Xem mẫu
- Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1)
vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các
eppendorf mới tƣơng ứng.
Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm
10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới
tƣơng ứng.
Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa.
Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly
tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm
khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm.
Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa.
Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết
quả chiết tách.
Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng
cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasnid đối chứng.
Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym
EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA
plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không.
3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994)
Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym xúc
tác phản ứng cắt hết một lƣợng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1
giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần nhƣ sau
2.5µl
Buffer 10X
1µg
DNA plasmid
1 unit (0.1 µl)
Enzym EcoRV
Thêm nƣớc cho tới 25µl
Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút
Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 0.8%, với hiệu điện thế 100V, trong 30
phút để kiểm tra.
33
- 3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose
Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa
12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W.
Để nguội đến 40-500C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lƣợc ra khỏi miếng gel,
lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch
TAE 0.5X.
Chuẩn bị một miếng parafilm (kých thƣớc tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl
dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể
tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung
dịch vừa trộn nạp vào giếng.
Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30
phút.
Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10
phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm với
ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận).
3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR
Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng
Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh
sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel.
Quy trình tinh sạch DNA từ gel
Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ
bản gel agarose sau khi điện di
Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV.
Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào
eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc).
Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10 mg gel ≈ 10µl
capture buffer.
Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút).
Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch.
Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf.
Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ
phòng 1 phút.
34
- Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C.
Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu
tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/ phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.
Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX.
Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp lại.
Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8
%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch.
Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX
Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch.
Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản
phẩm PCR là 5:1.
Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở
nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C.
Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho
vào ở trên, ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C
Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới.
Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh
sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi.
Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút ở 40c, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại.
Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose
0.8% để kiểm tra kết quả tinh sạch
3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR
Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq
polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin
(polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu
đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính.Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết
lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi
35
- tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase
I large fragment (Klenow).
Phản ứng tạo đầu bằng
Đầu dính Đầu bằng
Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA.
Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau:
2µl
NEbuffer 10X
DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg)
dNTPs (33µmol) 1µl
1 unit (1µl)
DNA fragment Klenow
Thêm nƣớc cho tới 20µl
Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA
đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút.
3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối
blunt-end)
T4 DNA lygase không giống nhƣ E.coly DNA lygase, nó có thể xúc tác phản ứng
nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych
1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các
yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ
enzym lygase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của
vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10.
Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ
PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng
lygation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ lygase giảm xuống và
không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó
36
- chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy
ra.
Cơ sở để tính tỉ lệ về lƣợng vector và DNA insert theo số mol
Đổi từ số mol ra lượng (ng) của phân tử DNA
1 μg Kích thƣớc DNA (bp)
μg DNA = fmole DNA x x
3000 fmol 1000 bp
Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn
X Tỉ lệ DNA chèn (bp)
Vector (ng) x DNA chèn (kb)
(ng)DNA chèn =
Vector (kb) Vector
Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng
DNA cần sử dụng
Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau
1µl
T4 reaction buffer
DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng)
1µl (50ng)
DNA plasmid
T4 lygase 1 unit
Thêm nƣớc cho tới 10µl
Ủ phản ứng ở 220c trong 4 giờ, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột
tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer.
3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp (theo quy
trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa)
Thực hiện biến nạp theo quy trình sau
Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf
1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20
phút.
Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây.
Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút.
Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ.
37
- Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh
ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi
trƣờng.
Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt.
Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ).
3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III,
thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5)
Chiết tách theo quy trình 3.3.7.1, thực hiện phản ứng cắt theo quy trình 3.3.7.2
Phản ứng PCR trên plasmid:
Primer T3 và primer T7 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự T3, T7 RNA polymerase
promoter có trình tự là
T7 primer 5’- TAATACGACTCACTATAGGG – 3’
T3 Primer 5’ – ATTAACCCTCACTAAAGGGA – 3’
(Dựa theo Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and
Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan)
Primer ITS4 và primer ITS5 đƣợc thiết kế dựa trên vùng bảo tồn ITS của loài nấm
Beauveria bassiana.
Thực hiện phản ứng PCR (theo Samuel S.M.Sun, 1994 có chỉnh sửa) với thành phần
và quy trình nhƣ sau:
15.3μl
H2 O
2.5μl
PCR buffer 10X
2.5μl
dNTPs (25mM)
5’ primer (20μM) 1.25μl
3’ primer (20μM) 1.25μl
DNA plasmid (10ng/μl) 2μl
Thực hiện biến tính ở 950C trong 7 phút, thêm vào 1U Taq polymerase.
Quy trình: 950C/1’, 550C/1’, 720C/1’, 30 chu kì , 720/7’.
38
- PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính
Sau khi nuôi cấy lắc 4 giờ bắt đầu đo giá trị OD600 và kết hợp với đếm spot
nm
cuonting, chỉ chọn những nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 25 – 300 để đếm. Nếu
các khuẩn lạc mọc dày quá thì có thể đếm ½ hoặc ¼ giọt rồi nhân lên tƣơng ứng.
a b
Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy.
(a) kết quả cấy vi khuẩn sau 5 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2 mỗi nồng độ
lập lại 3 lần ; (b) kết quả cấy vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3
mỗi nồng độ lập lại 3 lần.
a b
Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy.
(a) sau 7 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) sau
6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần.
Sau 4 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.06, giá trị này tƣơng đối thấp nên chúng tôi chỉ
pha loãng và đếm số khuẩn lạc không ghi lại hình ảnh.
39
- Sau 5 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.14, với giá trị OD này chúng tôi pha loãng từ 100
– 10-6. Nhƣng chỉ chọn nồng độ pha loãng 10-1 để đếm, kết quả 3 lần lập lại nhƣ sau :
283, 298,252. Ở nồng độ này các khuẩn lạc mọc rất dày phải chia ra ½ giọt đếm. Tuy
nhiên ở nồng độ pha loãng kế tiếp thì số khuẩn lạc mọc ít không đủ từ 25 – 300 khuẩn
lạc.
Sau 6 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.36, chúng tôi pha loãng từ 10-1 đến 10-6 và chọn
đếm ở độ pha loãng 10-2, kết quả đếm của 3 lần lặp lại là : 109, 138, 143.
Sau 7 giờ nuôi cấy giá trị OD đạt đƣợc là 0.6, ở lần đếm này chúng tôi chọn độ pha
loãng từ 10-2 đến 10-7 để cấy lên đĩa và chọn ở nồng độ 10-3 để đếm, số khuẩn lạc đếm
đƣợc nhƣ sau : 43, 52, 59.
Sau 8 giờ nuôi cấy giá trị OD đo đƣợc là 1.3, chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-3
đến 10-8 để cấy lên đĩa và chọn đếm ở độ pha loãng 10-5 kết quả là : 20,38, 47.
Khi giá trị OD đạt 1.3 thì dừng lại không theo dõi nữa vì thực tế chúng tôi chỉ cần
biết trong điều kiện làm thí nghiệm này, để đạt đƣợc mật số tế bào 108 tế bào/ml thì giá
trị OD tƣơng ứng sẽ là bao nhiêu.
Bảng 4.1 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 1
Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA
5 x 104
4 gờ 0.12 4.7
1.6 x 105
5 giờ 0.3 5.2
1.3 x 106
6 giờ 0.54 6.1
107
7 giờ 0.96 7
1.3 x 108
8 giờ 1.81 8.1
Bảng 4.2 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 2
Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA
105
4 giờ 0.06 5
3 X 105
5 giờ 0.14 5.5
1.3 X 106
6 giờ 0.36 6.1
5 X 106
7 giờ 0.6 6.7
3.5 X 108
8 giờ 1.3 8.6
40
nguon tai.lieu . vn
