- Trang Chủ
- Luận Văn - Báo Cáo
- Luận văn: XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE part 2
Xem mẫu
- 60
2.1.5.Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài
Các dòng cacao nghiên cứu trong đế tài thuộc những giống có năng suất
cao, có giá trị thương mại nhờ được chọn lọc từ những cây bố, mẹ có đặc tính tốt
trong quá trình lai tạo giống.
13 dòng cacao thương m ại được nhập từ Malaysia có đời bố mẹ của một
số dòng như sau:
Tên dòng Đời bố mẹ
TD1 PA 35 x NA 32
TD3 Con lai của Trinitario
TD5 UAWA 18 x T.S.15/43.352
TD10 NA 31 x PA 15
TD13 UIT 1 x NA 33
TD14 PA 173 x SCA 9
TD12 (PA 76 x SCA 20) x (UIT 1 x SCA 6)
2.2.Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh họ c phân tử đều bắt đ ầu bằng việc thu
nhận một lượng lớn nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch đ ể tiến hành các thí nghiệm
kế tiếp. Mố i quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận
được các phân tử này ở trạng th ái nguyên vẹn tố i đa không bị phân hủ y b ởi các tác
nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hó a học (phân tử bị thủ y giải
bởi các enzyme nội b ào giải phóng ra môi trường khi tế bào b ị ph á vỡ). Các nucleic
acid cần được tách chiết ở nhiệt độ th ấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội
bào (Desoxyribonuclease-Dnase và Ribonuclease-Rnase)
Một qui trình ly trích DNA ở tế bào th ực vật gồm 3 bước cơ bản:
Bước 1 : Phá vỡ m àng tế bào.
Thông thư ờng người ta nghiền tế b ào hoặc mô trong một hỗn hợp dung
dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium
dodecyl sulfat 10% (SDS). Hỗn hợp n ày sẽ ph á vỡ m àng tế bào và màng nh ân, giải
phóng DNA ra môi trường đồng thời ph ân hủ y các protein liên kết với DNA.
- 61
Bước 2 : Loại bỏ các thành ph ần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là
các protein.
Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium
bromide) tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng. Loại bỏ
protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – p rotein b ằng hỗn hợp
phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). Phenol và chloroform sẽ làm biến
tính protein. Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha h ữu cơ dễ tách rời
nhau. Isoamyl alcohol h ạn chế sự nổ i bọt trong suốt qu á trình ly trích. Mặc dù
phenol làm biến tính protein nhưng nó có thể làm ức chế hình dạng của Rnase và
làm dung môi cho phân tử Rnase có chứa những chuỗ i dài polyA (Brawerman và
ctv,1972). Do đó, có th ể kh ắc phục nhược điểm này b ằng cách sử dụng thêm
chloroform sẽ giúp lo ại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic
acid. Protein bị biến tính sẽ không hò a tan trong pha nước có chứa nucleic acid và
sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nư ớc và pha hữu cơ. Pha nước có
chứa nucleic acid được thu nh ận lại.
Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol.
Các DNA có trọng lư ợng phân tử thấp không bị tủa n ên có thể loại bỏ chúng
bằng tủa trong isopropanol. Nucleic acid sẽ được thu nh ận lại b ằng ly tâm. Sau đó,
cặn tủ a phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của
isopropanol còn dính lại (Hồ Hu ỳnh Thù y Dương,1998).
Phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế.
Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, chúng ta có thể tiến hành phân
tích định tính và định lư ợng DNA bằng quang phổ kế.
Phương pháp này cho phép ước lượng tương đố i nồng độ nucleic acid có
trong mẫu sau khi ly trích được. Nguyên tắc của phương pháp này d ựa vào sự hấp
thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở b ước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine.
Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho
phép xác đ ịnh nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: một đơn vị
OD260nm tương ứng với n ồng độ 5 0ng/µl cho dung dịch chứa DNA mạch kép. Tuy
nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ
sạch của dung dịch, người ta đo th êm giá trị OD280nm. Tại bước sóng 280 nm,
- 62
protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thu bước sóng ở 260
nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị th ật của nồng độ nucleic acid.
Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein.
- Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1.8 đối với DNA tinh khiết.
- Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết (Quách Tuyết Oanh,
2003)
2.3.Giới thiệu về kỹ thuật PCR
2 .3.1.Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ n ối
tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau :
Bước 1: Biến tính
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vòng 30 giây
đến 1 phú t, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 m ạch đ ơn. Ch ính 2 mạch
đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.
Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đ ầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi
mã trên dây template để có phân tử DNA m ới.
Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho ph ép các primer bắt cặp với
khuôn, nhiệt độ n ày dao động trong khoảng 30-70o C, kéo dài trong khoảng 30 giây
đến 1 phút, tù y thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các
primer sử dụng. Giai đo ạn này gọi là giai đoạn lai.
Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer
Nhiệt độ được tăng lên 72 oC giúp cho DNA polymerase ho ạt động tốt nhất.
Thời gian của giai đoạn này tù y thuộc vào độ dài của trình tự DNA khu ếch đại,
thường kéo d ài từ 30 giây đến vài phút.
Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt n ào đó được
khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2 n
m : là số bản sao của chuỗi mã hó a.
n : là số chu k ỳ.
- 63
H ình 2.2: Nguyên tắc phản ứng PCR
Ba trình tự này xả y ra theo chu kỳ rất nhanh để khu ếch đại DNA. Trong chu
kỳ thứ nh ất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗ i dài được
hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả nh ững sản phẩm chuỗi
dài và chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi d ài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản
phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit. Do dó, ngư ời ta hy vọng có khoảng 105 lượng
sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25 -30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR được áp dụng
để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp.
Nh ững phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase nh ư Taq polymerase,
và sự thay đ ổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đo ạn biến
tính và giai đoạn bắt cặp.
Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được
dùng đ ể khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA. Khả năng “chọn lọ c”
này được thực hiện thông qua sự h ợp lại của 2 oligonucleotide (F và R) trong phản
- 64
ứng. Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác đ ộng làm cho DNA b ị biến
ch ất (mở dây đ ôi thành dây đ ơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên
và cho n ó hoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA.
Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer,
kí h iệu là F. Primer bên ph ải tác động trên dây 5’-3’ còn được gọ i là reverse primer,
kí h iệu là R. Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng b ị can thiệp được tăng cường hoạt
động, theo 3 trình tự đã nó i ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA đối
lập của nó trong đ iều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đo ạn DNA này
có thể sẽ được khuếch đại lên theo ph ản ứng dây chuyền với polymerase.
2 .3.2 .Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR
2.3.2.1.DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tố i ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên,
những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết qu ả tố t với DNA thu nhận trực
tiếp từ dịch chiết tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn
100ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm
lượng mẫu ban đầu còn hạn chế các khuếch đại “kí sinh”, tạo những sản phẩm ph ụ
không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA
sẽ không ảnh hư ởng xấu đến sự nh ân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến
kết quả PCR bị sai lệch.
Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể
không hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trư ờng hợp này, cần phải cắt DNA
trước bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; ho ặc có
thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2 -5 phút.
2.3.2.2.Taq polmerase
Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nước nóng
Thermus aquaticus. Với enzyme n ày, PCR cho hiệu qu ả cao nhất, Taq có thể xúc
tác kéo d ài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70 -80oC, đ ây là giới
- 65
hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme n ày hoạt động (C.R Newton và A.Graham,
1997).
Nồng độ Taq polymerase đư ợc sử dụng thông thường là 0.5 -5 đơn vị/100 µl
dung d ịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính
có thể nh ảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không
có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.
Trong ph ản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một
nucleotide lo ại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong
trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở
đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngo ài ra có th ể làm gia tăng hoạt tính
của Taq polymerase b ằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli ho ặc
Pfu. Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.
2.3.2.3.Primer
Primer là ch ỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đ ặc trưng và có
hiệu quả cao. Việc chọn primer là giai đoạn quyết đ ịnh của phương pháp PCR, việc
thiết kế primer phải tuân thủ một số chỉ tiêu cơ bản sau (Vincent R. Prezioso, 2004):
1- Chiều dài primer
Đây là m ột chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc
hiệu và nhiệt độ bắt cặp của p rimer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer. Thông
thường primer có chiều dài từ 18-24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đ ặc
hiệu cao, và cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu. Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ
trường hợp phục vụ cho mục đích đặc b iệt, và cũng không n ên quá dài vì sẽ làm
giảm khả năng bắt cặp.
2- Nhiệt độ nóng chảy Tm
Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng
ch ảy không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn th ì primer có
Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai
được với DNA.
3- Độ đ ặc hiệu
Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã
nói ở trên. Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại
- 66
một trình tự đặc trưng duy nhất trên DNA h ay chỉ cho một sản phẩm chính, và
không n ên có nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì đ iều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện
các sản phẩm phụ. Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt
độ bắt cặp của primer để đảm b ảo tính đặc hiệu.
4- Trình tự bổ sung trên primer
Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có
trình tự bổ sung với nhau, vì điều n ày sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” d o sự b ắt cặp
bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer, làm n găn cản sự bắt cặp của
primer với DNA.
Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với
nhau đ ể tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều n ày sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt
cặp với DNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn. Ngoài ra, nồng độ quá
thừa của primer cũng d ẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Ch í Bửu,1999).
Thông thường, primer xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng
0.1 µM tương đương với 2.5pmol trong 25 µl dung d ịch phản ứng. Trình tự DNA
nằm giữa h ai mồi “xuôi” và “ngược” không được qu á lớn. Ph ản ứng sẽ tối ưu trên
những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb (Hoàng Thị Liễu, 2004).
5- Hàm lượng GC và AG
Thành ph ần nucleotide của các primer n ên cân b ằng, tránh cặp GC lặp lại
nhiều lần. Hàm lượng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50%
(Kwork và ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng nhất là có 50% GC (theo nguyên tắc
của Wallace). Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T,
vì điều n ày sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu. Trình tự polypyrimidine TC hay
polypurine Agcũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại.
6- Trình tự đầu 3’
Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng
“mismatch” - b ắt cặp không đặc hiệu. Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay
vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G-C mạnh hơn A-T sẽ bảo đảm cho
sự bắt cặp đặc hiệu.
- 67
2.3.2.4.Nhiệt độ bắt cặp
Kỹ thuật PCR rất m ẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế b ất cứ sự thay đổi nhiệt độ
nào của phản ứng cũng có thể ảnh hướng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt.
Suggs và ctv.(1981) đã đề ngh ị một công thức để ước đoán nhiệt độ nóng
ch ảy Tm của primer , m à ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA m ục tiêu.
Công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 18 -24 base, trong đó
hàm lư ợng GC chiếm khoảng 50%:
Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)
A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide.
Khi chiều dài primer từ 14 – 70 base
Tms = 81.5 + 16.6(log10[J+]) + 0.41(%G+C) - (600/l)
+ [J+] : nồng độ mol các cation hoá trị I
+ (%G+C) : % nucleotide loại G và C
Khi chiều dài primer từ 20 - 3 5 base
Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))
Tuy nhiên, việc tính to án này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta ph ải điều
ch ỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nh ận tần suất đa hình cao
nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta m ới có thể có
số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược
lại.
Mối quan hệ giữa nhiệt độ bắt cặp Ta và đoán nhiệt độ nóng chảy Tm của
primer là một trong những vấn đề vẫn đang được tìm hiểu. Thông thường, nhiệt độ
bắt cặp thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy từ 2-5 oC. Nếu nhiệt độ bắt cặp qu á thấp
dẫn đến sản phẩm được nhân lên qu á m ức do sự bắt cặp các primer không chuyên
biệt có th ể xảy ra. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, n ăng su ất của sản phẩm mong
muốn sẽ giảm.
Nếu primer b ắt cặp một cách ch ính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt
cặp nên th ấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm k hoảng 5oC. Thông thường, với một
oligonucleotide có 20 nucleotide có th ể dùng nhiệt độ bắt cặp 50-55 oC. Nếu chuỗ i
- 68
dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) ho ặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ bắt cặp
có thể đến 55-65 oC. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai
đoạn b ắt cặp và kéo d ài có th ể đư ợc kết hợp và thực hiện ở 68-72 oC (Hoàng Th ị
Liễu, 2004 ).
2.3.2.5.Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫ u
Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tố i hảo giữa primer
DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như
trường hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ , kết quả sản phẩm PCR sẽ
không nhiều.
Hầu h ết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không
quá 0.5 µM (12.5 pmol/25 µL phản ứng), không tính đ ến nồng độ DNA mẫu, để
tránh hiện tượng primer-dimer.
2.3.2.6.Các thành phần khá c
Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat)
Nồng độ d NTP thường được sử dụng là 20-200 µM. Nồng độ cao hơn
dễ dẫn đ ến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân b ằng trong thành phần các
dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân b ằng trong thành phần các
dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase.
Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc
vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều d ài của
sản phẩm được khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTP tối ưu cho từng ph ản ứng phải
được xác định qua thự c nghiệm.
Nồng độ MgCl2
Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng m ạnh đến phản ứng
PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xú c tác cho enzyme Taq
polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng đ ộ Mg2+ th ấp sẽ làm hạn chế
quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn đ ịnh d ây đôi DNA và
ngăn ngừa sự biến tính hoàn to àn (do sự mở dây đ ôi DNA) của sản phẩm trong mỗi
chu k ỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng b ắt cặp
- 69
giả xảy ra ổ n đ ịnh hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn
nhưng mứ c độ chuyên biệt thấp.
Chất ổn định hoạt động enzyme
Những ho ạt chất ổn đ ịnh hoạt động enzyme cũng được chú ý. Nhiều nhà
sản xuất hoá ch ất đ ã xem xét gelatin hoặc Triston X-100 trong những buffer để tồn
trữ enzyme. Có trường hợp người ta sử dụng cả h ai làm dung d ịch đệm. Nhằm bảo
qu ản và ổn đ ịnh enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm
trong phản ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0.01% và Triston X-100 ở nồng độ
0.1%.
Dung dịch đệm
Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường
hiệu quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn
đối với các đệm đang có mặt trên thị trường
16.6 mM ammoniumsulfate
67.7 mM TRIS-HCl, pH 8.89
10 mM beta-mercaptoethanol
170 microgams/ml BSA
1 .5-3mMMgCl2
2.3.2.7.Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vượt quá 40.
Sở d ĩ như vậy vì p hản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn :
Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nh ân, tỉ lệ với
lượng mẫu ban đ ầu.
Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủ y và cạn
kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế ph ản ứng,
hoặc các bản sao vừ a được tổng hợp không kết hợp với mồi m à b ắt cặp với nhau.
Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tù y thuộc số lượng mẫu DNA ban đ ầu.
Nếu số lượng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25-30 chu k ỳ . Nếu số lượng mẫu ban đầu
là 102-10 3 thì số chu kỳ phải là 35-40 chu kỳ.
nguon tai.lieu . vn