Xem mẫu
- này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo
thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các
vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-
galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-
galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức
năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất
hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4-
chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi
β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt
nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để
có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của
galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt
của gen lacZ.
Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm
ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation
không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng.
2.3.5 Chiết tách DNA plasmid
Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng
bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số
lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc
hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn
lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là
công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết
đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là
tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác
nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết.
Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ:
Phƣơng pháp nhiệt độ cao
Phƣơng pháp Lythium
Phƣơng pháp SDS-kiềm
9
- 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR
Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi
DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase.
Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau:
Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95oC
Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào
trình tự của Primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC.
Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC
Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần.
Lặp lại n lần
Biến tính
72 o C
94–95o C
Kéo dài
45-56o C
Ủ bắt cặp
2 4 6 8 10
Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR.
2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR
Taq polymerase
Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA.
Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện
cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập
từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao,
nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động
của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này
quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không
mong muốn.
10
- Các nucleotid tự do
dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới.
Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao
chép của Taq polymerase.
Primer (mồi)
Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với
trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của
mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi
mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA.
Dung dịch đệm
Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg2+. Nó rất cần thiết cho
quá trình lyên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ
nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1.5mM.
Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm
hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này
không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg2+. Với những đoạn DNA giàu
G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate nhằm làm giảm những
sản phẩm đƣợc tạo một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này
dùng phát hiện những đoạn gen có kých thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide.
DNA khuôn
Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho
thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu
khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh
hƣớng giảm từ 1µg xuống khoảng 100ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không
mong muốn.
Số chu kỳ phản ứng
Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qúa 40 chu kỳ. Số chu kỳ
cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì
11
- sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm
hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong
phản ứng.
Nhiệt độ và pH
Những enzym đƣợc sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Theo Trần
Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên
biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o C là thích hợp
nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi
ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72o C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động.
Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác
định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng
cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C.
Hầu hết các enzym, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH
này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi
DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng
PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8.
Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
1. Có nhiều Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
sản phẩm Gia tăng thời gian ủ bắt cặp
chuỗi ngắn Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi
Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78o C
không đặc
trƣng Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ
MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM.
Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ
dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng tap polymerase
12
- 2. Có nhiều Giảm thời gian ủ bắt cặp
sản phẩm Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
chuỗi dài Giảm thời gian kéo dài
Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C
không đặc
trƣng Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở
mức 1,5 – 2 mM
Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng
độ dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng Taq polymerase
3. Không có Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng
sản phẩm nào Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông.
cả Gia tăng hàm lƣợng mồi
Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C
4. Sản phẩm Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể
PCR ít Gia tăng lƣợng mồi
Gia tăng lƣợng DNA khuôn
Gia tăng lƣợng Taq polymerase
Ứng dụng của PCR
PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế
riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các
lĩnh vực:
Y khoa: dùng chuẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus.
Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây
trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra
các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ
thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin...
13
- Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn hoặc vi rút có trong mẫu thực
phẩm. Sử dụng để xác nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen.
2.3.7 Điện di DNA
Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kých thƣớc của các đoạn
DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích
điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose
sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt
agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gellyng). Giữa những hạt nhƣ vậy có những lổ rất nhỏ.
Tùy theo nồng độ của gel mà kých thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel
càng cao thì kých thƣớc của các lổ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lổ nhỏ
này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự
dịch chuyển này. DNA có kých thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự
di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kých thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị
trí và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng
trong dung dịch ethium bromide và chiếu dƣới tia tử ngoại.
2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA
Khái niệm về vector
Vector là vật lyệu quan trọng trong các thí nghiệm biến nạp DNA, thí nghiệm gen
cloning. Vector đƣợc chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ
và cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau:
Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép
bộ gen tế bào chủ. Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có
chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Mang những
vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác
dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. Có kých thƣớc
càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kých thƣớc
vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh
và hiểu quả. Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn
nhất cho tế bào chủ. Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc
biểu hiện gen trong sinh vật chủ.
14
- Các dạng vector thƣờng sủ dụng là plasmid và phage (nhiễm sắc thể của virút).
2.4.1 Plasmid
Vùng
chèn
DNA
Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài lyệu T.A. Brown, 1997).
Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kých thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn
và vi sinh vật khác, plasmid có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào
ký chủ. Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen mã hóa các chất
có ích cho vi khuẩn . Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillyn hoặc Chloramphenocol sẽ
giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trƣờng có kháng sinh này. Tính kháng
với loại kháng sinh nào đó đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để
nhận điện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai.
Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replycation) giúp quá trình nhân
nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ.
Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào ký chủ cho việc nhân bản của nó,
nhƣng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho
quá trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài plasmid có thể gắn vào nhiễm sắc
thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào
vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kì
phân chia tế bào, nhƣng trong một giai đọan nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do.
Phân loại plasmid đƣợc dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của nó.
Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau:
Loại 1: F plasmid (Fertilyty) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp.
Ví dụ F plasmid của E.coly. Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp
15
- chất kháng lại các chất kháng sinh giúp tế bào ký chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. Ví
dụ RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas. Loại 3: Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi
khuẩn khác. Ví dụ ColE1 trong E.coly. Loại 4: Degradative plasmid giúp ký chủ tạo
các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều kiện nào đó, nhƣ toluen, salycylyc
axit. Ví dụ TOL plasmid trong Pseudomonas putida. Loại 5: Virulence plasmid xác
định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ. Ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium
tumefaciens gây bệnh bƣớu trên cây hai lá mầm.
Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có nhiều
tới rất nhiều gen giúp cho plasmid tồn tại và họat động trong những ký chủ thích hợp.
Gen cần thiết gồm gen kháng kháng sinh, giúp cho việc chọn đúng những tế bào mang
plasmid, gen ori giúp cho quá trình lập lại, gen chỉ thị nhằm nhận biết sự tái tổ hợp,
vùng MSC (multiple cloning site, vùng đa vị trí gắn kết) chứa nhiều vị trí đƣợc nhận
biết bởi nhiều loại men cắt khác nhau giúp cho sự chèn nhiều đoạn DNA có cấ u trúc
khác nhau, và các gen khác nhƣ promoter (p), gen chỉ thị nhƣ lacZ’, vùng có cấu trúc
bổ sung của primer cho phép thực hiện PCR kiểm tra kết quả.
2.4.2 Phage
Là vật lyệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn. Khi tấn công
DNA của phage đƣợc truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số
lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào.
Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage
đƣợc biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid. Các vector lai giữa
plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng
dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu
về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi
đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kých thƣớc tới
10kb (pEMBL9, pBluescript).
2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA
Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa
DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector.
2.5.1 Các enzym cắt giới hạn
Khái niệm hiện tƣợng giới hạn: Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi
khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lƣợng phage tăng lên
16
nguon tai.lieu . vn
