1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 3

Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 3

Kết quả được đọc dưới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau: Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng, nhân không bị trƣơng to và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam). Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam sau quá trình lai. 54 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau: Mẫu dƣơng tính: có các th

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 32

Ngày tạo 8/29/2018 9:09:44 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước

Tên tệp

Tải Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZAT... (.pdf)

Xem mẫu

  1. 54 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau: Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng, nhân không bị trƣơng to và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam). Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam Hình 4.5: Đối chứng âm Hình 4.6: Đối chứng dƣơng sau quá trên gan tụy tôm lớn, X40 trên mang tôm lớn, X10 trình lai. Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10 trên mẫu mang tôm lớn, X40
  2. 55 Nhƣ vậy sau hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu 1, 2, 3 có kết quả mô học và PCR dƣơng tính đều cho kết quả ISH dƣơng tính khi đối chứng với mẫu đối chứng dƣơng và đối chứng âm, xác suất trùng hợp giữa ba phƣơng pháp 100% (3/3). Mẫu số 3 sau khi lai cho kết quả tƣơng đối mờ có thể do trong quá trình thao tác chúng tôi rửa mẫu chƣa đƣợc sạch lắm, lát cắt mẫu trên lame sau khi lai bị dơ. Điều này cũng có thể do quá trình bắt cặp không đặc hiệu giữa probe và trình tự không phải DNA đích trong mẫu mô, tạo ra các tín hiệu nền hoặc do thời gian cắt mẫu với Proteinase K quá lâu, cũng có thể do thao tác nhuộm màu bổ sung chƣa tốt. Trong quá trình thực hiện, ta thấy mẫu đối chứng âm sau hai lần thí nghiệm đều không xuất hiện những thể kết tủa màu xanh đậm trong nhân, không bị ngoại nhiễm và cũng không có hiện tƣợng dƣơng tính giả; trên đối chứng dƣơng thì cấu trúc mô rõ ràng, tín hiệu lai thu đƣợc rất nhiều và rõ khi quan sát dƣới KHV quang học chứng tỏ rằng quá trình lai đƣợc tiến hành rất tốt và không bị ngoại nhiễm. Trên cơ sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú của phƣơng pháp này rất hiệu quả, với độ chính xác cao và kết quả thu đƣợc ổn định. Do đó, chúng tôi tiến hành ứng dụng phƣơng pháp này để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi ở các giai đoạn postlarvae và thƣơng phẩm góp phần vào việc kiểm soát và hạn chế kịp thời những tác hại do WSSV mang lại. Chẩn đoán theo phƣơng pháp này sẽ khắc phục đƣợc tính kém đặc hiệu của mô học và tránh đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính giả của PCR. IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit Theo cách bố trí này chúng tôi cũng thực hiện lại thí nghiệm trên ba mẫu tôm 1, 2 và 3 trên, đối chứng dƣơng và đối chứng âm. Ở đây, chúng tôi dùng cồn tuyệt đối (Việt Nam), xylene và paraformaldehyde (Trung Quốc) trong quy trình lai. Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau:
  3. 56 Bảng 4.9: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất ISH Mẫu Mô PCR học WSSV Lần 1 Lần 2 Mẫu dƣơng (+) và rất rõ Mẫu dƣơng (+) và rõ khi 1 + + khi quan sát dƣới KHV. quan sát dƣới KHV. Mẫu dƣơng (++), lát cắt Mẫu dƣơng (++), cấu trúc mẫu trên lame không bị mô rõ khi quan sát dƣới 2 ++ ++ trôi và rất rõ khi quan sát KHV. dƣới KHV. Mẫu dƣơng (+++), lát cắt Mẫu dƣơng (+++), cấu không bị trôi và nhuộm trúc mô rất rõ khi quan sát 3 +++ +++ màu rõ. dƣới KHV. Đối Mẫu dƣơng (+++), cấu Mẫu dƣơng (+++), cấu chứng trúc mô rất rõ và nhuộm trúc mô rất rõ và lát cắt +++ +++ dƣơng màu tốt. không bị trôi. Đối Không phát hiện tín hiệu Không phát hiện tín hiệu chứng lai, mẫu không bị nhiễm lai, mẫu không bị nhiễm - - âm bẩn và chỉ bắt màu thuốc bẩn và chỉ bắt màu thuốc
  4. 57 nhuộm bổ sung. nhuộm bổ sung. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng tiến hành lai theo trƣờng hợp này cho kết quả lai tốt trên cả ba mẫu và hai đối chứng khi quan sát dƣới KHV quang học. Kết quả thí nghiệm dựa vào phƣơng pháp ISH cho kết quả trùng hợp hoàn toàn với mô học và PCR, xác suất trùng hợp đạt đến 100% (3/3). Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu đƣợc không có sự khác biệt nhiều giữa thí nghiệm theo quy trình và hóa chất của bộ kit với thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhƣng có thay đổi một số hóa chất thông dụng rẻ tiền hơn. Đây là một bƣớc thành công mới, tạo tiền đề cho việc phát triển phƣơng pháp ISH phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Do đó, chúng tôi sử dụng các hoá chất thay thế nà y trong các thí nghiệm tiếp theo sau để giảm bớt chi phí trong chẩn đoán và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành xử lý nhanh dùng chung cho kiểm tra mô học và ISH. Mẫu đƣợc xử lý, đúc và cắt và đính trên 4 lame, hai lame dùng để nhuộm kiểm tra mô học và hai lame còn lại dùng cho ISH. Sau khi thực hiện chẩn đoán bằng mô học truyền thống và PCR cho kết quả dƣơng tính, mẫu đó sẽ đƣợc dùng để lai theo quy trình của bộ kit. Chúng tôi tiến hành trên 5 mẫu tôm postlarvae và 5 mẫu tôm thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae ISH Mô Mẫu Nhận xét PCR học Lần 1 Lần 2 Cấu trúc mô của mẫu hơi mờ 1 + + + + Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi 2 + + + + Mẫu rõ, nhuộm màu tốt 3 + + + + Mẫu lai bị mờ 4 + + + + Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ 5 + + + +
  5. 58 Đối Mẫu rõ, cấu trúc mô rất rõ khi quan chứng +++ +++ +++ +++ sát dƣới KHV. dƣơng Đối Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu chứng chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ - - - - âm sung. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thƣơng phẩm ISH Mô Mẫu Nhận xét PCR học Lần 1 Lần 2 Cấu trúc mô của mẫu rất rõ, nhuộm 1 + ++ ++ ++ màu tốt. Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi. 2 + ++ ++ ++ Mẫu rõ, nhuộm màu tốt. 3 + + + + Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ. 4 + + + + Cấu trúc mô mờ, lát cắt không bị 5 + + + + trôi. Đối Mẫu rõ, cấu trúc mô rất rõ khi quan chứng +++ +++ +++ +++ sát dƣới KHV. dƣơng Đối Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu - - - -
  6. 59 chứng chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ âm sung. Qua hai bảng kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng kết quả chẩn đoán thu đƣợc từ ba phƣơng pháp trên trùng hợp hoàn toàn với nhau. Ở hai mẫu tôm postlarvae (mẫu 1 và 4) và một mẫu tôm thƣơng phẩm (mẫu 5) khi xử lý nhanh cho kết quả lai chƣa tốt có thể do một số khâu trong quy trình xử lý mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt. Mẫu số 5 trên postlarvae và mẫu số 4 trên tôm thƣơng phẩm cho kết quả lai tốt, nhƣng cấu tạo mô không rõ có thể do ta thực hiện xử lý mẫu chƣa tốt làm hƣ cấu tạo của mô. Điều này cũng có thể do trong quá trình lai, chúng ta cắt mẫu bằng Proteinase K quá lâu hoặc thao tác cắt mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt nên cấu trúc mẫu mô không còn rõ nhƣ ban đầu. Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh Nhƣ vậy qua hai lần thực hiện thí nghiệm nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả lai đều dƣơng tính. Khi đối chiếu với kết quả lai trong trƣờng hợp mẫu xử lý theo quy trình bình thƣờng, chúng tôi nhận thấy rằng kết quả lai trong cả hai quy trình xử lý mẫu không khác nhau. Các mẫu làm theo quy trình xử lý nhanh, khi quan sát dƣới kính hiển vi đều cho kết quả tƣơng đối rõ và đẹp. Nếu làm theo quy trình xử lý mẫu nhanh thì cả quá trình xử lý mẫu chỉ mất khoảng 3 – 4 giờ thay vì trƣớc đây chúng tôi làm theo quy trình xử lý mẫu bình thƣờng mất khoảng 12,5 giờ, thời gian đƣợc rút ngắn rất nhiều nhƣng kết quả lai không khác nhau. Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy trình xử lý nhanh này trong chẩn đoán bằng phƣơng pháp ISH, giúp rút ngắn đƣợc thời gian rất nhiều.
  7. 60 Quy trình xử lý mẫu nhanh có ƣu điểm là rút ngắn đƣợc thời gian xử lý mẫu rất nhiều, tuy nhiên nó có một số nhƣợc điểm so với phƣơng pháp xử lý mẫu bình thƣờng. Mẫu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp này dễ bị hƣ cấu trúc của mô, nguyên nhân của sự cố này là do nƣớc trong mẫu mô chƣa đƣợc khử hoàn toàn làm cho mô và tế bào bị co lại hoặc làm thành phần cấu tạo trong mô bị thay đổi. Một lý do khác làm hƣ cấu trúc của mô là do cồn trong mô không đƣợc tẩy hoàn toàn, mẫu mô không trong suốt nên rất khó quan sát cấu tạo của mô dƣới kính hiển vi. Cả giai đoạn khử nƣớc và tẩy cồn ra khỏi mô nếu không đƣợc thực hiện tốt thì giai đoạn ngấm paraffin cũng bị thất bại. Do đó, khi áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh, ta phải thật cẩn thận khi thao tác, làm tốt các giai đoạn quyết định nhƣ giai đoạn chuyển từ cồn tuyệt đối qua xylene và từ xylene qua paraffin. Nếu tuân thủ đúng các bƣớc này, mẫu mô thu đƣợc sau xử lý sẽ giống với mẫu mô xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng. IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai Nếu lai theo quy trình của bộ kit thì probe phải đƣợc biến tính ở 95 0C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C cho đến khi cho lên mô lai. Khi lai, ta cho mẫu dò lên mẫu mô và thực hiện biến tính một lần nữa ở 950C trong 6 phút. Trong thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện biến tính mẫu lai và probe đồng thời trên lame ở 950C trong 6 phút. Quy trình này đƣợc thực hiện trên bàn lai có điều chỉnh nhiệt độ. Mẫu thực hiện thí nghiệm này đƣợc xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng và đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV. Thí nghiệm thực hiện nhƣ bố trí trên và thu đƣợc kết quả sau hai lần thực hiện nhƣ sau: Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên postlarvae ISH Mẫu Mô học Nhận xét PCR Lần 1 Lần 2 Mẫu rõ, lát cắt trên lame 1 + + + +
  8. 61 không bị trôi Mẫu bị dơ 2 + + + + Không phát hiện 3 + + - - Mẫu rõ, lát cắt trên lame 4 + + + + không bị trôi Mẫu rõ 5 + + + + Đối chứng Mẫu rất rõ, cấu trúc mô +++ +++ +++ +++ dƣơng giữ đƣợc hình dạng đầu. Đối chứng âm Mẫu không bị nhiễm tạp. - - - - Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm ISH Mẫu Mô học Nhận xét PCR Lần 1 Lần 2 Mẫu rõ, lát cắt trên lame 1 + + + + không bị trôi. Mẫu hơi mờ. 2 + + + + Mẫu rõ nhƣng màu bổ 3 + + + + sung nhuộm không rõ. Mẫu rõ, lát cắt trên lame 4 + + + + không bị trôi. Mẫu rõ, lát cắt trên lame 5 + + + +
  9. 62 không bị trôi. Đối chứng Mẫu lai tốt, cấu trúc mô +++ +++ +++ +++ dƣơng giữ đƣợc hình dạng đầu. Mẫu không bị nhiễm tạp, Đối chứng âm cấu trúc mô rõ và chỉ - - - - nhuộm màu bổ sung. Sau hai lần lặp lại thí nghiệm nhƣ trên, ta thấy kết quả thực hiện chẩn đoán bằng ISH theo cách biến tính mẫu và probe trên cùng một lame trƣớc khi lai nhƣ trên đa số cho kết quả trùng hợp với phƣơng pháp mô học và PCR. Chỉ có một trƣờng hợp mẫu số 3 trên tôm postlarvae cho kết quả lai ISH là âm trong khi đó kết quả mô học và PCR là dƣơng tính. Điều này có thể do mẫu dò của chúng ta đã bị bất hoạt nên không bắt cặp đƣợc với trình tự đích có trong mẫu, nhƣng khả năng này rất ít xảy ra vì trên đối chứng dƣơng chúng tôi vẫn nhận đƣợc tín hiệu lai rất tốt. Sự không phù hợp này cũng có thể do trong quá trình làm PCR bị ngoại nhiễm hoặc khi làm mô học có thể bị nhầm lẫn với một tác nhân gây bệnh khác nhƣng cũng có biểu hiện tƣơng tự nhƣ bệnh đốm trắng. Dựa vào kết quả trên, ta thấy tỷ lệ tƣơng thích của phƣơng pháp ISH thực hiện theo quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame với mô học và PCR là 90% (9/10), tỷ lệ này khá cao và chính xác. Khi so sánh với trƣờng hợp lai bình thƣờng theo quy trình của bộ kit, thì hình dạng cấu trúc mô không khác nhau giữa hai trƣờng hợp khi chúng tôi quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên mẫu mô khi thực hiện lai. Cách làm này vừa đơn giản, dễ thực hiện lại vừa tránh đƣợc khả năng gây sốc probe khi lai, probe chỉ đƣợc biến tính một lần thay vì hai lần nhƣ trong quy trình của bộ kit. IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe trước khi lai Sau khi thực hiện lai theo từng trƣờng hợp riêng rẽ, chúng tôi đều thu đƣợc kết quả rất tốt, nhƣng khi chúng tôi áp dụng đồng thời hai quy trình trên vào trong chẩn đoán thì sẽ cho kết quả ra sao? Do đó chúng tôi kết hợp cả hai quy trình trên để chẩn đoán bệnh đốm trắng, thực hiện trên 5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5 mẫu tôm postlarvae
  10. 63 có kết quả mô học và PCR dƣơng tính với WSSV. Kết quả sau hai lần thí nghiệm nhƣ sau: Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm postlarvae ISH Mẫu Mô học Nhận xét PCR Lần 1 Lần 2 Tín hiệu lai rõ, không có 1 + + + + màu nền. Cấu trúc mô rất rõ, màu 2 + + + + bổ sung nhuộm rất tốt. Mẫu rõ, lát cắt trên lame 3 + + + + không bị trôi. Mẫu bị dơ 4 + + + + Mẫu rõ 5 + + + + Kết quả lai rất tốt, cấu Đối chứng trúc mô rõ và đẹp, không +++ +++ +++ +++ dƣơng có màu nền. Mẫu không bị nhiễm tạp, Đối chứng âm - - - - chỉ nhuộm màu bổ sung. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm ISH Mẫu Mô học Nhận xét PCR Lần 1 Lần 2 Mẫu rõ, lát cắt trên lame 1 + + + +
  11. 64 không bị trôi. Mẫu hơi mờ 2 + + + + Mẫu rõ nhƣng màu bổ 3 + + + + sung nhuộm không rõ Mẫu lai tốt, tín hiệu lai 4 + + + + rõ. Mẫu rõ, không có màu 5 + + + + nền. Kết quả lai rất tốt, cấu Đối chứng trúc mô rõ và đẹp, không +++ +++ +++ +++ dƣơng có màu nền. Mẫu không bị nhiễm tạp, Đối chứng âm - - - - chỉ nhuộm màu bổ sung. Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng khi kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh và biến tính mẫu và probe trên cùng một lame khi thực hiện lai đều cho kết quả trùng hợp với kết quả của phƣơng pháp PCR và mô học. Mức độ trùng hợp giữa ba phƣơng pháp đạt 100% sau hai lần lặp lại thí nghiệm. Mẫu mô thu đƣợc sau khi lai đa số rõ nhƣng có một số trƣờng hợp mẫu mô không rõ do thao tác thực hiện chƣa tốt, hoặc do hóa chất rửa mẫu lai mất hoạt tính hay có thể do nhuộm màu bổ sung chƣa đạt yêu cầu…nhƣng những điều này không ảnh hƣởng nhiều đến kết quả lai và chúng tôi có thể khắc phục đƣợc. Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40.
  12. 65 Sau thí nghiệm này, chúng tôi có thể áp dụng cả quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame vào quy trình chẩn đoán chính thức khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú. Nhờ hai quy trình biến đổi này mà chúng tôi có thể rút ngắn đƣợc thời gian chẩn đoán mầm bệnh rất nhiều, thao tác đơn giản hơn và giảm đƣợc khả năng gây sốc probe nhƣ quy trình của bộ kit đã khuyến cáo.
  13. 66 Qua các kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi đƣa ra đƣợc quy trình lai tối ƣu để phát hiện WSSV và TSV có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Viện: Mẫu P. monodon Mẫu P. vannamei Cố định (Davidson) Cố định (R-F) Xử lý nhanh giảm thời gian Xử lý mẫu Tẩm paraffin Đúc, cắt và đính lên lame Đúc, cắt, đính mẫu Xử lý mẫu trƣớc khi lai Xử lý mẫu trƣớc khi lai Lai, thực hiện biến tính probe ở 950C trong 6 phút, giữ lạnh ở 40C. Lai, thực hiện biến tính khi lai cho dung dịch lai có probe mẫu và probe đồng thời đã biến tính lên mẫu và biến tính trên lame ở 950C trong 5 mẫu ở 700C trong 5 phút . 0 phút, ủ qua đêm ở 42 C. Rửa và phát hiện tín hiệu lai Rửa và phát hiện tín hiệu lai Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Trong đó, các bƣớc chuẩn bị mẫu lai trên hai đối tƣợng hoàn toàn giống nhau và gồm các bƣớc nhƣ: cố định mẫu, xử lý mẫu, đúc mẫu, cắt mẫu và đính mẫu lên lame dƣơng. Giai đoạn xử lý mẫu trƣớc khi lai trên mẫu tôm sú và mẫu TCT là giống nhau là mềm hóa mẫu lai bằng proteinase K (15 phút trên postlarvae và 17 phút trên tôm thƣơng phẩm). Giai đoạn lai đƣợc thực hiện nhƣ mô tả trên sơ đồ, thể tích dung dịch lai tối ƣu trong hai trƣờng hợp là 75 µl. Giai đoạn rửa và phát hiện các tín hiệu lai cũng hoàn toàn giống nhau trên hai đối tƣợng và thực hiện các bƣớc nhƣ trong quy trình của bộ kit ở mục III.5.
  14. 67 IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp mô học và PCR IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei: Các mẫu tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm có dấu hiệu bệnh đƣợc thu ngẫu nhiên từ các trại sản xuất giống và các ao nuôi thƣơng phẩm ở Phú Yên, sau khi thực hiện chẩn đoán theo quy trình của ba phƣơng pháp mô học, PCR và ISH nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH 1 - + - 2 - + - 3 - + - 4 - + - 5 - + - 6 - - - 7 - - - 8 - - - 9 - - - 10 - - - 11 - - - 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - -
  15. 68 Sau khi thực hiện thí nghiệm so sánh trên, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các mẫu đem kiểm tra đều âm tính với TSV. Nhìn chung, kết quả chẩn đoán của ba phƣơng pháp đa số trùng hợp với nhau, kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp nhau 100% (15/15). Trong số 15 mẫu trên thì có 5 mẫu đầu có kết quả PCR dƣơng nhƣng mô học và ISH đều âm tính. Hiện tƣợng không trùng hợp này có thể do hiện tƣợng dƣơng tính giả của PCR, hoặc có thể do chúng tôi thực hiện thu mẫu chƣa đảm bảo chính xác, mẫu thu đƣợc chƣa đại diện đƣợc cho cả quần thể tôm nuôi tại trại giống nên cùng một mẫu khi chia thành nhiều phần, mỗi phần thực hiện một phƣơng pháp chẩn đoán khác nhau thƣờng cho kết quả không trùng hợp với nhau. Hiện tƣợng này cũng có thể do probe bị bất hoạt nhƣng trƣờng hợp này rất ít xảy ra vì khi lai chúng tôi có thực hiện song song một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm, kết quả vẫn phát hiện tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng và đối chứng âm không bị nhiễm tạp; điều này một lần nữa khẳng định tính ổn định của phƣơng pháp ISH. Trong thí nghiệm này kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp với nhau hoàn toàn nên ta có thể nói rằng hai phƣơng pháp này có tƣơng quan với nhau, trong đó ISH có độ ổn đ ịnh và độ chính xác cao hơn mô học. IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH 1 + + + 2 + + + 3 + + + 4 + - + 5 + - + 6 + ++ + 7 + ++ - 8 + - -
  16. 69 9 + - - 10 + - - 11 - - - 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - Trên tôm lớn sau khi thực hiện thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng mức độ tƣơng đồng giữa mô học và ISH là 73,33% (11/15), giữa mô học và PCR là 66,67% (10/15) và giữa PCR với ISH là 80% (12/15). Nhìn vào tỷ lệ này, chúng tôi nhận thấy độ tƣơng thích giữa PCR với ISH tƣơng đối cao và ổn định hơn so với mô học. Tuy nhiên, cả ba phƣơng pháp trên đều có thể dùng để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm nuôi, trong đó PCR và ISH có độ chính xác, độ nhạy và ổn định hơn mô học truyền thống rất nhiều. Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu đƣợc không chênh lệch nhiều giữa ba phƣơng pháp, một số trƣờng hợp không trùng hợp giữa ba phƣơng pháp có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Trƣờng hợp mô dƣơng, ISH dƣơng và PCR âm nhƣ ở mẫu số 4 và 5. Trƣờng hợp này có thể do thao tác thực hiện RT – PCR không chính xác, cũng có thể là do lƣợng RNA tách chiết quá thấp, tạp nhiễm nhiều hay có thể do có sự hiện diện của một tác nhân ức chế phản ứng PCR nên không phát hiện đƣợc tác nhân gây bệnh trong mẫu. Ngoài ra hiện tƣợng này cũng có thể do tính đa hình của virus Taura, mặc dù tính đa hình này rất ít xảy ra nhƣng khi nó xuất hiện thì có thể gây ra hiện tƣợng âm tính giả. Trƣờng hợp mô dƣơng, PCR dƣơng nhƣng ISH âm ở mẫu số 7. Hiện tƣợng này có thể mẫu dò bị bất hoạt nhƣng điều này không thể xảy ra vì có tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng. Vì vậy, nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do hiện tƣợng ngoại
  17. 70 nhiễm khi thực hiện phản ứng PCR, tạo hiện tƣợng dƣơng tính giả; hoặc có thể do sự nhầm lẫn virus Taura với một loại virus khác khi quan sát trên tiêu bản mô học. Trƣờng hợp mô dƣơng nhƣng PCR và ISH đều âm nhƣ ở mẫu số 8, 9 và 10. Điều này có thể giải thích do sự nhầm lẫn giữa TSV với một tác nhân gây bệnh khác có biểu hiện tƣơng tự trên tiêu bản mô học. Ngoài ra, kết quả không tƣơng đồng giữa ba phƣơng pháp trên có thể do thao tác thu mẫu của chúng tôi không đại diện cho cả quần thể tôm mà chúng tôi khảo sát. B C A F E D Hình 4.11: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phƣơng pháp trên tôm lớn. Hình A: ISH dƣơng tính trên chân bơi, X10; hình B: ISH dƣơng tính trên mang, X40; hình C: ISH dƣơng tính trên phụ bộ, X10; hình D: mô học dƣơng tính trên mang, X100; hình E: ISH dƣơng tính trên gan tụy, X40; hình F: ISH dƣơng tính trên biểu mô, X10. Qua các thí nghiệm trên chúng tôi nhận thấy cả ba phƣơng pháp trên đều có thể ứng dụng vào chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, trong đó PCR và ISH có độ nhạy và độ chính xác cao hơn mô học truyền thống. Khi thực hiện chẩn đoán trên 15 mẫu postlarvae và 15 mẫu tôm lớn thì tỷ lệ dƣơng tính với TSV là 0% (0/15) đối với postlarvae và 40% (6/15) trên tôm lớn, các mẫu mà chúng tôi thu đƣợc có tỷ lệ nhiễm bệnh tƣơng đối thấp. IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon
  18. 71 Để thực hiện bố trí này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 15 mẫu tôm postlarvae và 15 mẫu tôm thƣơng phẩm có biểu hiện nhiễm bệnh nhƣ ăn ít, rớt đáy… Các mẫu này đƣợc thu tại các trại sản xuất giống và các ao nuôi tôm thƣơng phẩm ở các tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu và thực hiện chẩn đoán đồng thời các phƣơng pháp mô học, PCR, ISH. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae Mẫu Mô học PCR ISH 1 + ++ + 2 ++ - + 3 + - - 4 + + + 5 - + - 6 + + + 7 + - + 8 - + + 9 + + + 10 + + + 11 - + + 12 - - - 13 - - - 14 - - - 15 - - - Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - -
  19. 72 IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm Mẫu Mô học PCR ISH 1 +++ - +++ 2 + ++ ++ 3 + ++ ++ 4 + ++ + 5 + + + 6 + + + 7 - - - 8 - - - 9 - - - 10 - - - 11 + + - 12 + + + 13 - + + 14 - + + 15 + + + Đối chứng dƣơng +++ +++ +++ Đối chứng âm - - - Qua kết quả thực hiện chẩn đoán so sánh giữa các phƣơng pháp với nhau chúng tôi thu đƣợc một số kết quả nhất định nhƣ sau:
  20. 73 Ở tôm thƣơng phẩm thì đa số các kết quả thu đƣợc từ ba phƣơng pháp trên tƣơng đồng với nhau (mức độ tƣơng đồng giữa mô học với PCR là 80% (12/15), giữa mô học với ISH là 80% (12/15), giữa PCR với ISH là 87% (13/15) và giữa ba phƣơng pháp là 73% (11/15)); nhƣng ở tôm postlarvae thì kết quả giữa ba phƣơng pháp có chênh lệch nhau nhiều (mức độ tƣơng đồng giữa mô học với PCR là 60% (9/15), giữa mô học với ISH là 80% (12/15), giữa PCR với ISH là 80% (12/15) và giữa ba phƣơng pháp là 60% (9/15)). Mặc dù có sự khác biệt nhƣng nhìn chung, đa số kết quả chẩn đoán của ba phƣơng pháp trên đều trùng hợp với nhau, điều này giúp chúng ta thấy đƣợc độ ổn định của các phƣơng pháp này khi áp dụng trong chẩn đoán mầm bệnh trên tôm. Với kết quả phƣơng pháp PCR và ISH dƣơng nhƣng mô học âm ở mẫu số 8, 11 của tôm postlarvae và mẫu 13, 14 của tôm thƣơng phẩm. Hiện tƣợng này có khả năng do tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm WSSV trên tôm thấp, bệnh chỉ biểu hiện ở một số tế bào. Trong quá trình nhuộm mô, lát cắt mô có kích thƣớc nhỏ nên không đi qua hết các tế bào bị nhiễm bệnh nên có khả năng không tìm thấy bệnh. Ngoài ra với phƣơng pháp mô học, ta chỉ xác định đƣợc bệnh khi bệnh đã biểu hiện ra các tế bào, còn ở giai đoạn bệnh mới phát dấu hiệu bệnh lý chƣa đƣợc biểu hiện ở các bào quan thì mô học không thể định dạng đƣợc bệnh. Trong khi đó, với phƣơng pháp PCR và ISH thì chỉ cần tôm có dấu hiệu bệnh dù là ở giai đoạn đầu của qua trình nhiễm bệnh thì PCR và ISH vẫn có thể xác định đƣợc bệnh. Qua đó ta có thể nói đƣợc là phƣơng pháp PCR và ISH có độ nhạy cao hơn mô học truyền thống. Trƣờng hợp PCR và ISH âm nhƣng mô học dƣơng nhƣ ở mẫu số 3 của tôm portlarvae. Hiện tƣợng này có thể do có một tác nhân gây bệnh khác có biểu hiện bệnh lý trên tế bào tƣơng tự nhƣ dấu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng. Do đó, bằng phƣơng pháp mô học ta có thể dễ nhầm lẫn trong việc phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm sú P. monodon. Điều này khẳng định một lần nữa phƣơng pháp mô học có độ chính xác kém hơn PCR và ISH. Trƣờng hợp PCR cho kết quả dƣơng tính nhƣng ISH và mô học cho kết quả âm tính ở mẫu số 5 của postlarvae. Điều này có thể do hai khả năng. Thứ nhất là do ngoại nhiễm trong quá trình làm PCR hoặc do primer bắt cặp không đặc hiệu với DNA của tác nhân gây bệnh. Thứ hai là do mẫu dò (probe) đã bị bất hoạt nên không phát hiện
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược