Xem mẫu
- 11
lập các qui trình xác định giới tính phôi sẽ gặp khó khăn ở nguồn mẫu. Thế nh ưng, nếu
không thiết lập qui trình xác đ ịnh giới tính, đến khi đã tạo được phôi thì sẽ không thể
nào phân biệt đư ợc giới tính. Lúc đó, phải mất nhiều thời gian để tìm ra qui trình.
Chính vì thế, đề tài này sẽ sử dụng các nguồn mẫu như cơ, lông bò để thiết lập qui
trình chẩn đoán giới tính. Khi tạo được phôi bò, lúc đó sẽ dùng qui trình này để xác
định giới tính phôi tạo ra. Đó chính là ý nghĩa cấp thiết của đề tài.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1 .2.1 Mục tiêu
Tìm ra qui trình PCR phù hợp để xác định giới tính của các giống bò ta Vàng,
lai Sind và bò sữa Hà Lan d ựa trên sự khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt giới tính đực.
1 .2.2 Yêu cầu
- Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông của 3 giống bò (ta Vàng, lai Sind và bò sữa
Hà Lan).
- Xác định chu trình nhiệt cho qui trình PCR thành công.
- Thử nghiệm loại Taq polymerase dùng trong qui trình PCR.
- Ứng dụng qui trình PCR tìm được đ ể xác định giới tính ba giống bò ta Vàng,
lai Sind, và sữa Hà Lan.
- 12
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 KHÁI QUÁT VỀ NGUỒN MẪU CHIẾT XUẤT DNA
2 .1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò
Hiện tại, ở nước ta có rất nhiều giống bò đ ược nuôi. Tuy nhiên, số lượng của
mỗi giống thì rất khác nhau (Nguyễn Trọng Tiến và ctv, 2001). Chủ yếu là những
giống sau:
- Bò ta Vàng: có nguồn gốc trong nước; lông có màu vàng, vàng nh ạt hoặc vàng
đậm; nhỏ vóc, năng suất thấp, trọng lư ợng khoảng 160 - 220 kg.
- Bò lai Sind: tạo ra từ việc lai giữa b ò gốc Ấn Độ nhập vào Việt Nam lâu đời
với bò trong nước. Bò có lông m àu nâu cánh dán đến đậm, u vai cao, yếm rộng, trọng
lượng khoảng 200 - 400 kg. Bò cái thường được dùng làm nền để phối với các bò đ ực
tốt từ nư ớc ngo ài về.
- Bò sữa Hà Lan: thường là d ạng bò lai từ bò Holstein Friesian có nguồn gốc Hà
Lan với bò trong nước (lai Sind). Bò có màu đen lẫn đốm trắng, trọng lượng trung
bình 200 - 500 kg, kh ả năng cho sữa 15 - 20 lít / ngày.
Ở Việt Nam, bò nuôi có tỷ lệ đậu thai thấp (60%). Hơn nữa, bò cái ở Việt Nam
có vóc nhỏ nên khó phối với bò đ ực ngoại vóc lớn. Vì vậy, để có bò cái n ền cần làm
cho chúng lớn vóc lên. Đây là vấn đề rất lâu dài và khó khăn trong công tác giống.
2 .1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA
2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò
Cơ được sử dụng trong quá trình ly trích DNA là cơ vân. Tế b ào cơ vân là
dạng tế b ào đa nhân nên lư ợng DNA ly trích được từ cơ rất nhiều. Protein trong cơ vân
chủ yếu là actin, myosin và myoglobin. Trong đó, m yoglobin là lo ại protein thuộc
nhóm chromoprotein giúp tạo màu đỏ trong bắp thịt (Nguyễn Phước Nhuận và ctv,
2003). Myoglobin được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị globin gắn với 1 nhóm heme. Dù là
một loại protein phức tạp nhưng nó d ễ bị phân cắt bởi các proteinase vì trong cấu trúc
của nó không có liên kết disulfide.
2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò
Ở thú hữu nhũ, lông là một dạng cấu trúc phối hợp với da để tạo bề mặt phủ
bên ngoài cơ th ể. Lông xuất phát từ nang lông, có nguồn gốc từ lớp bì. Xét về cấu trúc
- 13
cắt ngang, lông gồm có 3 lớp: lớp ngoài gọi là lớp sừng, được cấu tạo từ những tế bào
ch ết; kế đến là lớp vỏ tạo m àu sắc cho lông nhờ sắc tố melanin; trong cùng là lớp tuỷ.
Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa
khỏi gốc thì m ức độ keratin hoá càng mạnh, các tế b ào mất dần DNA của mình và trở
thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lông có chứa rất nhiều tế bào còn sống
(Frandson và ctv, 1969).
Theo Nguyễn Ph ước Nhuận và ctv (2003), keratin là một loại protein cứng
thuộc nhóm albuminoid (scleroprotein) có đặc tính không tan trong các dung dịch
trung tính, chỉ hoà tan trong các dung d ịch acid lo ãng hay kiềm tính. Theo Lê Th ị Mỹ
Phước và ctv (2002), keratin có trọng lượng phân tử khoảng 600.000 đơn vị carbon.
Thường có 2 dạng keratin là α-keratin và β-keratin. α-keratin có cấu trúc vòng với
nhiều liên kết cystine. Trong khi đó β-keratin có cấu trúc phiến xếp nếp. Nét đặc biệt
của keratin là hàm lư ợng cystine rất cao nên giữa các mạch polypeptide có nhiều liên
kết ngang disulfide. Vì vậy keratin có tính bền vững cao và có cấu trúc cấp hai rất khác
nhau. Chính vì lý do đó, chúng khó bị phân cắt bởi các enzyme proteinase không
chuyên biệt.
Ngoài keratin, melanin cũng là một loại protein khó bị loại khỏi DNA cần
tách chiết. Melanin có 3 loại chính là eumelanin (sắc tố nâu đen), phaomelanin (sắc tố
nâu đỏ) và allomelanin (sắc tố đen) (AIP congress, 2002). Màu sắc của lông tùy thuộc
vào lo ại melanin có trong lớp vỏ của lông. Đôi khi lớp vỏ bị mất hết melanin làm cho
lông có màu trắng. Sự hiểu biết về melanin cho đến nay không nhiều lắm. Người ta
thường đề cập đến melanin ở dạng polymer sinh học tự nhiên. Nhiều đặc tính hoá học
của melanin chưa được biết rõ nên rất khó cho việc tìm cách tách melanin ra khỏi dung
dịch chứa DNA mẫu.
Theo như trên, lông với cấu trúc đặc trưng của nó là chứa rất nhiều keratin
và melanin nên sẽ tạo nhiều khó khăn trong việc ly trích và tinh sạch DNA.
2.2 CƠ SỞ XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH
2 .2.1 Lịch sử khám phá cơ chế xác định giới tính tự nhiên ở động vật
Từ xưa, giới tính đ ược quan niệm là do sức nóng của tinh dịch và cái lạnh của
tử cung xác định. Dần dần, quan điểm n ày được bổ sung th êm các yếu tố ảnh hưởng từ
môi trường như dinh dưỡng, tuổi cha mẹ, thời gian giao phối,… Sau này, công trình
của Mendel (1900) và sự khám phá ra NST giới tính (Mc Clung, 1902) đ ã xác nhận
- 14
vai trò của NST giới tính trong xác định giới tính. Tuy nhiên, ở một số loài, có ảnh
hưởng của môi trường trong việc xác định giới tính (Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh
Thùy Dương, 2000). Năm 1905, Wilson cho rằng cặp NST giới tính tạo n ên sự khác
biệt giữa cá thể đực và cái (Phạm Thành Hổ, 2000).
Tiếp theo đó, nhiều công trình khoa học đ ã được tiến h ành để tìm ra cơ chế xác
định giới tính (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Lan, 2002). Năm 1916, Bridges chứng
minh ruồi giấm (Drosophila) có giới tính xác định dựa trên số lượng NST X dù NST Y
có hiện diện hay không. Năm 1923, Painter chứng minh sự hiện diện của NST X và Y
ở người về mặt tế b ào học. Năm 1959, Welshons và Russeell đã xác đ ịnh vai trò thiết
yếu của NST Y trong sự quyết định giới tính của phôi động vật hữu nhủ. Sau đó,
Jacobs phát hiện phôi động vật hữu nhũ sẽ phát triển thành con đực nếu mang NST Y,
còn Ford và Welshons cho rằng nếu phôi đó thiếu NST Y th ì sẽ phát triển th ành con
cái. Đến 1983, Whashburn và Eichcher chứng minh được quá trình biệt hoá giới tính
cần có sự tham gia của cả các gen trên NST X, Y và nhiều gen khác trên NST sinh
dưỡng.
Ngày nay, ngư ời ta đang tìm nh ững gen nằm trên NST Y mà sản phẩm của
chúng điều khiển trực tiếp hoặc gián tiếp toàn bộ bản chất giới tính ở động vật. Những
gen đó được gọi chung là TDF - testis determining factor (yếu tố xác định tinh ho àn).
2 .2.2 Sơ lược về NST giới tính
Ở động vật hữu nhủ, giới tính được xác định theo cơ chế di truyền. Trong phần
lớn các lo ài, cá thể cái có bộ NST đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ NST dị hợp
(2n, XY). Theo Chiarelli và ctv (19 60), Sasaki và Makino (1962), ở loài bò, mỗi cá thể
có số NST đ ơn bội là 60 (trích d ẫn bởi Eldridge, 1985).
Trong bộ NST của động vật hữu nhủ, NST X thường có kích thước lớn hơn các
NST sinh dưỡng (có kích thước trung bình). Chúng chứa khoảng 5% số gen của bộ
gen. Trong khi đó, NST Y thường nhỏ hơn các NST sinh dưỡng và có kích thước nhỏ
nhất. Người ta ước chừng trên NST X có kho ảng 1000 gen, còn trên NST Y có khoảng
330 gen. Cả hai loại NST này đ ều rất cần cho sự phát triển và hoạt động b ình thường
của cơ quan tạo giao tử (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Lan, 2002).
Theo Burgoyne (1998), NST X và Y có một vùng trình tự tương đồng với kích
thước khoảng 2600 kb tại đầu cuối vai ngắn của NST, được gọi là vùng giả NST -
Pseudo autosomal region (PAR). Trong xác định giới tính, các gen nằm trên vùng
- 15
PAR của 2 NST X và Y cùng với các gen đặc biệt của NST Y nh ưng nằm ở vùng trình
tự không bắt cặp với NST X đóng vai trò rất quan trọng.
Sau đây là một số gen quan trọng trong việc xác định giới tính.
2.2.2.1 Các gen trên NST Y
- Gen zfy (zinc finger, Y)
Năm 1987, Page và ctv đã khám phá ra gen zfy trên người. Bằng phân tích sự
chuyển vị NST ở nam XX và nữ XY, các nhà khoa học này đã tìm thấy một đoạn xác
định tinh hoàn trên vùng giả NST của NST Y (Yp 11.32). Trong vùng này có một gen
với tính bảo toàn cao gọi là zinc finger Y hay zfy m ã hoá cho một protein gắn kết
DNA. Gen này giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt tinh trùng trong quá trình sinh tinh. Tương
ứng với zfy, trên NST X cũng có vùng zfx (Xp22.12) có th ể liên kết chéo với zfy trên
NST Y. Lúc này, người ta nghĩ nó là TDF (trích d ẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy zfy không phải là TDF.
Người ta phát hiện protein ZFY có biểu hiện ở tế bào giao tử (đây là những tế bào
không cần biệt hoá tinh hoàn) và những trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếu zfy được
tìm thấy ở những người đ àn ông XX (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Koopman và ctv (1991) đã kh ẳng định zfx / zfy không là yếu tố biệt hoá và xác định
giới tính chủ yếu ở động vật hữu nhũ mà chúng chỉ là một trong số các nhóm gen tham
gia tích cực vào quá trình này. Ngày nay, người ta thường sử dụng zfy như là một chỉ
thị cho NST Y trong việc sàng lọc giới tính (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên,
2003).
- Gen sry ( sex determining region, Y)
Năm 1959, các nhà khoa học đ ã khám phá NST Y có mang sry ở cả người và
chuột. Năm 1966, người ta đã xác định vị trí của sry nằm trên vai ngắn của NST Y.
Cuối thập niên 80, người ta đ ã xác định được sry nằm trên vùng 1 của vai ngắn NST Y
(Yp 11.3). Năm 1990, Sinclair và ctv đã phân lập gen sry từ khu vực trên (trích d ẫn bởi
Josso và ctv, 2003).
Gen sry đóng vai trò chủ đạo cho việc xác đ ịnh giới tính ở động vật hữu nhũ
và người. Nhân tố này điều khiển sự biệt hoá tuyến sinh dục của phôi thành tinh hoàn
chứ không phải buồng trứng. Sau đó, tinh hoàn sản xuất các hormone sinh dục đực
ch ịu trách nhiệm cho sự thể hiện các đặc tính thứ cấp của cá thể đực (trích dẫn bởi
Hu ỳnh Thị Lệ Duyên, 2003).
- 16
H ình 2.1: Sự phân bố các gen trên NST X và Y
(Nguồn: Josso và ctv, 2003)
Cho đến nay, sry đ ược xem như là yếu tố đóng vai trò chủ đạo trong việc xác
định giới tính ở động vật hữu nhũ và người.
Ở động vật hữu nhũ , sự phát triển tinh ho àn của phôi phụ thuộc vào sự biểu
hiện của gen xác định giới tính sry. Xét về mức độ hình thái học, sự hình thành các
ống dẫn tinh và sự biệt hoá các tế bào Sertoli cũng như tế bào Leydig là những đặc
điểm đặc trưng cho thấy sự biểu hiện gen sry trong tuyến sinh dục b ình thường của
một cá thể có bộ NST dị hợp XY (Parma và ctv, 1999; trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ
Duyên, 2003). Xét về mức độ phân tử, sry là một gen thuộc họ HMG box (high
mobility group) mã hoá cho họ protein có khả năng gắn kết mạnh với DNA. Chính vì
vậy, sry đ ược xem như là công tắc đóng mở di truyền cho các chương trình biệt hoá
giới tính liên quan đến một số gen khác (Haqq và Donahoe, 1998). Do đó, sry ho ạt
động trong những dòng tế bào hỗ trợ cho sự biệt hoá giới tính để hướng sự biệt hoá
của chúng thành tế b ào Sertoli hơn là thành những tế b ào hạt đặc thù của buồng trứng.
Ở n gười khi cắt bỏ một đoạn giữa sry ORF (open reading frame) và trung thể
thì thấy có sự giảm sút biểu hiện gen sry (ở mào niệu sinh dục) và dẫn đến sự đảo giới
- 17
(Mc Elreavey và ctv, 1992; Capel và ctv, 1993; Ma và ctv, 1993; Laval và ctv, 1995;
trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Ngoài những chứng cứ trên, người ta còn xét th ấy rất nhiều đặc điểm về mô
học, sinh hoá và sinh học phân tử chứng minh sry là một TDF chủ yếu (Haqq và
Donahoe, 1998; Delbridge và Marshall Graves, 1999; Josso và ctv, 2003). Ngoài ra,
trên NST Y còn có chứa một số gen như a mh (anti-mullerian hormone), wt1 (Wilm’s
Tumor supressor gene), azf (Azoospermia factor),…là những gen có vai trò hỗ trợ cho
quá trình biệt hoá giới tính đực của cá thể. Ngày nay, các nhà khoa học đang quan tâm
nghiên cứu các gen đó để làm rõ hơn cơ ch ế xác đ ịnh giới tính.
2.2.2.2 Các gen trên NST X
- Nhóm gen sox (SRY - liked HMG box)
Đây là nhóm gen hiện diện trên NST X. Chúng có hơn 20 thành viên, ký hiệu
là sox1,…, sox20. Trong đó gen sox3 và sox9 có tương tác mật thiết với gen sry trong
cơ ch ế xác định giới tính ở động vật hữu nhũ.
Ở người, sự đột biến sox9 dẫn đến chứng rối loạn tạo cơ quan sinh dục sơ
khai. Theo đó, protein SOX9 được biểu hiện ở thời điểm mà mào niệu sinh dục đang
phát triển để phối hợp cùng với p rotein SRY trong việc xác định giới tính. Nh ững tế
bào Sertoli biểu hiện protein SRY th ì biểu hiện mạnh protein SOX9 (Campel và ctv,
1995; Tommerup và ctv, 1993; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Ở n gười nữ, sox3 ức chế sox9. Do đó, sự biệt hoá giới tính đực không xảy ra.
Kh ả năng này có đư ợc do bởi các gen sox cũng có bản chất là HMG box nên có thể
gắn kết DNA. Ở người nam, gen sox3 lại bị ức chế bởi protein SRY nên gen sox9 ho ạt
động b ình th ường và giúp biệt hoá giới tính đực. Chính vì vậy, sry được xem nh ư là
một tác nhân xác định giới tính gián tiếp. Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có giả thuyết
cho rằng sry xác định giới tính trực tiếp. Do vậy, việc này vẫn còn nằm trong sự bàn
cãi (Foster và Graves, 1994; trích d ẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999).
- Gen dax - 1 (Dosage - sensitive sex reversal - adrenal hypoplasia congeneital
critical region X chromosome 1: vùng nằm trên NST X gây ra sự giảm bẩm sinh số tế
bào tuyến thượng thận nên làm biến đổi giới tính)
Gen dax - 1, một thành viên của nhóm yếu tố phiên mã hormone steroid liên
quan đ ến yếu tố sinh steroid 1, chịu trách nhiệm về bệnh AHC (adrenal hypoplasia
congenita). Người ta xác định dax - 1 n ằm ở khu vực Xp 21.3 - 22.11 m à sự nhân đôi của
- 18
nó sẽ dẫn đến hiện tượng đảo giới từ nam thành nữ. Khu vực đó được gọi là DSS
(dosage - sensitive sex reversal) (Muscatelli và ctv, 1994; Zanaria và ctv, 1994; trích
dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Gen dax - 1 cũng tương tác với sry trong giai đoạn đầu của sự xác định giới
tính ở động vật hữu nhũ. Tuy nhiên, ở n am, gen sry ức chế dax - 1 làm sự biệt hoá giới
tính đực xảy ra. Khi nào biểu hiện của dax - 1 vượt qua sry thì sự đảo giới xảy ra. Còn
ở nữ, dax - 1 ho ạt động nh ư là một yếu tố kháng tinh hoàn (Jimenez và Burgos, 1998;
trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999).
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH
Cho đến nay, đã có rất nhiều phương pháp xác định giới tính động vật. Mỗi phương
pháp đ ều có ưu và khuyết điểm riêng. Tùy vào mục đích m à ta tận dụng ưu điểm của
phương pháp đó để đạt được th ành công cao nhất. Sau đây là một số phương pháp xác
định giới tính phôi (trích dẫn bởi Van Vliet và ctv, 1989).
2 .3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST
Cơ sở của phương pháp này là sự biểu hiện hoạt động của các gen trên NST X
trong việc m ã hoá các enzyme, làm cho nồng độ enzyme con cái (XX) cao hơn nồng
độ enzyme con đực (XY). Tuy rằng để cân bằng hoạt động các gen, NST X có những
sự ức chế để chỉ còn một NST X biểu hiện gen ở con cái, nhưng sự ức chế chỉ thể hiện
ở một giai đoạn nhất định nào đó. Trước khi đến giai đoạn đó, nồng độ enzyme của 2
loại phôi sẽ khác nhau. Dựa trên cơ sở n ày, Williams và ctv (1986), Monk và ctv
(1988) đã phân biệt những phôi trước khi chuyển cấy từ những con chuột siêu bài
noãn.
Ở phương pháp của Williams và ctv, phôi dâu (morula) đ ến phôi nang
(blastocyst) được kiểm tra hoạt tính của enzyme liên kết NST X (glucose 6 phosphate
dehydrogenase - G6PD) một cách trực tiếp. Còn với phương pháp của Monk và ctv,
các tế bào đơn của phôi đ ược phân tách từ phôi 8 tế bào và đư ợc kiểm tra hoạt tính
enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) liên kết NST X. Cả hai
phương pháp đ ều kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST sinh dưỡng như m ẫu đối
chứng để hạn chế sự thay đổi do biến d ưỡng phôi. Kết quả được đọc dựa theo màu
đậm nhạt (đậm là con đực, nhạt là con cái).
Phương pháp n ày có m ột số hạn chế. Phương pháp của Williams và ctv có tính
độc đối với phôi vì nhuộm m àu trực tiếp lên phôi. Phương pháp của Monk và ctv cải
- 19
thiện đ ược khuyết điểm trên nhưng lại dùng hạn chế đối với phôi dâu nén hoặc phôi
nang (không tách được tế b ào phôi đơn). Hạn chế khác là giai đoạn bất hoạt một NST
X để tạo sự cân bằng trong biểu hiện gen ch ưa được biết chính xác nên có thể dẫn đến
ch ẩn đoán sai lầm. Cuối cùng, đôi khi mRNA được tạo ra và tích trữ ở đó mà chưa
biểu hiện protein. Đến khi mRNA b iểu hiện th ành protein thì m ới được đánh giá. Do
vậy, hoạt tính enzyme lúc n ày là sự tích trữ hoạt động của bộ gen từ trư ớc mà không
phải là hoạt động của chính nó lúc đó. Vì vậy, kết quả có thể sai lệch.
Tuy nhiên, phương pháp này giúp xác định một trong những chỉ tiêu đánh giá sự
sống sót của phôi khi nghiên cứu ở các phương pháp khác.
2 .3.2 Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguy ên chuyên biệt giới tính
Năm 1971, Golberg và ctv đã báo cáo một phương pháp huyết thanh học đối với
kháng nguyên H - Y (histocompatibility Y antigen – kháng nguyên Y tương thích mô).
Kháng thể của kháng nguyên này được phân lập từ huyết thanh của những con cái
được ghép mảnh da con đực và các con này có th ể loại thải mảnh da đó.
Phương pháp d ựa trên kháng nguyên H – Y được tiến hành qua 2 cách: phương
pháp gây độc tế b ào và phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Ở phương pháp gây đ ộc
tế bào, n ếu thấy những tế bào của phôi bị dung giải khi cho vào kháng huyết thanh H -
Y và bổ thể (chỉ ở một mức độ nào đó) thì đó là phôi đực. Phương pháp này d ễ gây hư
hại phôi đực. Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phôi sẽ phản ứng với kháng
thể H - Y sơ cấp trong 30 phút. Sau đó lại tiếp tục phản ứng với một kháng thể thứ cấp
có gắn đuôi FITC (fluorescein isothiocyanate). Đánh giá giới tính phôi dưới kính hiển
vi hu ỳnh quang dựa trên sự hiện diện của đuôi FITC. Khuyết điểm của phương pháp
này là kháng th ể thứ cấp đôi khi gắn không chuyên biệt (gắn với m ảnh vỡ tế bào quanh
noãn hoàng ch ẳng hạn).
Bất lợi chính yếu của phương pháp miễn dịch là đ ộ chính xác quá thấp vì nhiều lí
do. Thứ nhất, kháng nguyên H - Y là m ột kháng nguyên tương đối yếu cho nên kháng
thể sinh ra không thể chuyên biệt một cách đầy đủ. Kết quả gây ra phản ứng chéo giữa
kháng thể với những kháng nguyên b ề mặt tế bào khác. Thứ hai, sự biểu hiện kháng
nguyên H - Y có thể không bị giới hạn độc nhất trên phôi đ ực. Thứ ba, tính chủ quan
của người làm thí nghiệm trong việc phán đoán mức độ huỳnh quang của đuôi kháng
thể.
- 20
Ngày nay, người ta cải tiến dần phương pháp này để tăng tính ứng dụng của nó vì
ưu điểm lớn nhất của nó là có th ể chuyển thành dạng kit để kiểm tra nhanh trư ớc thời
điểm chuyển phôi.
2 .3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính
Phương pháp phân tích di truyền tế bào còn được gọi là karyotyping (in nhân)
được tiến h ành bằng cách tạo sinh thiết phôi để lấy một số ít tế bào, nuôi chúng trong
môi trường có colcemid giúp các tế bào tiến tới nguyên phân. Sau đó, làm phồng tế
bào đ ể phân tán NST. Các NST sẽ được cố định và nhuộm bằng phẩm nhuộm vĩnh cửu
rồi đem quan sát dưới kính hiển vi. NST Y được tìm thấy nhờ kích thước nhỏ bé của
nó và là dị NST (King, 1984; Daiger và ctv, 1985; Picard và ctv, 1985).
Phương pháp này gặp phải h ai khó khăn. Một, ph ải có kỹ thuật cao và làm sao tạo
được nhiều tế b ào ở metaphase để NST dàn trãi rõ ràng. Hai, đòi hỏi quá nhiều thời
gian phân tích. Để giải quyết những khó khăn n ày, người ta có nhiều cách nhưng tất cả
các cách hoặc chỉ giảm áp lực thời gian hoặc chỉ tăng số tế bào ở m etaphase nhưng lại
vướng phải khó khăn còn lại.
Dù có rất nhiều cản trở cho khả năng áp dụng thương m ại đối với phương pháp
này, nhưng do độ chính xác cao của nó n ên phương pháp phân tích di truyền tế bào
thường được sử dụng để khẳng định kết quả của những kỹ thuật phân biệt giới tính
khác.
2 .3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi
Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật n ày là việc lai DNA tổng số lấy từ những tế bào
sinh thiết phôi cần xác định giới tính với trình tự DNA chuyên biệt cho NST Y đã
đánh d ấu. Kết quả lai dương tính xác định sự hiện diện của NST Y. Vì thế, phôi là
phôi đực.
Phương pháp này nhanh về thời gian và có thể tiến hành với một số ít tế bào cho
nên không tồn tại các khó khăn như phương pháp di truyền tế bào.
Đoạn dò có thể được sử dụng từ các loại bán trên thị trường hoặc chuẩn bị theo
các bước sau: phân lập NST Y, phân lập trình tự chuyên biệt Y, xác định số bản sao
trình tự và đ ịnh vị trình tự đoạn dò trên NST Y.
Khó khăn cần phải cải tiến của phương pháp này là các đo ạn dò chuyên biệt Y
thường là một phần chứ không to àn phần. Nghĩa là có thể lai với một số NST khác.
Chính vì vậy, làm giảm độ chính xác của phương pháp này. Những sự khám phá về
nguon tai.lieu . vn
