổi sinh hóa trên cá tra.
Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l trong 12 giờ và 1mg/l
trong 60 phút. Kết quả cho thấy hoạt tính của các men trong não, gan của cá
Tra đều bị biến đổi và khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc
vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. Sau 60 ngày thí nghiệm MG vẫn còn
tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
ii
- ABSTRACT
“Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in
the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented
from March to July 2006. The aim of the study was to determine the changes
of some biomarkers and the residues of MG on catfish. The experiment
included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours,
each applied in 3 replicates. The results showed that the biomarkers activity in
brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the
treatment. After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish
(2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb).
Keywords: Malachite Green, biomarker, residue.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iii
- MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHƯƠNG 1 .................................................................................................. 1
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 2 .......................................................................................................... 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
2.1 Sơ lược về Malachite Green............................................................................. 3
2.1.1 Sơ lược về Malachite Green ....................................................................... 3
2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của
Malachite Green................................................................................................. 3
2.1.3 Độc tính của Malachite Green .................................................................... 4
2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ................................................................. 5
2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green trên thế giới........................................ 5
Trung tâm HọcTính hình sử dụng Malachite Green ở liệuNam ........................................ 6
2.2.2 liệu ĐH Cần Thơ @ Tài Việt học tập và nghiên cứu
2.3 Ảnh hưởng của Malachite Green...................................................................... 6
2.4 Một số nghiên cứu về chỉ tiêu sinh hóa
LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD ...................................................................... 7
CHƯƠNG 3: ......................................................................................................... 9
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 9
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 9
3.1.1 Địa điểm .................................................................................................... 9
3.1.2 Thời gian thực hiện .................................................................................... 9
3.2 Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 9
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm..................................................................................... 9
3.2.2 Cá thí nghiệm............................................................................................. 9
3.2.3 Bố trí thí nghiện ...................................................................................... 10
3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu ............................................................ 10
3.2.5 Chuẩn bị mẫu ........................................................................................... 11
3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu ..................................................................... 11
3.3. Xử lí số liệu .................................................................................................. 16
iv
- CHƯƠNG 4 ........................................................................................................ 17
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 17
4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm
Malachite Green ........................................................................................... 17
4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống ..................................................... 19
4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green .............................. 20
4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green ...................................................................... 21
4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green ........................................................... 22
4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm................................................................................. 23
4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm ............................................................................... 23
4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm ................................................................................ 25
4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra
trong quá trình thí nghiệm ...................................................................... 26
Trung tâm HọcHoạt tính củaCầnGlucose-6-phosphate dehydrogenase và nghiên cứu
4.3.4 liệu ĐH men Thơ @ Tài liệu học tập (G6PD)
trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm ..................................... 27
4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm ................................................................................ 28
CHƯƠNG 5 ........................................................................................................ 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................ 30
5.1 Kết luận ......................................................................................................... 30
5.2 Đề xuất ......................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 31
PHỤ LỤC............................................................................................................ 34
v
- DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green
trên cá da trơn .................................................................................... 4
Bảng 2: Quá trình phân tích AchE ................................................................. 12
Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA ........................................................... 13
Bảng 4: Quá trình phân tích GST................................................................... 14
Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH.............................................................. 14
Bảng 6: Quá trình phân tích CAT .................................................................. 15
Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin............................................................... 16
Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG .......................................... 17
Bảng 9: pH trong quá trình gây nhiễm MG ................................................... 18
Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhi ễm MG ................................... 18
Trung tâm Học liệu ĐH Cần LMG theo thời gian thí nghiệm ........................... 19 cứu
Bảng 11: Sự tồn lưu MG + Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên
Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm........................................ 21
Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm ..................................... 22
Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AchE trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 23
Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu ........................................................................ 25
Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 26
Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 27
Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu ....................................................................... 28
vi
- DANH SÁCH HÌNH
Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm.................................. 20
Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm .................................. 22
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vii
- CÁC TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
LMG Leucomalachite green
MG Malachite Green
AchE Acethylcholine
LPO lipid peroxidase
GST Glutathione S-transferase
G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase
CAT Catalase
UBND Ủy ban nhân dân
EU Thị trường chung Châu Âu
BTS Bộ Thủy Sản
HAE 4- hydroxyalkenals
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
MDA malondialdehyde
DCP 2,4-dichlorphenol
MC-RR micocystin-RR
TCA Trichloroacetic acid
DMSO Dimethyl sulfoxide
TBA Thiobarbituric acid minimum
DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid
CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene
GSH Glutathione 50mM
G-6-P D-glucose 6 phosphat
NADP nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate
LOOP lipid hydrerxdes
viii
- CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước
ngọt, là nơi có tiềm năng rất lớn cho việc nuôi các loài cá nước ngọt như: Cá tra,
basa, vồ đém, hú, tra bần…trong đó cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng
được nuôi chính và truyền thống. Đối tượng này được người nuôi ưa chuộng vì có
những ưu điểm như: dễ nuôi, tăng trọng nhanh, kích cở lớn dễ thích nghi với môi
trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao.
Trong những năm gần đây, do việc quảng bá, thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng cá tra
của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam
được nâng cao rất nhiều. Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, Cần Thơ năm
2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài
cá này trong khu vực An Giang và Cần Thơ năm 2004 là trên 160.000 tấn (Cục
thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005). Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển
rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ
thả nuôi tăng (120-130 con/m3 trong nuôi bè và 25-35con /m2 trong nuôi ao đất
(Nguyễn Chính, 2005).
Tuy nhiên vì muốn gia tăng năng suất, sản lượng mà người nuôi đã thả mật độ dày
Trung tâm Học liệu thừa dẫn đến Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên dẫn
đặc, cho thức ăn ĐH Cần môi trường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra cứu
đến việc sử dụng các loại thuốc, hoá chất trong phòng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi là
vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị
Phương Nga, 2004). Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng
như là Malachite Green.
Chất Malachite Green được dùng rất phổ biến trên thế giới trị các bệnh nấm bên
ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể). Đó là một
loại thuốc trị nấm rất công hiệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các bể ương cá
giống. Chất Leucomalachite green (LMG) là chất được tạo thành trong quá trình
chuyển hóa của Malachite Green và thường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay
Malachite Green không còn tồn lưu nữa (CFIA, 2005). Chính vì sự tồn lưu này ảnh
hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada,
Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi và cá trê
xuất khẩu của các doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả về do phát hiện
nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005). Ngoài ra việc sử dụng
hoá chất còn ảnh hưởng đến một số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống
của cá.
Do đó đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số
chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn
giống” được thực hiên là rất cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu và
1
- đào thải của Malachite Green trên cá tra và một số biến đổi sinh hóa. Từ đó đề xuất
giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn.
Nội dung nghiên cứu:
• Ảnh hưởng của sử dụng Malachite Green lên sự biến đổi Acetylcholine,
lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate
dehydrogenase, Catalase trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn
giống.
• Phân tích sự tồn lưu Malachite Green trong cá tra (Pangasius
hypophthalmus) ở giai đoạn giống.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2
- CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN
2.1.1 Sơ lược về Malachite green
Malachite Green ( MG) có tên hóa học là Triphenylmethane. MG là một loại bột
rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da. MG cũng được dùng
trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu MG được
xem là chất diệt nấm ( loại saprolegnia ssp ) và diệt ký sinh trùng nhóm nguyên
sinh vật (protozoa). MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS04) mà còn gọi
là phèn xanh dùng để diệt ốc, diệt nấm và rong rêu trong nông nghiệp. MG đã
được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng một cách rộng rãi từ lâu để
phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến. Tại Canada trước 1992 các trại sản xuất cá
giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay
Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc
và Việt Nam đều nghiêm cấm việc sử dụng chất MG trong việc nuôi trồng thủy
sản. Chloramphenicol, Nitrofurans , xanh Malachite được liệt kê trong danh mục
các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại VN, MG vẫn còn được các
hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để vệ sinh ao hồ, tắm cá trước khi thả chúng vào
Trung tâm Học liệuđích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký tập trùng. Khi vào cơ
lồng nhằm mục
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học sinh và nghiên cứu
thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leucomalachite
Green (LMG). Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn
tại trong 1 thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm
MG.( www.khoahoc.net,22/12/2005)
2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite green.
3
- Công thức cấu tạo
[ __ ]
[ / \__N(CH2)2 ]
[ __ / \__/ ] _
[ / \__C __ + ] Cl
[ \__/ \ / \__N (CH2)2 ]
[ \__/ ]
[ ]
Công thức phân tử : C23H25N2.CL
Một số tên thường gọi:
• Malachite green chloride
• C.i. Basic green 4
• Benzaldehyde green
• n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene-
1- ylidene) -n-methyl-chloride
• Acryl brilliant green
• Aniline green
Trung tâm•Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Aizen malachite green
2.1.3 Độc tính Malachite green.
Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu
đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn
đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào
lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong các tháng
mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê Thị Kim
Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).
Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn (Ictarulus
punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau:
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC50 của Malachite Green trên cá da trơn
LC50 (mg/l) pH Nhiệt độ (oC) Thời gian (giờ)
0,4 7,5 22 6
1,72 8 12 6
1,3 8 12 6
0,286 8 12 24
0,238 7,5 22 6
0,519 9,5 12 6
Kết qủa này cho thấy nhiệt độ càng tăng thì độc tính của MG càng tăng. pH càng
cao thì độc tính của MG càng cao.
4
- Một nghiên cứu về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm
của Trung tâm Nghiên cứu Độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy MG và LMG làm hại
gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi
gene (mutagenic) và gây ung thư (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm. Qua
việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là
2 chất nguy hại có tiềm năng gây ung thư cho người. (Sở Nông Nghiệp An Giang,
2/2/2005).
Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất Malachite
Green có thể là một mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương
trình kiểm nghiệm MG ở một số loại cá tôm bán ở thị trường. Các quốc gia trong
khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và
LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng
nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư
lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG. (www.khoahoc.net,22/12/2005).
Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an
toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo
chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG
trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử
dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản.
2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới
Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có những bước
tiến bộ vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để
gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho
thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp khắc phục,
trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu
hiệu.
Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh
vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được
sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như một chất diệt nấm. Nguyên nhân là do loại
chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua. ( www.vietnam.net).
Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các
trại nuôi cá hồi và cá chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày từ 15/9/2005
đến 3/10/2005, Cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc (NEPQIS) đã
tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là
lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá ở nước này. Lượng
hóa chất tìm thấy dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com, 6/10/2005).
5
- 2.2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam.
Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện
nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy
sản Việt Nam. Nhà nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa
ra và thường xuyên có rà soát, bổ sung các quy định tương đối chặt chẽ về việc sử
dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm
cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu, đảm bảo nuôi trồng thủy sản
phát triển bền vững. Tuy nhiên việc chấp hành các quy định của nhà nước là chưa
triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam nhập khẩu phát
hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh
cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc
hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn
phát hiện mẫu thủy sản, mẫu nước môi trường nuôi nhiễm thuốc, hóa chất bị cấm sử
dụng như Choramphenicol, các dẫn xuất Nitrofuran, gần đây và theo diện rộng là
tồn lưu Green Malachite (NAFIQAVED, 2004).
Về tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp
(Phạm Thanh Tuấn, 2004) ghi nhận được có 90 loại thuốc, hóa chất được sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: diệt tạp, xử lý nước, trộn vào thức ăn để
phòng và trị bệnh. Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong
danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ
ràng, riêng chất MG là chất nằm trong danh mục cấm nhưng vẫn được người nuôi
Trung tâmdụng ở đây. ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
sử Học liệu
Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì cho biết
không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện hiện đến 10/64
mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb. Đối với cá đang nuôi
thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - 4,18 ppb. (Nguyễn
Chính, 2005).
2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN
Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh
trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản Hàn
Quốc –NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và
Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau 30
ngày, đối với lươn sự đào thải của Ciprofloxacin và Ofloxacin là sau 35 ngày. Nhiều
tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới
100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002).
Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh
trùng cho thấy (vietlinh.com.vn):
Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35ppb
Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10ppb
6
- Sau 3 tháng : MG = 0. Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn
còn.
Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng. Việc tích lủy
MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lủy dần trong thịt và tế bào
mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lủy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong
thịt. Như vậy nếu tích lủy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng
sau khi ăn cá bị nhiễm.
2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ CHỈ TIÊU SINH HÓA Lipid peroxidase
(LPO), Acetylcholinestrease (AChE), Catalase (CAT), Glutathione S-
transferease (GST), Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).
Acelthylcholine là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn
truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961)
Lipid peroxidation chất có liên quan đến các tác nhân oxy hóa trong cơ thể thường
góp phân vào các tiến trình phát sinh bệnh. Khi oxy hóa lipid nó liên quan đến sự
hấp thụ allylic hydrogen bằng việc tạo ra gốc hydroperoxyl để hình thành nên lipid
hydroperoxides (LOOPs). LOOPs tạo ra malondialdehyde (MDA) và 4-
hydroxyalkenals (HAE) khi phân hủy (Amad và ctv, 2000)
Trung tâm nghiên liệucủa Bhavan và GeraldineTài liệu nồng độ thấp 10.6 - 32.0 ng/l
Từ Học cứu ĐH Cần Thơ @ (2000) ở học tập và nghiên cứu
Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của
Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm sụt giảm hoạt tính của enzyme
Acetylcholinesterase (AChE), hàm lượng protein trong máu.
Theo Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia
tăng LPO. Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23 – 50g/con),
khi cho tiếp xúc với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa
so với đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các
nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo. Theo tác giả, sự thay đổi hoạt tính của các
nhân tố chống oxy hóa và chỉ số của LPO có thể là chỉ thị sinh học. Như vậy, có thể
dựa và sự thay đổi của LPO để đánh giá sự tác động của endosulfan lên các đối
tượng khác.
Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4D và azinphosmethyl
lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis
niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03ppm
azinphosmethyl trong các khoảng thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ. Kết quả cho thấy
cá rô phi có khả năng chống lại stress oxy hoá bằng các cơ chế kháng oxy hoá và
chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydase. Hoạt tính G6PD tăng so với
đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến
hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể.
7
- Theo Horsberg và ctv.(1989) thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ (Dichlorvos) gây ức
chế men AchE trong não cá hồi (Salmon) mạnh nhất ở nồng độ tồn lưu trong cơ thể
cao nhất. Ông cũng cho biết việc xác định hoạt tính của men AchE có thể tin cậy
hơn việc phân tích lượng thuốc tồn lưu khi chẩn đoán việc cá hồi có bị nhiễm độc
thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hay không.
Theo Zinkl và ctv. (1980) và Fleing à Grue (1981) thì nếu như hoạt tính của men
AchE trong não giảm 20% so với đối chứng thì cơ thể xem như là cá có tiếp xúc với
thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ. Chính do sự rất nhạy cảm về hoạt tính của men AchE
đối với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ mà có thể dùng đo hoạt tính của men như là
một công cụ trong việc đánh giá môi trường có bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu
cơ (FanCey và ctv. 1987, Morgan và ctv. 1990) Alexander và ctv. 19..) dã nghiên
cứu và đề nghị một phương phát đơn giản và cho kết quả nhanh qua việc do tỉ lệ
hoạt tính của men AchE để biết cá nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ như
parathion, malathin,..
Weiss ( 1958) nghiên cứu sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá và thấy rằng mức
độ hoạt hóa của AchE trong não bị ức chế tùy thuộc vào nồng độ thuốc. Ở nồng độ
500mg/kg của Folidol 600 (Methyl parathino làm AchE trong huyết tương của cá bị
ức chế 90% sau 4h thí nghiệm duy trì mức ức chế này trong 4 ngày vài hồi phục 80-
90% múc bình thường sau 8-10 ngày và đạt được mức bình thường sau 35 ngày
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
(Silva và ctv 1993).
Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003). Thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan
lên hoạt động AchE trên não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius). Thí
nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96
giờ và 1 tuần ở nồng độ 1.0 µg/l (dựa vào LC50 của endosulfan đối với cá bluegill
sunfish là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AchE trong não giảm tương
ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%.
J. Zhang và ctv (2004) nghiên cứu sự ảnh hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol
(DCP) trên gan của cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40
ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt
dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng.
Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC-
RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus.
Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL-1 sau 24 giờ. Kết
quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL-1 thì LPO trong não có sự
thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan,
não giảm ở nồng độ 0,5µgL-1 và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.
8
- CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu :
3.1.1 Địa điểm:
Khoa Thủy Sản -Trường Đại Học Cần Thơ
3.1.2 Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2006 đến 06/2006
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Bể thí nghiệm có thể tích 0,5 m3
Xô nhựa, cân tiểu ly
Bộ đồ giải phẩu (kéo, nhíp, dao)
Pipet, ống đong
Máy ly tâm, máy so màu quang phổ (Thermo, Anh sản xuất)
Dụng cụ, thiết bị, phương tiện dùng trong thí nghiệm được sử dụng từ phòng thí
nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ.
Trung tâm Họcthí nghiệm: Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hóa chất liệu ĐH
Malachite Green 80% hoạt chất (Merck)
Từ kết quả khảo sát thực tế tại Thốt Nốt, Cần thơ, người nuôi cá thường sử dụng
MG nồng độ 0,05-0,1ppm tắm cá trong thời gian 12 giờ hoặc tắm ở nồng độ cao 1-
2ppm trong thời gian 30-60 phút mục đích trị bệnh nấm thủy mi cho cá Tra. Ngoài
ra, một số hộ dân tắm cá bằng MG nồng độ 0,1-0,2ppm trong thời gian 30-60 phút
hoặc kết hợp với CuSO 4 0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong thời gian 15-30 phút.
Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1
ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm.
Phương pháp pha Malachite Green thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít nước cất, khuấy đều bằng
khuấy từ. Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể. Mỗi bể chứa 410 lít nước.
- Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): lấy 41 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít
nước
- Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): lấy 410 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít
nước.
3.2.2 Cá thí nghiệm
Cá được mua tại trại cá giống tại Cần Thơ kích cỡ từ 20 - 30g. Cá có màu sắc sáng,
khỏe mạnh, không bị dị tật, không có dấu hiệu bệnh tật .
9
- 3.2.3 Bố trí thí nghiện
Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được
lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức. Hai nghiệm thức
có nồng độ gây nhiễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) chứa 410 lít
nước, mỗi bể bố trí 50 con.
Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian
12 giờ.
Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1
giờ.
Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green.
3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu
Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục.
Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là
28%, mỗi ngày cá được cho ăn 2 lần (8h, 16h) .
Các yếu tố nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được theo dõi 2 giờ 1 lần trong 2 ngày đầu
thí nghiệm để xem ảnh hưởng của các yếu tố này đến độc tính của MG.
Trung tâmThu mẫu phânĐH sự tồn lưu của MG Tài liệu họcthời gian nghiên cứu
ü Học liệu tích Cần Thơ @ trong cá tra theo tập và
Nhiễm Không nhiễm
Ngày 0 Ngày7 Ngày 30 Ngày 60
Tiến trình thí nghiệm và thu mẫu
Ngày 0: mẫu cá thu ngay sau khi kết thúc gây nghiễm
Ngày 7: mẫu cá thu 7 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước
Ngày 30: mẫu cá thu 30 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước
Ngày 60: mẫu cá thu 60 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước
ü Thu mẫu phân tích sự biến đổi thành phần sinh hoá trên não, gan cá tra dưới
tác động của MG theo thời gian.
Nhiễm Không nhiễm
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4
Lần 1: mẫu cá trước khi gây nhiễm MG
Lần 2: mẫu cá sau khi kết thúc gây nhiễm MG
10
- Lần 3: mẫu cá 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm MG
Lần 4: mẫu cá 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm MG
Mẫu nước sau khi thu được trữ đông -20 độ cho đến khi phân tích. Mẫu cá được
giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi
phân tích, phần còn lại được xây nhuyễn và giữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích
Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng
và Thú Y Thuỷ Sản – Vùng 6. Phương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg.
88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) dựa trên hệ thống sắc kí HPLC với
đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb.
3.2.5 Chuẩn bị mẫu
Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá
Cân trọng lượng mẫu (A)
Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH 2PO4/K2HPO4 50mM (pH=7.5)
(1:5 w/v)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Cân mẫu (bao gồm mẫu và dung dịch đệm) (B)
Mẫu phân tích (AchE, CAT, GST, G6PD ) (D) Mẫu phân tích LPO(C)
Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4 oC) Trữ -80oC đến khi phân tích
Lấy phần nổi (trữ -80oC đến khi phân tích )
3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu:
Phân tích Acetylcholinestrease (AchE)
Nguyên tắc:
Hoạt tính của AchE được xác định theo phương pháp của Ellman và ctv (1961).
Phương pháp này sử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất của
AchE. ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi AchE và thiocholine
phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường
độ màu dần đậm theo thời gian và hoạt tính của AchE được đo bằng máy so màu
quang phổ.
11
- Phương trình phản ứng minh họa
AchE
Acetylthiocholine iodide thiocholine + acetae
Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate sản phẩm có màu vàng
Quá trình phân tích:
Chuẩn bị hóa chất:
- DTNB 167µM: 66.1mg/ml sodium phosphate 50mM, pH = 7.5
- Acetylthiocholine iodine (cơ chất) 30mM: 8,67mg Acetylthiocholine
iodine/1ml sodium phosphate, pH = 7.5
Bảng 2: Quá trình phân tích AchE
Hóa chất Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl)
DTNB ( 150 µM nồng độ cuối) 800 800
Sodium phosphate 150 100
Mẫu / 50
Cơ chất (1.5mM nồng độ cuối) 50 50
Hoạt tính AchE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5
phút
Công thức tính
Abs * pha loãng
Trung tâm Học= liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
R ----------------------------------------------------
(thể tích mẫu (ml) * 0.0136)/protein (mg/ml)
R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein
0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuyển thành thiocholine và acetate.
Lipid peroxidation
Nguyên tắc
LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance
(TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ
sung. Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5%
và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma). Sau khi ủ hỗn hợp trong 15
phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi. Sau đó cho phần
nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút. Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm
mát ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang
phổ.
12
nguon tai.lieu . vn