Xem mẫu
- 21
các gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽ
tạo ra được đoạn dò chuyên biệt hoàn toàn để cải thiện độ chính xác của kỹ thuật này.
Qua việc tìm hiểu một số phương pháp xác định giới tính, ta thấy đa số các
phương pháp không m ắc khuyết điểm n ày thì sẽ gặp phải khó khăn khác và ít có
phương pháp nào phù hợp với đòi hỏi của thương mại ngày nay. Do vậy, công cuộc
tìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù hợp vẫn còn tiếp tục.
2 .3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)
Vào năm 1985, Karl Mullis và ctv đ ã phát minh ra phương pháp tổng hợp DNA
trong ống nghiệm. Phát minh này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và đ ã ảnh
hưởng mạnh mẽ đến sự chẩn đoán giới tính ở động vật.
2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase) thực ch ất là một phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm.
Nghĩa là nh ằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. Cơ
sở của phương pháp PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase. Các
polymerase này chỉ có khả năng tổng hợp một m ạch mới từ khuôn kể từ một đoạn mồi
(là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm, đoạn mồi là
những trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp. Ph ương pháp PCR
gồm 3 bư ớc: (1) biến tính phân tử DNA; (2) bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn; (3)
tổng hợp mạch mới. Ba bước này h ợp th ành một chu kỳ và chu kỳ n ày được lặp lại
nhiều lần. Chính vì vậy, đo ạn DNA mục tiêu được nhân lên rất nhiều lần và có th ể
được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thu ỳ
Dương , 2002).
Theo Schorder và ctv (1990), việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt NST Y
trong ph ản ứng PCR giúp khu ếch đại đoạn trình tự DNA chuyên biệt đực. Sự hiện diện
hoặc vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính của phôi.
Thông thường, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, người ta
nhân b ản đồng thời một trình tự trên NST sinh dưỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc một
trình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vật
liệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản.
Theo Bondioli và ctv (1989), yêu cầu của một trình tự DNA đặc hiệu cho việc
xác đ ịnh giới tính của các phôi cần phải có:
- 22
- Trình tự DNA phải lặp lại, mục đích là làm tăng tối đa lượng nguyên liệu
dùng cho ph ản ứng nhân bản.
- Trình tự lặp lại phải là trình tự đặc hiệu cho con đực.
2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR
Sau hơn một thập niên phát triển, kỹ thuật xác định giới tính bằng PCR đã
ngày càng chứng tỏ ưu th ế nhanh, nhạy và phù hợp với th ương mại. Những đặc điểm
ấy được thể hiện qua nhiều công trình được cải tiến của nhiều tác giả khác nhau.
Vào 1990, Schorder và ctv công bố công trình xác định giới tính phôi bò giai
đoạn 6 - 7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR. Đầu tiên, tác giả thiết lập phản ứng bằng
cách sử dụng các tế b ào bạch cầu. Sau đó, qui trình đ ược áp dụng trên các m ẫu sinh
thiết có từ 1 - 3 tế b ào thu nhận từ phôi. Kết quả xác định giới tính bằng PCR được so
sánh với ph ương pháp nhuộm NST và phương pháp lai tại chỗ. Kết quả cho thấy
phương pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với 2 phương pháp còn lại.
Vào 1994, Bredbacka và ctv nghiên cứu qui trình xác định giới tính bằng kỹ
thu ật PCR. Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi
dâu và lấy đi 2 - 8 tế b ào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính. Trong nghiên
cứu, các tác giả chỉ sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho giới tính đực m à không sử dụng
đoạn mồi cho các trình tự chung của 2 giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản
ứng. Các tác giả cho rằng việc sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung n ày là không
cần thiết nếu nh ư đã thực hiện việc kiểm tra sự hiện diện của mẫu sinh thiết trư ớc khi
thực hiện phản ứng PCR. Tuy nhiên, m ột số phản ứng cho kết quả không rõ ràng.
Với mục tiêu chính là phát triển một phương pháp xác định giới tính nhanh
cho một vài loài thú h ữu nhũ, Pomp và ctv (1995) đ ã xác định chính xác 209 phôi heo
con được thu thập từ 21 con nái tơ sau 10 - 11 ngày giao phối bằng k ỹ thuật P CR.
Toàn bộ qui trình từ lúc nhập phôi đến lúc cho kết quả chỉ mất 6 giờ, cải thiện hơn rất
nhiều so với các phương pháp khác. Gen được khuếch đại là sry và cặp gen đ ược dùng
làm đối chứng cho phản ứng là zfy / zfx. Sau đó, ông đã áp dụng phương pháp xác định
giới tính này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và người
nhưng kết quả không được chính xác và không đáng tin cậy như trên heo.
Vào 1999, Kitiyanant và ctv đ ã phân biệt giới tính từ một tế b ào được tách từ
phôi giai đo ạn 2 tế b ào bằng 2 phương pháp: karyotyping và PCR. Kết quả cho thấy
PCR có tỷ lệ thành công cao hơn so với karyotyping rất nhiều (100% so với 56%) và
- 23
thời gian tiến h ành thì ngắn hơn một nửa (3 giờ so với 8 giờ). Cũng vào năm này,
Chen và ctv đã kh ẳng định độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR xác định giới
tính khi dùng 10 pg DNA, 100% thành công trên tế bào phôi của các giống Holstein,
Jussay và Swiss. Những kết quả này đã chứng minh được ưu thế của ph ương pháp
dùng PCR để phân biệt giới tính trong ứng dụng thương m ại.
Bắt kịp với nhịp phát triển thương m ại trong chẩn đoán giới tính phôi trước
khi chuyển cấy, hãng Takara Bio (Nhật Bản) đã cho ra đời bộ kit chẩn đoán giới tính
bò mang tên Cycleave PCRTM Bovine sexing kit (Takara bio Inc, 2005). Nguyên tắc
hoạt động của bộ kit này là d ựa trên sự khuếch đại đoạn gen Amelogenin theo kiểu
real - time PCR. Phương pháp này rất nhạy v à nhanh, chỉ tốn 40 phút là hoàn thành
quá trình chẩn đoán.
Để khẳng định khả năng áp dụng một qui trình PCR chẩn đoán giới tính trên
nhiều giống bò khác nhau, năm 2003, Alves và ctv đã tiến h ành phân biệt giới tính trên
2 nhóm giống bò Bos indicus và Bos taurus. Kết quả là qui trình này đ ã thành công
100% khi áp dụng trên cả 2 nhóm giống.
Ở Việt Nam, một số công trình xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR đã và
đang được tiến hành. Đại diện là những công trình sau.
Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Lan đã xác định giới tính heo nhà (Sus scrofa
domestica ) bằng cách khuếch đại đoạn DNA dài 166 bp đặc hiệu cho giới tính đực và
đoạn 447 bp đặc hiệu cho cả hai giới tính. DNA mẫu được ly trích từ gan, bạch cầu,
trứng, tinh dịch. Kết quả cho thấy qui trình đã phân biệt được một số mẫu nhưng có
một vài m ẫu heo cái lại có kết quả giống như heo đực.
Năm 2003, Hu ỳnh Thị Lệ Duyên ứng dụng qui trình xác định giới tính bằng
PCR của Nguyễn Thị Thu Lan (2002) để xác định giới tính phôi. Kết quả là đ ã xác
định giới tính của một phôi heo, nhưng một phôi khác thì không cho tín hiệu.
Ngoài ra, trung tâm Công Ngh ệ Sinh Học Phôi Việt Nam cũng đang thực hiện
nhiều công trình xác đ ịnh giới tính phôi bằng kỹ thuật PCR trên bò, dê, cừu, sao la,…
Các dẫn liệu ở Việt Nam cho thấy chưa có nghiên cứu về phân biệt giới tính ở
các giống khác nhau trên bò.
- 24
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
(1) Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông, trong đó so sánh một số yếu tố có thể ảnh
hưởng đến chất lượng và số lượng DNA.
- So sánh độ tinh sạch và hàm lư ợng DNA ly trích từ mẫu cơ và lông (gồm gốc
lông và ngọn lông).
- So sánh lượng DNA ly trích từ hai vị trí của lông: ngọn lông và gốc lông.
(2) Thử nghiệm chu trình nhiệt và nguồn cung cấp Taq polymerase.
- So sánh hai chu trình nhiệt.
- Thử nghiệm ba nguồn cung cấp Taq polymerase.
(3) Xác định giới tính ba giống bò dựa trên qui trình PCR tìm được.
(4) So sánh hai mức độ làm khô DNA từ mẫu cơ trong quá trình thu hồi DNA lên
phản ứng PCR.
(5) So sánh hiệu quả PCR khi tiến h ành trên DNA từ cơ và từ lông của cả ba giống.
3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH
Đề tài được tiến hành từ ngày 14-02-2005 đ ến ngày 06-07-2005 tại Trung Tâm
Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh.
3.3 VẬT LIỆU
3 .3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA
Mẫu cơ vân và lông đuôi các giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan được lấy
từ lò mổ tập trung của huyện Dĩ An - Bình Dương.
3 .3.2 Đoạn mồi
Theo Alves và ctv (2003), trên cánh dài của NST Y ở bò có trình tự chuyên biệt
cho giống đực dài 3216 bp. Trình tự này chứa đoạn lặp lại với sự tương đồng rộng rãi
giữa các giống bò. Từ trình tự lặp lại đó, thiết kế ra đoạn mồi RIV và đoạn mồi UIV
nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 655 bp qua PCR.
Ngoài ra, để kiểm chứng kết quả chính xác hay không, dựa vào trình tự chuyên
biệt cho gen thụ thể androgen liên kết NST X. Từ trình tự chuyên biệt này, người ta
thiết kế h ai đo ạn mồi BTANRP1 (BTA1) và BTANRP2 (BTA2) nhằm khuếch đại
- 25
đoạn DNA dài 370 bp. Band 370 bp ph ải hiện diện trên gel sau khi điện di như là sản
phẩm đặc trưng chung cho cả bò đực lẫn b ò cái.
Hai cặp mồi này được cung cấp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technologies).
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi (Alves và ctv, 2003)
Đo ạn mồi Trình tự DNA mục tiêu nằm trên
RIV 5’ GTT TTA TTA TCC CAG CAA G 3’ NST Y
UIV 5 ’ TAT TCC TTT GGG GAG CA 3’ NST Y
BTA1 5 ’ CCA ACT TTC CCT TCT TTC CC 3’ NST X
BTA2 5’ ATG GCC CAA AAG AAC ATT CA 3’ NST X
3.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN H ÀNH
3 .4.1 Lấy và bảo quản mẫu
- Mẫu cơ: cắt một lư ợng nhỏ (5g) cơ vân bò vừa được giết mổ; chứa mẫu trong
túi ni lông 5*10 cm; trữ mẫu trong thùng đá, mang về phòng thí nghiệm; trữ ở -70oC.
- Mẫu lông: lông đuôi bò được thu nhặt có cả phần gốc lẫn phần ngọn; rửa sạch
dưới vòi nước máy; cắt th ành 2 phần: phần gốc và ph ần ngọn lông; mỗi phần được trữ
trong túi ni lông 10*20 cm ở -70oC.
3 .4.2 Ly trích DNA
3.4.2.1 Ly trích DNA từ cơ
* Q ui trình ly trích
Sau khi rã đông m ẫu cơ ở nhiệt độ phòng, ly trích DNA theo d ẫn liệu của Lê
Thị Thu Phương (2004).
- Phá vỡ tế bào
Lấy khoảng 0 ,1 g cơ vân cho vào eppendorf 1,5 ml; dùng chày nghiền nhuyễn
mẫu. Cho vào 60 µl dung d ịch đệm ly trích và 3 µl proteinase K, ủ hỗn hợp ở 55 oC
trong 1 giờ.
- Tinh sạch DNA
Thêm 375 µl sodium acetate 0,2 M vào hỗn hợp trên; vortex trong 10 giây.
Cho vào 200 µl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1); vortex nhẹ; ly
tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC.
- Thu hồi DNA
- 26
Lấy phần dịch nổi và chuyển vào tube 1,5 ml khác; cho thêm 1 ml ethanol
tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút
ở 10 oC, lấy cặn, làm ráo. Cho vào 180 µl TE 1X, vortex ; ủ ở 55oC trong 15 phút.
Thêm 20 µl sodium acetate 2 M, trộn đều; tiếp tục cho vào 500 µl ethanol tuyệt đối
lạnh, trộn đều; ủ ở -20 oC trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC,
bỏ phần nổi, lấy cặn. Rửa cặn bằng 1 ml ethanol 70 %; ly tâm 12000 vòng / phút trong
2 phút ở 10 oC, lấy cặn. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55 oC. Hoà tan cặn bằng 200 µl TE
1X, ủ 55oC qua đêm; vortex cho tan cặn.
Sản phẩm DNA sau khi ly trích được trữ ở -20oC hoặc sử dụng ngay. DNA
được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước
sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lượng DNA được
ước lượng theo công thức DNA (ng / µl) = 62,9 *OD260nm – 36*OD280nm. Mẫu được pha
loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 µl DNA gốc: 990 µl H2O cất khi đo OD. Các mẫu DNA ly
trích từ cơ có tỷ số OD260 nm / OD280 nm (t ỷ số OD) trên 1,6 được sử dụng để tìm qui
trình PCR phù hợp cho xác định giới tính.
* Thí nghiệm ảnh hưởng của mức độ phơi khô cặn
Trong quá trình th ử nghiệm qui trình PCR để xác định giới tính, chúng tôi
nhận thấy nếu làm quá khô DNA sau khi tủa trong cồn tuyệt đối thì PCR sẽ không cho
hiệu quả cao (không xác đ ịnh được chính xác giới tính đực cái). Chính vì vậy, chúng
tôi đ ã b ố trí thí nghiệm thu hồi DNA mẫu cơ với mức độ làm khô DNA là yếu tố thí
nghiệm. Thí nghiệm đ ược tiến hành trên 11 mẫu cơ (3 m ẫu ta Vàng, 6 m ẫu lai Sind, 2
mẫu sữa Hà Lan).
Thí nghiệm gồm các bư ớc: (1) ly trích DNA từ 0,2 g cơ vân với lượng dung
dịch đệm ly trích và proteinase K gấp đôi; (2) tinh sạch DNA với lượng hóa chất gấp
đôi lư ợng đ ã dùng theo d ẫn liệu của Lê Thị Thu phương (2004); (3) chia d ịch nổi
thành 2 phần đều nhau trước khi tủa DNA trong cồn tuyệt đối lạnh; (4) phơi khô 11
mẫu theo mức độ I và 11 mẫu theo mức độ II.
Hiệu quả của hai mức độ phơi khô DNA này sẽ đ ược kiểm tra thông qua ba
ch ỉ tiêu. Đó là tỷ số OD, hàm lượng DNA thu hồi và kết quả phân biệt giới tính bằng
phản ứng PCR (theo qui trình PCR tối ưu đã được xác định).
- 27
Bảng 3.2 Mức độ phơi khô cặn DNA
Th ời gian và nhiệt độ phơi(*)
Mức độ Biểu hiện cặn DNA
Cặn chuyển từ trắng đục sang trong
10 – 15 phút ở 55oC
I
và hơi b ầy nhầy
Vết cặn bị mờ đi, không quan sát rõ
Hơn 20 phút ở 55oC
II
vị trí cặn trên thành eppendorf
(*)
Thời gian chỉ có tính chất tham khảo, căn cứ chính yếu là biểu hiện cặn.
3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông
* Phương pháp ly trích
Trư ớc khi ly trích, m ẫu lông (ngọn lông và gốc lông) đư ợc xử lý. Cân 0,15 g
lông cho vào cối sành vô trùng. Đổ N2 lỏng vào cối; dùng chày sành vô trùng nghiền
lông thành dạng bột. Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml. Đặt
eppendorf ch ứa bột lông trong N2 lỏng hoặc trữ ở tủ -70oC ngay sau đó.
DNA từ lông sẽ được ly trích theo qui trình của Sauer và ctv (2000). Mỗi
eppendorf ch ứa bột lông được cho thêm 20 µl dung d ịch đệm. Thêm 1 µl proteinase K
(20 mg / ml) vào hỗn hợp trên rồi ủ hỗn hợp ở 55oC trong 30 phút. Bất hoạt proteinase
K bằng cách ủ hỗn hợp ở 100oC trong 5 phút.
Sau khi đã trích được DNA từ lông, tiến h ành tinh sạch và thu hồi DNA theo
qui trình như trên mẫu cơ. DNA từ mẫu lông cũng đư ợc kiểm tra độ tinh sạch bằng
phương pháp đo mật độ quang với độ pha loãng là 10.
* Thí nghiệm so sánh DNA ly trích từ cơ và lông
Để so sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích được từ cơ và lông, thí
nghiệm theo kiểu ho àn toàn ngẫu nhiên một yếu tố được tiến hành trên 10 m ẫu DNA
lông (gồm cả gốc lông và ngọn lông) và 54 mẫu DNA cơ. Chỉ tiêu quan sát là tỷ số
OD và hàm lượng DNA thu hồi.
* Thí nghiệm so sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố trên hai đối
tượng gốc lông và ngọn lông của cả ba giống. Số mẫu đ ược kiểm tra là 5 m ẫu cho mỗi
loại. Ch ỉ tiêu theo dõi là tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi.
- 28
3 .4.3 Multiplex PCR xác định giới tính
3.4.3.1 Xây dựng qui trình PCR xác định giới tính bò
Để tìm được qui trình PCR xác định giới tính phù h ợp, chúng tôi thử nghiệm
hai chu trình nhiệt và so sánh Taq polymerase (Taq) từ ba nguồn cung cấp khác nhau.
Bảng 3.3 Thành phần hoá chất PCR
Tên hoá ch ất Nồng độ cuối
PCR buffer 1X
MgCl2 1,5 mM
RIV / UIV 0,5 µM
BTA1 / BTA2 0,4 µM
dNTP 200 µM / mỗi loại
Taq tu ỳ theo nồng độ bố trí
DNA 5 ng / µl
H2O cất vừa đủ 30 µl
* Thí nghiệm so sánh hai chu trình nhiệt
So sánh hai chu trình nhiệt để đánh giá hiệu quả tạo sản phẩm PCR chuyên
biệt. Th í nghiệm đư ợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Hai chu trình
nhiệt khác nhau chủ yếu ở thời gian của giai đoạn 2.
Bảng 3.4 Sự khác nhau chủ yếu giữa hai chu trình nhiệt
Giai đoạn Diễn giải Chu trình I Chu trình II
(Alves và ctv, 2003) (điều chỉnh)
94oC trong 5 phút 94oC trong 5 phút
1 Biến tính
94 oC trong 45 giây 94oC trong 1 phút
{
{ 55 oC trong 45 giây 55oC trong 1 phút
2 Chạy 35 chu kỳ
72 oC trong 45 giây 72oC trong 1 phút
72oC trong 7 phút 72oC trong 7 phút
3 Kéo dài cuối cùng
DNA được sử dụng trong thí nghiệm này là DNA cơ của giống ta Vàng. Taq
dùng trong PCR được sản xuất bởi hãng ABgene với nồng độ 1,5 UI trong 30µl phản
ứng. Chỉ tiêu để đánh giá chu trình là hiệu quả PCR xác đ ịnh giới tính .
- 29
* Thí nghiệm so sánh ba loại Taq polymerase
Dựa trên cơ sở chu trình nhiệt tìm ra được, bố trí thí nghiệm để so sánh hiệu
quả của Taq ở nồng độ 1,5 UI do ba hãng Promega, Bio-rad, và ABgene sản xuất. Sự
khác nhau chủ yếu của ba loại Taq này là ở thành phần PCR buffer.
Bảng 3.5 Thành phần chủ yếu của ba loại PCR buffer
Hãng sản xuất Tên sản phẩm Thành phần PCR buffer 10X
Taq DNA polymerase in Tris – HCl 100 mM; KCl 500 mM và
P romega
storage buffer B Triton® X-100 0 ,1%
iTaqTMDNA Polymerase
Bio-rad Tris – HCl 200 mM; KCl 500 mM
Tris – HCl 750 mM; (NH4)2SO4
Taq DNA Polymerase
ABgene
200mM; Tween®20 0,1%
Đây là thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với đối tượng
được dùng là DNA cơ của giống ta Vàng. Chỉ tiêu được theo dõi là hiệu quả PCR
trong phân biệt giới tính đực cái.
3.4.3.2 Áp dụng qui trình PCR để xác định giới tính bò
Sau khi có được qui trình PCR phù hợp (gồm chu trình nhiệt và thành phần hoá
ch ất), chúng tôi tiến hành xác định giới tính ba giống bò khác nhau để xác định hiệu
quả của qui trình đồng thời kiểm tra một số yếu tố ảnh hưởng có liên quan. Chỉ tiêu
được theo dõi trong các thí nghiệm n ày là hiệu quả PCR xác định giới tính.
* Thí nghiệm áp dụng qui trình PCR trên DNA từ cơ của ba giống bò
Kiểm tra hiệu quả xác đ ịnh giới tính của qui trình này với DNA cơ của ba giống
ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan. Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên
một yếu tố.
* Thí nghiệm áp dụng qui trình PCR với DNA từ lông
Dựa vào qui trình PCR trên nguồn DNA từ cơ, tiến hành xác định giới tính trên
nguồn DNA từ lông. Kết quả n ày được so sánh với kết quả PCR khi sử dụng nguồn
DNA từ cơ. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố.
3 .4.4 Điện di và quan sát sản phẩm PCR
Sản ph ẩm PCR từ các thí nghiệm được điện di trên gel agarose 1,5% và quan
sát dưới tia UV sau khi nhuộm ethidium bromide.
- 30
3.3.4.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5%
- Cân 0,225 g agarose hoà tan trong 15 ml TBE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân
tán đều.
- Đun agarose trong lò vi ba ở 650 w, 2 phút.
- Để gel nguội đến khoảng 50oC; đổ vào khuôn có gắn lược.
- Chờ gel đông, rút lư ợc ra.
3.3.4.2 Điện di sản phẩm PCR
- Dùng 7,5µl sản phẩm PCR trộn với 1,5µl loading dye 6X.
- Điện di gel 30 phút trong TBE 0,5X với dòng điện 100 V, 250 mA.
- Vớt gel ra khỏi buồng điện di; cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1%
trong 30 phút.
- Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả.
3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với trắc nghiệm chi -
square hoặc trắc nghiệm F trên ph ần mềm Statgraphics 7 .0.
nguon tai.lieu . vn
