1. Trang Chủ
  2. Nông - Lâm - Ngư
  3. Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: Chế Biến Thủy SảnĐại Học Cần Thơ Khoa Thủy SảnPhần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu v

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: Chế Biến Thủy SảnĐại Học Cần Thơ Khoa Thủy SảnPhần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu v

monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các riệu chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu và viêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Vì vậy Listeria monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát trong quản lý chất lượng thực phẩm. Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM – FDA (chương 10) phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và thử nghiệm hóa

Thể loại Tài liệu miễn phí Nông - Lâm - Ngư

Số trang 50

Ngày tạo 8/30/2018 3:39:07 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.28 M

Tên tệp

Tải Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sả... (.pdf)

Xem mẫu

  1. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Listeria monocytogenes có khả năng gây bệnh listeriosis với các triệu chứng như sảy thai, thai chết lưu và đẻ non, gây nhiễm trùng máu và viêm màng não đối với trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém. Vì vậy Listeria monocytogenes là một chỉ tiêu được kiểm soát trong quản lý chất lượng thực phẩm. Các phương pháp truyền thống ví dụ như ISO 11290-1:2004 hay BAM – FDA (chương 10) phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm bao gồm các bước tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và thử nghiệm hóa sinh để định danh. Quá trình này thường kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp âm tính và trên bảy ngày cho các trường hợp dương tính. Đây thật sự là một trở ngại cho việc đánh giá chất lượng nói chung và phân tích vi khuẩn gây bệnh trong sản phẩm thực phẩm vì thời gian chờ trả kết quả quá dài. Trong những năm qua, nhiều phương pháp phát hiện Listeria monocytogenes dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA, … đã được triển khai. Trong đó nhiều phương pháp đã được thiết kế theo hướng cho kết quả phân tích nhanh. Vì vậy việc ứng dụng phương pháp phân tích nhanh vào kiểm nghiệm thực phẩm là vấn đề được nhiều phòng thí nghiệm quan tâm. RAPID’L.mono là phương pháp mới khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh, dễ thực hiện, đọc kết quả phân tích dễ dàng, cho kết quả cùng lúc về Listeria monocytogenes và các loài khác thuộc Listeria spp trên cùng một đĩa môi trường chọn lọc. Vì những lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ứng dụng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono để phát hiện Listeria monocytogenes trong thực phẩm thủy sản”. 1.2. Mục tiêu của đề tài Xác định độ tương đồng của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L. mono so với phương pháp phân tích Listeria monocytogenes theo tiêu chuẩn ISO 11290-1:2004 thông qua các chỉ tiêu thí nghiệm: - Độ đặc hiệu - Độ nhạy - Độ lặp lại SVTH: Hồ Linh Phương Trang 1 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  2. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản 1.3. Nội dung nghiên cứu Để thực hiện đề tài chúng tôi dự kiến các nội dung nghiên cứu sau: 1. Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono bằng cách thử nghiệm trên mẫu gây nhiễm Listeria monocytogenes và mẫu gây nhiễm vi sinh vật khác. Trên cơ sở xác định khuẩn lạc điển hình, thử nghiệm sinh hóa điển hình (nếu có) của Listeria monocytogenes. 2. Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD) của phương pháp thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện. 3. Xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách phân tích mẫu thực phẩm thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes hay mẫu thực phẩm gây nhiễm Listeria monocytogenes nhằm đánh giá sự ổn định của phương pháp phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm. 4. Phân tích song song mẫu sản phẩm thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes bằng cả hai phương pháp: RAPID’L.mono và ISO 11290-1:2004. Kết hợp kết quả thu được từ Mục 1 – 3 để đánh giá mức độ tương đồng của phương pháp RAPID’L.mono so với phương pháp chuẩn ISO 11290-1:2004. 1.4. Thời gian thực hiện đề tài Tháng 01/2009 đến 05/2009 SVTH: Hồ Linh Phương Trang 2 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  3. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes 2.1.1. Phân loại học Theo khóa phân loại của Bergey’s (tái bản lần thứ 7), giống Listeria được xếp vào họ Corynebacteriaceae. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Stackebrandt và cộng sự (1983) về rRNA 16S, ông đã chứng minh rằng Listeria monocytogenes hoàn toàn khác biệt trong nhánh Lactobacillus- Bacillus thuộc cây phát sinh loại vi khuẩn do Woese xây dựng năm 1981. Năm 2001, Họ listeriaceae đã được tạo ra, bao gồm cả Staphylococcaceae, Bacillaceae và các họ khác. Trong phạm vi cây phát sinh loại này có sáu loại thuộc loại Listeria: L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii L.innocua và L. grayi. Loại L. grayi có hai loài phụ là L.grayigrayi và L. grayimurrayi. 2.1.2. Hình thái học Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ tiêm mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn. Khi kiểm tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng chúng là vi khuẩn Streptococci. Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể trông giống corynebacteria. Ở nhiệt độ phòng (không lớn 370C) vi khuẩn này có khả năng tạo tiêm mao (flagella), di động theo thể thức lộn nhào và tạo hình tán dù trong môi trường motility agar. Hoạt tính tiêu huyết (heamolysis) trên môi trường thạch máu được dùng làm chỉ dấu để phân biệt Listeria monocytogenes trong số các loài khác thuộc giống Listeria, nhưng đây không phải là tiêu chí để xác định loài này. Để phân biệt các loại thuộc Listeria cần thêm các đặc tính sinh hóa được thể hiện ở Bảng 2.1. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 3 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  4. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Bảng 2.1: Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria Các phản ứng phân biệt Listeria spp. Cata Gram Di Henry Man Rham Xyl Tan CAMP test TÊN LOÀI động (a) huyết S.aureus R.equi L. monocytogens + + + Xanh - + - + + - L. innocua + + + Xanh - V - - - - L. ivanovii + + + Xanh - - + + - + L. seeligeri + + + Xanh - - + (+) (+) - L. welshimeri + + + Xanh - V + - - - L. grayi loài phụ + + + Xanh + - - - - - grayi L. grayi loài phụ + + + Xanh + V - - - - murrayi V : phản ứng có thể xảy ra (+): phản ứng yếu + : >90% phản ứng dương tính -: phản ứng không xảy ra (a) tham khảo theo USFDA/CFSAN BAM- chương 10. Ghi chú: Cata: catalase, Henry: Henry illumination, Man: manitol, Rham: Rhamnose, Xyl: Xylose. 2.1.3. Đặc điểm sinh lý 2.1.3.1. Thông số phát triển Bảng 2.2: Một số thông số cơ bản của Listeria Thế nước pH tối pH cực NaCl(%) T0C tối T0C cực Nhu cầu oxy (aw) cực đại thiểu đại cực đại thiểu đại 0,92-0,95 4,6 9,6 8-12 0-2 45 Kỵ khí tùy nghi 2.1.3.2. Trong thực phẩm Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm đông lạnh, trong các sản phẩm chưa được gia nhiệt tốt, bề mặt sản phẩm đã bị tách nước. Sự phát triển của chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, pH và các loại thịt cũng như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật. 2.1.4. Khả năng chịu đựng Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng phát triển ở nhiệt độ 2 - 80C (nhiệt độ của tủ lạnh), pH tối thiểu là 4,6; chúng có khả năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân không hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic. Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong nguồn nước công cộng ở nhiệt độ 28- 300C và từ 7 đến 110 ngày ở nhiệt độ 5 đến 100C. Ở nước ao chúng có khả năng sống đến 8 tuần với nhiệt độ không SVTH: Hồ Linh Phương Trang 4 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  5. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản khí từ -260C đến 90C. Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3 tuần hoặc lâu hơn nữa. Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ và chủng vi khuẩn này. Trong môi trường chế biến thực phẩm với độ ẩm là 75% và ở 150C, hỗn hợp vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp. Có thể tồn tại hơn 75 ngày trên bề mặt thép không gỉ. Thời gian để giết chết 90% các tế bào này là 18,5 ngày. Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông khói đóng gói chân không được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 100C, trong nhiều trường hợp chúng còn gia tăng số lượng tế bào. Ví dụ: trong tôm, thịt cua, surimi và cá được bảo quản ở nhiệt độ 70C trong vòng 14 ngày, Listeria monocytogenes gia tăng đến 10.000 tế bào trên một gam sản phẩm. (Nguồn: Baron’s Medical Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof)). Khả năng chịu nhiệt của Listeria monocytogenes cũng là một yếu tố khá quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm của vi sinh vật này đối với an toàn thực phẩm. Theo cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA), khả năng kháng nhiệt của loài vi khuẩn này trên các sản phẩm thủy sản khác nhau thì không giống nhau. Listeria monocytogenes là điển hình cho vi khuẩn không sinh bào tử có khả năng kháng khá tốt các tác động có hại như đông lạnh, làm khô và gia nhiệt. 2.1.5. Phân bố, nguồn lây nhiễm Mãi đến năm 1960, người ta vẫn còn nghĩ rằng Listeria monocytogenes hầu như không liên quan đến các bệnh truyền nhiễm ở động vật và ít khi xuất hiện ở người. Tuy nhiên, trong những năm sau đó, người ta bắt đầu phân lập được nhiều loài thuộc giống Listeria bao gồm cả các loài gây bệnh như Listeria monocytogenes và L. ivanovii từ nhiều nguồn khác nhau. Đến nay vi khuẩn này được công nhận là phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Ít nhất có 42 loài động vật có vú hoang dã và thuần dưỡng, 17 loài chim bao gồm thuần dưỡng và gà chọi là nơi ẩn náo của Listeria. Có khoảng từ 5 – 10% trong số chúng ta có Listeria monocytogenes hiện diện trong đường ruột nhưng không biểu hiện bất cứ triệu chứng nào về bệnh do listeria. Listeria cũng được phân lập từ giáp xác, cá, sò, ve ký sinh và ruồi. Ngoài ra có thể phân lập vi khuẩn này từ đất, thức ăn động vật và các nguồn khác từ môi trường. 2.1.6. Đặc điểm gây bệnh SVTH: Hồ Linh Phương Trang 5 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  6. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Hiện nay theo quan điểm của Rocourt, L. ivanovii và L. monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho chuột và các động vật khác. Tuy nhiên chỉ có loài L. monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho người. Bệnh do L. ivanovii, và L. seeligeri thì rất hiếm khi xảy ra ở người. Thuật ngữ bệnh do listeria (listeriosis) bao gồm nhiều triệu chứng bệnh giống nhau ở người và động vật. Listeria monocytogenes gây bệnh ở người và động vật; L.ivanovii chỉ gây bênh ở động vật, chủ yếu ở cừu. Bệnh viêm màng não là hình thức bệnh thường gặp nhất ở động vật nhai lại. Ở những động vật còn nhỏ, thường xuất hiện nhiễm trùng nội tạng hoặc nhiễm trùng máu. Nhiễm trùng cổ tử cung ở bào thai qua đường nhau thường làm cừu và gia súc đẻ non. Tác động thật sự bệnh do Listeria ở người đến nay vẫn còn chưa sáng tỏa, vì bình thường đối với người trưởng thành khỏe mạnh, các bệnh truyền nhiễm thường ít có triệu chứng hoặc có chăng chỉ là triệu chứng cảm nhẹ. Biểu hiện lâm sàng dao động từ triệu chứng trông giống như là bệnh cảm cúm nhẹ và/hoặc viêm não và màng não. Bệnh do Listeria hầu hết chỉ xuất hiện ở phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và người suy giảm hệ miễm dịch, nhưng đối với những người khỏe mạnh cũng có thể bị ảnh hưởng. Hình thức bệnh nghiêm trọng thể hiện rõ ràng nhất là ở bệnh viêm màng não và thường đi kèm theo nhiễm trùng máu. Tuy nhiên ở phụ nữ mang thai, mặc dù triệu chứng thường xuất hiện là bệnh giống như cúm nhẹ không bị viêm màng não, nhưng dễ có khả năng thai nhi bị bệnh và dẫn đến phải phá bỏ hoặc sinh non. Ở người bệnh do listeria biểu hiện rõ ràng nhất là do L. monocytogenes thường ít xảy ra, nhưng đã xuất hiện những đợt bùng phát thành dịch. Vào năm 1981, xuất hiện đợt bùng phát liên quan đến 100 người ở Canada. Ba phần tư những trường hợp bị nhiễm bệnh là phụ nữ mang thai, trong trường hợp này có 9 thai nhi bị chết, 23 trẻ sơ sinh bị nhiễm trùng và 2 trẻ còn sống khỏe mạnh. Trong số 77 người trưởng thành không mang bầu bị nhiễm khuẩn đã biểu hiện bệnh do listeria một cách rõ ràng, tỷ lệ chết gần 30%. Nguồn bùng phát là từ xà lách trộn được sản xuất tại một nhà máy tại địa phương. Các biểu hiện bệnh do Listeria bao gồm nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm não và nhiễm trùng tử cung hoặc cổ tử cung ở phụ nữ mang thai dẫn đến khả năng xẩy thai hoặc phá bỏ thai nhi. Khởi đầu các biểu hiện này thường xuất hiện các triệu chứng tương tự như các bệnh cúm bao gồm sốt kéo dài. Có thể xuất hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, nôn mữa và tiêu chảy là những triệu chứng biểu hiện sớm bệnh nghiêm trọng do Listeria gây ra hoặc có thể là những triệu chứng thoáng qua. Các triệu chứng này có thể kéo dài hơn 12 giờ. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 6 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  7. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản 2.2. Phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogens trong thực phẩm 2.2.1. Theo ISO 11290 -1:2004 Phương pháp này (tham chiếu theo ISO 11290-1:2004) được áp dụng để định tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm dành cho người và thức ăn gia súc. 2.2.1.1. Nguyên lý Phương pháp này thực hiện qua các giai đoạn: · Tăng sinh: giai đoạn này là cần thiết vì Listeria monocytogenes thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và dễ bị tổn thương trong quá trình chế biến cùng sự tồn tại một số lượng các loại vi sinh vật khác, do đó bước tăng sinh đầu tiên rất quan trọng làm tăng sự phát triển của vi khuẩn. · Phân lập: Mục đích của giai đoạn này nhằm phân biệt vi khuẩn Listeria spp và các vi khuẩn không phải là Listeria spp. Thông qua các đặc điểm của khuẩn lạc. Do đó, môi trường phân lập có chứa các thành phần sao cho Listeia spp. có thể sinh trưởng tạo thành các khuẩn lạc rời rạc đồng thời ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn không phải là Listeria spp. tồn tại được trong giai đoạn tăng sinh. Phân lập trên hai môi trường chọn lọc ALOA, Oxford (hoặc Palcam). · Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc Listeria monocytogenes nghi ngờ sang thạch không chọn lọc để làm thuần vi khuẩn và thực hiện các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa để định danh. Khẳng định là Listeria spp. bằng các thử nghiệm Henry-illumination, catalase, nhuộm Gram, khả năng di động phương pháp giọt treo. Sau khi các thử nghiệm trên đều nghiệm đúng Listeria spp., kế tiếp khẳng định Listeria monocytogenes qua các thử nghiệm bổ sung sau: khả năng tan huyết, khả năng biến dưỡng đường, thử nghiệm CAMP, di động trong ống nghiệm tạo hình tán dù. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 7 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  8. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản 2.2.1.2. Sơ đồ quy trình phân tích theo ISO 11290-1:2004 A.Tăng sinh lần 1 25 g mẫu + 225ml Half Fraser Đồng nhất (30-60 giây) 0 (II) Ủ 30 C, 24 giờ (I) B.Tăng sinh lần 2 C. Cấy ria trên ALOA + 0,1ml dịch tăng sinh lần 1 Palcam hoặc Oxford + 10ml Fraser Ủ 370C, 48 giờ Ủ 370C, 24-48 giờ C. Cấy ria trên ALOA + D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford Palcam hoặc Oxford E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB Ủ 370C, 24-48 giờ Ủ 250C, 8-24 giờ (TSYEB) Ủ 370C, 24 giờ (TSYEA) D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford F. Khẳng định: E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang - Henry illumination TSYEA, TSYEB - Catalase - Gram - Tan huyết Ủ 250C, 8-24 giờ (TSYEB) - Khả năng sử dụng đường Ủ 370C, 24 giờ (TSYEA) Xylose, Rhamnose - Thử nghiệm CAMP F. Khẳng định - Di động G. Đọc kết quả G. Đọc kết quả Hình 2.2.1.2: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004 Quy trình (I) và (II) thực hiện song song nhau. Nếu quy trình (I) cho kết quả dương tính thì ngưng không tiếp tục thực hiện quy trình (II), nếu quy trình (I) cho âm tính thì phải tiếp tục quy trình (II). Thời gian cho kết quả của phương pháp từ 4- trên 7 ngày. 2.2.1.3. Thuyết minh quy trình phân tích A. Tăng sinh lần 1: Cân 25gam mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml Half Fraser. Đồng nhất mẫu trong khoảng 30-60 giây tùy theo đặc điểm của mẫu. Ủ dịch mẫu trong tủ ủ ở 30 ± 10C trong 24 ± 2giờ. Sau bước tăng sinh lần 1 thực hiện hai quy trình (I), (II). SVTH: Hồ Linh Phương Trang 8 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  9. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản B. Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml từ dịch tăng sinh lần 1 sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường Fraser để tăng sinh lần 2. Ủ ống nghiệm trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. C. Cấy ria trên ALOA, Oxford hoặc Palcam: Dùng que cấy kim loại hoặc que cấy nhựa vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lần 1 theo quy trình (I) và dịch mẫu tăng sinh lần 2 theo quy trình (II) sang môi trường thạch ALOA và Oxford hoặc Palcam sao cho khuẩn lạc mọc rời, ủ trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ. D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford hoặc Palcam. Thường sau 24 giờ ủ phải kiểm tra. Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ tiếp 48 giờ. Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên các loại môi trường thạch. E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ Listeria monocytogenes trên mỗi loại môi trường phân lập dùng que cấy lấy ½ khuẩn lạc cấy ria trên môi trường TSYEA (ủ ở 37 ± 10C trong 18-24 ± 2 giờ) và ½ khuẩn lạc còn lại cấy vào TSYEB (ủ ở 25 ± 10C trong 18- 24 ± 2 giờ). F. Khẳng định - Thử nghiệm Henry-illumination Kiểm tra khuẩn lạc Listeria spp bằng nguồn sáng trắng, kiểm tra khuẩn lạc theo hướng vuông gốc với đĩa thạch hoặc trực tiếp bằng mắt thường hoặc qua kính hiển vi phân tích (có gương riêng) hoặc kính hiển vi có độ phân giải thấp. Nguồn sáng chiếu vào đĩa thạch với góc nghiêng 450, quan sát theo hướng vuông góc với đĩa thạch. Trên môi trường TSYEA khuẩn lạc Listeria spp. điển hình qua nguồn ánh sáng trắng có màu xanh óng ánh (xanh xám đến xanh). - Thử nghiệm Catalase + Thực hiện: Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng sau 18-24 giờ ủ. Chuyển sinh khối lên miếng lam. Nhỏ lên sinh khối một giọt H2O2 3% (dùng ống nhỏ giọt hoặc pipette Pasteur). Quan sát nhanh sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả. Bỏ miếng lam vào dung dịch khử trùng. + Kết quả: Dương tính khi có hình thành bọt khí (O2). Âm tính khi không có hình thành bọt khí. - Nhuộm Gram (thử nghiệm KOH) SVTH: Hồ Linh Phương Trang 9 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  10. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Thử nghiệm KOH dùng để phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm: nhỏ 1-2 giọt KOH 3% lên lam kính, sau đó lấy khuẩn lạc đã được làm thuần từ TSYEA trộn vào thuốc thử KOH trên lam. Sau khi trộn nếu gặp hiện tượng đặc quánh kéo thành dây thì dùng khuyên cấy nhích lên là phản ứng dương tính và ngược lại là phản ứng âm tính. Vi khuẩn gram (-): thử nghiệm KOH dương tính Vi khuẩn gram (+): thử nghiệm KOH âm tính Listeria spp cho phản ứng gram (+) - Thử tính di động ü Khả năng di động phương pháp giọt treo: Lấy một khuyên dịch từ TSYEB đặt lên lamem và quan sát dưới kính hiển vi. Listeria spp là những tế bào hình que, mảnh, ngắn và thể hiện những chuyển động xoay quanh trục thân thành từng đợt (luân phiên nghĩ và động) rất đặc trưng. ü Thử tính di động trong ống nghiệm: Lấy vi khuẩn đã được làm thuần từ TSYEA đâm sâu vào thạch của ống nghiệm chứa môi trường Motility agar. Ủ ở 250C ± 10C trong 48 giờ. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường cấy đâm sâu. Thử nghiệm là dương tính khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm môi trường có màu đỏ cam và tạo hình tán dù. - Thử nghiệm tan huyết Dùng que cấy ria lấy sinh khối từ khuẩn lạc trên môi trường làm thuần TSYEA cấy ria lên đĩa thạch Blood Agar. Ủ đĩa trong tủ ở 37 ± 10C trong 24 ± 2 giờ. Kết quả: Listeria monocytogenes cho thấy vùng sáng, trong và hẹp (dung huyết beta) - Thử nghiệm sử sụng đường Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSYEB cấy lần lược sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Xylose và sang các ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Rhamnose. Ủ các ống trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ. Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng. Âm tính khi dung dịch đường không đổi màu. Listeria monocytogenes Xylose (-), Rhamnose (+). - Thử nghiệm CAMP SVTH: Hồ Linh Phương Trang 10 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  11. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Cấy ria 2 đường chủng vi khuẩn S.aureus và Rhodococcus equi theo các đường thẳng đứng song song, cách nhau 4 cm trên mặt thạch máu cừu. Sau đó cấy ria thẳng góc ở giữa các chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes đã được làm thuần từ TSYEA lên thạch máu, gần như không chạm vào 2 đường cấy S.aureus và Rhodococcus equi khoảng 1-2mm. Cấy đồng thời các chủng chứng L.monogenes, L.innocua, L.ivanovi để kiểm tra trên cùng một đĩa. Ủ ở 370C ± 10C trong 18- 24h. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết phát triển ngay tại ranh giới giữa chủng cần thử với các chủng R.equi và S.aureus. Phản ứng CAMP (+) với R.equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng 5-10mm và có hình dạng đầu mũi tên, phản ứng (-) vùng tan huyết yếu và nhỏ (khoảng 1mm). Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn. Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và CAMP (-) với R.equi. G. Đọc kết quả: Phát hiện hay không phát hiện Listeria monocytogenes trong 25 gam mẫu. 2.2.2. Phương pháp phân tích nhanh trên RAPID’L.mono theo AOAC Môi trường RAPID’L.mono sản xuất bởi phòng thí nghiệm Bio-Rad 2000 Alfred Nobel Drive Hercules, Ca 94547. RAPID’L.mono là môi trường được thiết kế đặc hiệu nhằm phát hiện enjyme phospholipase trong Listeria monocytogense và Listeria monocytogens không sử dụng Xylose. Sau 24 giờ nuôi cấy, Listeria monocytogenes thể hiện khuẩn lạc có màu xanh dương không có quầng màu vàng xung quanh. Khuẩn lạc được thể hiện ở những chủng loài khác của Listeria spp. là màu trắng có hoặc không có quầng màu vàng xung quanh. Khuẩn lạc của Listeria ivanovii có màu xanh dương - xanh lá cây có quầng màu vàng xung quanh (Xylose (+)) Các chất hòa tan có tuyển chọn trong môi trường RAPID’L.mono cho phép ức chế hầu hết các loại vi sinh vật khác. 2.2.2.1. Nguyên lý RAPID’L.mono là môi trường nuôi cấy cơ bản dựa trên phản ứng chất tạo sắc. - Hoạt động của một enzyme đặc hiệu cho phép dò tìm ra Listeria monocytogenes, chất nền tạo sắc là phospholipase tạo khuẩn lạc có màu xanh. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 11 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  12. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản - Sự lên men đường cho phép phân biệt các loài Listeria spp. Listeria monocytogenes âm tính với phản ứng Xylose nên không tạo quầng sáng màu vàng xung quanh khuẩn lạc. 2.2.2.2. Sơ đồ quy trình phân tích nhanh trên RAPID’L.mono theo AOAC. A. Tăng sinh A. Tăng sinh 25g mẫu + + 225ml Half Fraser 25g mẫu 225ml Half Fraser Đồng nhất (30-60 giây) Đồng nhất Ủ3000C, 24 giờ 30 C trong 24h B. Phân lập trên RAPID’L.mono B. Phân lập trên RAPID’L.mono Ủ3700C, 24 giờ 37 C trong 24h C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA. ria lên ALOA. Ủ3700C, 24 giờ 37 C trong 24h Đọc kết quả E.E. Đọc kết quả Hình 2.2.2: Sơ đồ phân trìnhnhanh tích nhanh trên RAPID’L.mono theo ’AOAC. Hình 2.2.2: Sơ đồ quy tích phân Listeria monocytogenes trên RAPID L.mono 2.2.2.3. Thuyết minh quy trình phân tích A. Tăng sinh: giống như tăng sinh lần 1 của phương pháp định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004. Ủ ở 300C trong 24 giờ. B. Phân lập trên RAPID’L.mono: dùng que cấy nhựa hoặc que cấy kim loại vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lên môi trường RAPID’L.mono. Ủ ở 370C trong 24-48 giờ. C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono. Thường sau 24 giờ ủ phải kiểm tra. Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ tiếp 48 giờ. Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên RAPID’L.mono. D. Khẳng định: chọn khuẩn lạc điển hình của Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono cấy ria lên ALOA, ủ ở 370C trong 24 giờ, hoặc khẳng định theo phương pháp ISO 11290-1:2004. E. Đọc kết quả trên ALOA dựa vào màu sắc điển hình của khuẩn lạc. Kết luận có hay không có Listeria monocytogenes trong 25 gam mẫu. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 12 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  13. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản 2.3. Một số môi trường chính. 2.3.1. Môi trường Half Fraser Broth (HF) a) Fraser Listeria Base Broth (Merck, 1.10398.0500) Thành phần môi trường (gam/lít) - Proteose peptone 5,0 - Peptone from casein 5,0 - Yeast extract 5,0 - Meat extract 5,0 - Sodium chloride 20,0 - Di-Sodium hydrogen phosphate 9,6 - Potassium dihydrogen phosphate 1,35 - Esculin 1,0 - Lithium chlorite 3,0 b) Supplement selective ( Merck, 1.10399/2) Thành phần môi trường - Sodium salt of nalidixic acid - Sodium hydroxide - Acriflavine hydrochloride solution c) Ammonium Iron (III) citrate (Merck,1.10399/1) Cách pha chế môi trường Half Fraser (HF) Cân 55gam Fraser Listeria Base Broth cho 1000ml nước cất. Khuấy đảo cho môi trường tan đều. Sau đó hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Trong lúc chờ thanh trùng môi trường tiến hành tan rã thành phần của một lọ nhỏ ammonium iron (III) citrate và một lọ nhỏ supplement selective trong 1ml nước vô trùng, cho hai lọ nhỏ trên vào môi trường Fraser Listeria Base Broth vừa thanh trùng sau khi đã được làm nguội dưới 500C. 2.3.2. Môi trường Fraser Borth Môi trường Fraser chứa các thành phần chọn lọc như ở tăng sinh lần 1 nhưng với hàm lượng cao hơn. Thành phần môi trường: Half Fraser Broth cộng thêm một lọ nhỏ Supplement selective (b) 2.3.3. Thạch ALOA a) Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI SVTH: Hồ Linh Phương Trang 13 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  14. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Thành phần môi trường (gam/lít) - Peptone from meat 18.0 - Peptone from Casein 6.0 - Yeast extract 10.0 - Sodium pyruvate 2.0 - Glucose 2.0 - Magnesium Glycerophosphate 1.0 - Magnesium sulphate 0.5 - Sodium chloride 5.0 - Lithium chloride 10.0 - Disodium hydrogen phosphate 25 - 5-bromo-4chlo-3-Inolyl-B-D-glycopyranosid 0,05 - Agar-Agar 13,0 b) A.L. Supplement 1 (Bio-Rad,356-4039) Thành phần môi trường - Polymixin B - Caftazidime c) A.L. Supplement 2 (Bio-Rad, 356-4040) Thành phần môi trường - Nalidixic acid - Cychloheximide - Phosphatidylinositol Cách pha chế thạch ALOA Cân 35 gam Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and AGOSTI vào 476 ml nước cất vô trùng sau đó làm tan bằng Microwave. Sau đó ủ ở bể điều nhiệt ở nhiệt độ 45-500C. Bổ sung thêm 1 chai A.L. supplement 1 và 1 chai A.L. supplement 2. Lắc nhẹ và tiến hành đổ đĩa ngay. Sau đó sấy khô bề mặt đĩa ở nhiệt độ (37-440C) A.L. Supplement 1: dạng chai nhỏ dạng bột: hút 4ml dung dịch cồn/nước = 1:1 vào Supplement 1 hòa tan. A.L. Supplement 2 dạng trai lớn dung dịch chứa 20ml. 2.3.4. Thạch Oxford a) Oxford Listeria selective Agar (base) (Merck,1.07004.0500) Thành phần môi trường (gam/lít) SVTH: Hồ Linh Phương Trang 14 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  15. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản - Peptone 23.0 - Starch 1.0 - Sodium chloride 5.0 - Agar-agar 13.0 - Aesculin 1.0 - Ammonium-iron (III) citrate 0.5 - Lithium chloride 15.0 b) Oxford Listeria Selective Supplement (Merck, 1.07006) Thành phần môi trường - Cycloheximide - Colistin sulfate - Acriflavine hydrochloride - Cefotetan - Fosfomycin - Ethanol - Pha thạch Oxford Cân 29,25 gam Oxford Listeria selective Agar (base) cho vào 500ml nước cất, hòa tan sau đó đem thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Ủ ở bể điều nhiệt ở nhiệt độ 45-500C. Sau đó bổ sung 5 ml Oxford Listeria Selective Supplement vào môi trường. Lắc đều và tiến hành đổ đĩa khoảng 15-20ml/đĩa. Oxford Listeria Selective Supplement: chứa trong chai nhỏ dạng bột phải hòa tan bằng dung dịch cồn/nước= 1:1. 2.3.5. Môi trường không chọn lọc TSYEA, TSYEB a) Trytone soya broth (Merck, 1.5459.0500) Thành phần (gam/lít) - Peptone from casein 17.0 - Peptone from Soymeal 3.0 - D(+) Glucose 2.5 - Sodium chloride 5.0 - Di- potasodium hydrogen phosphate 2.5 b) Yeast extract (Merck, 1.03753.0500) c) Agar (Merck, 1.01614.1000) Cách pha chế - TSYEA: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract, 15gam/lít Agar, 1000ml nước. Hòa tan hỗn hộp trên. Chỉnh pH hỗn hợp SVTH: Hồ Linh Phương Trang 15 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  16. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản dung dịch 7,3 ± 0,2. Sau đó hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, sau thanh trùng làm nguội ở bể điều nhiệt (45-500C). Đỗ đĩa. Chú ý đổ một lớp thật mỏng để xem Henry illumination. - TSYEB: Cân 30gam/lít Trytone soya broth, 6gam/lít Yeast extract, 1000ml nước. Hòa tan hỗn hộp trên. Chỉnh pH hỗn hợp dung dịch 7,3 ± 0,2, sau đó tiến hành đỗ vào ống nghiệm khoảng 3ml/ống. Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 2.3.6. Rhramnose, Xylose. Môi trường sử dụng Purple Broth làm nền. Sau đó bổ sung đường Rhramnose, Xylose. a) Purple Broth Base (BBLTM, 211558) Thành phần môi trường - Pancreactic Digest of Gelatin 10.0gam - Sodium chloride 5.0gam - Bromcresol purple 0.02gam b) Đường D(+)(-) Xylose (Merck, 1.08689.0100) c) Đường L(+)- Rhramnose monohydrate (Merck, 1.07361.0025) Cách Pha chế môi trường Cân 15gam/lít Purple Broth Base thêm vào 1000ml nước cất, khuấy tan dung dịch, chỉnh pH 6,8 ± 0,2. Sau đó đem thanh trùng ở nhiệt độ 1180C trong 15 phút. Làm nguội ta có chất nền purple Broth. Sau đó bổ sung đường Rhramnoes hoặc xylose bằng cách dùng nền purple broth hòa tan đường sau đó lọc qua màng lọc và cho vào nền purple broth. Phân ống 5ml/ống. 2.3.7. Môi trường thạch máu (Blood agar) Tryptic Soy Agar (TSA) (Merck, 1.05458.0500) Thành phần môi trường - Casein peptone - Soymeal pepton - Agar Pha môi trường thạch máu: Cân 40gam/lít TSA, làm tan đều và chỉnh pH 7,3 ± 0,2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, làm nguội ở bể điều nhiệt 45-470C. Sau đó bổ sung 5->7ml máu thỏ hoặc bò vào 100ml chai TSA đã làm nguội ở bể điều nhiệt. Đổ đĩa 10-15ml/đĩa. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 16 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  17. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản 2.3.8. Motility Agar Thành phần môi trường - Casein peptone - Meat peptone - Agar - Nước Pha môi trường Motility agar: Cân 22gam/lít motility agar, bổ sung 0.05gam TTC (2,3,5-Triphenyl Tetrazodium Chloride) chỉnh pH 7,3 ± 0,2. Làm tan dung dich bằng Microwave. Phân ống (5-7ml/ống). Sau đó hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. 2.3.9. Môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion) Cân 37gam/lít Brain Heart Infusion hòa tan chỉnh pH 7,4 ± 0,2. Phân ống (5ml/ống). Sau đó hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. SVTH: Hồ Linh Phương Trang 17 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  18. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Vật liệu 3.1.1. Mẫu thực phẩm Mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ các công đoạn trong quy trình chế cá tra fillet đông lạnh tại nhà máy chế biến thủy sản. 3.1.2. Môi trường, hóa chất -Canh thang Fraser Listeria selection Enrichment Broth (Merck 1. 10398.500) -Canh thang Fraser Listeria selection Enrichment Supplement (Merck 1. 10399.0001/2) -Thạch ALOA (Agar Listeria according to Ottaisani and Agosti (Biorad 356-4038) -AL supplement 1 (Biorad 356-4039) -AL supplement 1 (Biorad 356-4040) -Palcam Listeria selection agar (Merck VM 1.07004) -Palcam Listeria selection supplement (Merck VM 1.12122) -Oxford Listeria selective agar (Merck 1.07004) -Oxford Listeria selective supplement (Merck 1.07006) -Purple carbonhydrate Broth (Difco 217510 hoặc Merck 1.07361) -Xylose (BDH 305905B) -Tripptose Soya Broth (Merck 1.05459) -Yeast extract (Difco 212750) -Agar (Difco 214010) -Motility agar -Thuốc thử H2O2 30% -Thuốc thử KOH 3% hoặc bộ thuốc nhuộm gram -Thạch Blood Agar (Merck 1.10328) -Máu cừu, máu bò. -Đĩa thạch RAPID’L.mono 3.1.3. Thiết bị và vật dụng -Bể điều nhiệt 45,0 ± 1,00C -Tủ ấm: 25,0 ± 1,00C, 30,0 ± 1,00C 37,0 ± 1,00C -Thiết bị đồng nhất mẫu - Kính hiển vi Và một số vật dụng khác dùng trong phòng thí nghiệm vi sinh SVTH: Hồ Linh Phương Trang 18 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  19. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản 3.1.4. Lấy mẫu Mẫu phải đại diện cho sản phẩm không bị hư hỏng và không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển và bảo quản. 3.2. Phương pháp thí nghiệm 3.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono. a) Mục đích Xác định độ đặc hiệu của phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono với vi khuẩn Listeria monocytogenes và các chủng vi sinh vật khác không phải Listeria monocytogenes bằng phương pháp phân tích nhanh RAPID’L.mono. Phân tích trên nền mẫu cá tra nhiễm Listeria monocytogenes và các chủng vi sinh vật khác để khẳng định tính đặc hiệu của môi trường RAPID’L.mono. b) Sơ đồ thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí một cách ngẫu nhiên, nhân tố thay đổi là các chủng loại vi sinh vật. Thí nghiệm được lặp lại 10 lần. Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau đây: A1 A2 A3 A4 A5 A6 A. Tăng sinh trong BHI Ủ 370C, 8 giờ B. Phân lập trên RAPID’L.mono Ủ 370C, 24 giờ C. Đọc kết quả trên RAPID’L.mono D. Chọn khuẩn lạc điển hình khẳng định bằng cách cấy ria lên ALOA. Ủ 370C, 24 giờ E. Đọc kết quả Hình 3.2.1: Sơ đồ thí nghiệm 1 SVTH: Hồ Linh Phương Trang 19 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
  20. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành: Chế Biến Thủy Sản Khoa Thủy Sản Bảng 3.2.1. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm Mẫu Tên chủng A1 Listeria monocytogenes A2 Listeria ivanovii A3 Salmonella spp. A4 Staphylococcus aureus A5 Coliform A6 Mẫu đối chứng không chứa vi sinh vật c) Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị các chủng vi sinh vật chuẩn như Bảng 3.2.1. Các chủng vi sinh vật chuẩn được lấy từ phòng thí nghiệm của Nafiquad 6 - Cần Thơ, được bảo quản cẩn thận ở nhiệt độ 40C có nhãn ghi đầy đủ các thông tin như: tên, ký hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển. Các ống môi trường lỏng BHI đã được chuẩn bị sẵn, đánh ký hiệu lên các ống BHI tương ứng. Cấy chuyển từ ống chủng vi sinh vật chuẩn sang các ống BHI. Ủ ở 370C trong 8 giờ. Cấy ria từng chủng vi sinh vật chuẩn trong ống BHI tương ứng lên từng đĩa RAPID’L.mono tương ứng. Các bước sau thực hiện theo quy trình phân tích nhanh định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono như mô tả ở Trang 12 Mục 2.2.2.3. d) Phương pháp thu thập số liệu Quan sát khuẩn lạc trên môi trường RAPID’L.monno ở các đĩa cấy các vi sinh vật khác nhau. Có hình thành hay không hình thành khuẩn lạc, hình dạng và màu sắc khuẩn lạc. 3.2.2. Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy của phương pháp phân tích định tính chỉ tiêu Listeria monocytogenes trên RAPID’L.mono a) Mục đích thí nghiệm Xác định độ nhạy (giới hạn pháp hiện – LOD50) của phương pháp thông qua phân tích dãy nồng độ pha loãng chủng Listeria monocytogenes để tìm nồng độ thấp nhất mà phương pháp có khả năng phát hiện. . SVTH: Hồ Linh Phương Trang 20 GVHD: Th.s Phạm Văn Hùng MSSV: 2052056
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược