Xem mẫu
- đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này
có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không
hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn
tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây
chính là hiện tƣợng giới hạn.
Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng
DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA
phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kých
thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi
khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy
chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage.
Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các
enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành
những đọan có kých thƣớc nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn
nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đƣợc
methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết đƣợc vị trí cắt. DNA vi khuẩn
không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này.
Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ
thống nào tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện ở eucaryote.
Khái niện enzym cắt: Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy
giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này
ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: khi enzym nhận biết đƣợc trình
tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và
giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: enzym nhận biết trình tự và cắt
ngay tại vị trí đó. Loại 3: enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó
khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng c ác enzym cắt giới
hạn loại 2
Khái niệm trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự
nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4 -8 nucleotide (thƣờng là 4
hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một
17
- số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của
trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác.
Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T
GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào.
Bgly
Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic,
nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều
5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch.
Enzym cắt
giới hạn
EcoRI
DNA
không
DNA không đƣợc
đƣợc methyl methyl
hoá hoá
Enzym cắt
Phân cắt
giới hạn EcoRI
không cắt
EcoRI
Đầu dính DNA đƣợc
methyl hoá
DNA
đƣợc
methyl
hoá
Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn
(a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn
(b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt
Các kiểu cắt của RE loại 2:
Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm.
Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại
phải dùng enzym T4 lygase.
HaeIII
5’ GG CC 3’
3’ GG CC 3’
5’ GG CC 3’
3’ CC GG 5’
Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch.
Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử
18
- DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết
hợp thành một thông qua các đầu dính.
EcoRI
5’ G AATT C 3’
3’ C TTAA G 5’
5’ G AATT 3’
3’ C TTAA G 5’
2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA
2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I)
Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzym sao
chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase
tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA.
DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi
axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic.
DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động
enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và
exonuclease 5’ 3’.
Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị
nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym
Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase
5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’.
2.5.2.2 Terminal transferase
Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng
gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính
ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn
toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng.
Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử
DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự
nucleic axit theo Maxam và Gilbert.
19
- 2.5.2.3 Các DNase
Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng
cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp các
olygonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+ hay
Mg2+. Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho
những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg2+, DNase tác động trên
mỗi sợi DNA riêng lẻ.
2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá.
Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi
DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để
tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf
intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng
cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần
có sự hiện diện của ion Zn2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt
enzym bang cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử
phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng
sự, 1973).
2.5.4 Các enzym nối DNA
Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt
giới hạn lyên quan đến sự hình thành lyên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc
hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi lyền kề. Sự hình thành lyên kết này có thể
đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E.coly DNA lygase hay T4 DNA lygase.
2.5.3.1 E.coly DNA lygase
Enzym đƣợc ly trích từ E.coly xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu sole
5’ ACGG TAATCGCCA 3’
+
3’ TGCCATTA GCGGT 5’
E.coly DNA lygase
5’ ACGGTAATCGCCA 3’
3’ TGCCATTAGCGGT 3’
20
- 2.5.3.2 T4 DNA lygase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coly. Enzym này có cùng chức năng với
lygase trích từ E.coly nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng
nên là lygase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử.
2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội
2.6.1 Với plasmid
Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC. Các DNA sợi kép (plasmid
thẳng) với các đầu dính hay bằng đƣợc tạo thành. Đoạn DNA lạ đƣợc cắt ra từ một
phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trƣờng hợp đầu dính) hoặc thu
nhận từ phản ứng PCR. Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn đƣợc tiến hành
dƣới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase giúp sự tạo nối đồng hóa trị giữa các
nucleotide cạnh nhau.
2.6.2 Với DNA phage
Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhƣng ta cũng có thể tạo các ngân
hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dù ng
plasmid. Các bƣớc tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm
cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tƣơng hợp với các đầu tận
cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái tạo vỏ
phage nhờ chất trích protein từ vỏ phage. Đến đây, phage sẵn sàng nhiễm vào vi
khuẩn. Để tăng bội DNA phage ngƣời ta cho các phage nhiễm vào vi khuẩn. Các
phage chứa DNA lạ sinh sản mạnh và phá vỡ vi khuẩn. Các vi khuẩn sau đó đƣợc trải
trên thạch trong hộp petri.
2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA
Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào
vi khuẩn E.coly bằng phƣơng pháp Calcium chloride.
Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp,
biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa
ra công thức tính hệ số biến nạp
N = A x10n x OV/PV
N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA
A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc
n: hệ số pha loãng
21
- OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl)
OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl)
Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình
chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau:
10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl
Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào
khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E.coly khác nhau.
Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất
lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của
dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là
từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng
trong dung dich TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy
thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày.
22
- PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp
Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15
tháng 08 năm 2005.
Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trƣờng Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm
3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm
Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid
pBluescirpt II SK (+/-), đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng PCR.
3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α
Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số
lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid.
Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1.
Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu
phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan
1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986)
3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-)
pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector
nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa
MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MSC là T7, T3
RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7,
T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự.
pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc
phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp
xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với
trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của
enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và
ngƣợc lại.
23
- Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-)
3.2.1.3 Đoạn DNA
Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là
Đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong
vi khuẩn Psedomonas fluorescens.
Đoạn DNA(580bp)trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana.
3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm
Đĩa petri, Ống nghiệm Đầu lọc hóa chất
Eppendorf các loại Thùng đựng nƣớc đá
Pipet và đầu tip Bình tam giác
Lọ thủy tinh đƣng hóa chất
3.2.3 Các thiết bị máy móc
Tủ cấy vô trùng Máy đo OD
Bồn ổn nhiệt Tủ sấy dụng cụ
Máy ly tâm Thiết bị điện di
Tủ định ôn Máy chụp gel
Máy lắc vi khuẩn Lò vi sóng
Tủ lạnh
3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn
Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua )
Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract,
natri chlorua, ampicillyn)
Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar )
24
nguon tai.lieu . vn