1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 1

Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 1

Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội. Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô cùng nguy hiểm. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGÔ QUANG HƢỞNG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk.

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 23

Ngày tạo 8/29/2018 9:09:44 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước

Tên tệp

Tải Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGÔ QUANG HƢỞNG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGÔ QUANG HƢỞNG ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006
  3. MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell. Arg. AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED OUT BY USING RFLP – PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG MSc. PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006
  4. LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. ThS. Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam. Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ - Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận - lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . KS. Nguyễn Ngọc Mai, KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng tập thể cô chú, anh - chị làm việc tại Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. ThS. Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm phân - tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận . Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH. Nông Lâm TP. HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006. Sinh viên Ngô Quang Hưởng.
  5. TÓM TẮT NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến ThS. Phan Thành Dũng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội. Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương. Nôi dung nghiên cứu: - Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola. - Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và ITS B. - Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được. Các kết quả đạt được: - Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau.
  6. - Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp. - Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I, EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy b ăng đa hình khi cắt bằng 7 loại enzyme trên. Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức độ đa dạng di truyền của quần thể n ấm này.
  7. MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................. iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Mục lục ...................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... x Danh sách các bảng .................................................................................................. xi Danh sách các hình ................................................................................................... xii 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ............................... 3 2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg trên thế giới và tại Việt Nam ................................................................... 3 2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến sự phát triển của cây cao su..................................................................... 4 2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su ........................................................ 5 2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ................. 6 2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei ..................................... 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 6 2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 7 2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora .............................................................. 8
  8. 2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều cao su trên thế giới ............................................................................... 9 Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) ...................... 10 2.3. 2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR .................................................................... 10 2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR ................................................................. 10 2.3.3.1. DNA mẫu ................................................................................. 10 2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai ............................................................... 11 2.3.3.3. Enzyme ..................................................................................... 12 2.3.3.4. Mg2+ ......................................................................................... 12 2.3.3.5. dNTPs ....................................................................................... 12 2.3.3.6. Số lượng chu kỳ ....................................................................... 12 2.3.3.7. Nhiệt độ và pH ......................................................................... 13 2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR .......................................... 13 2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR ............................................. 13 2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR ............................................... 14 2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR ............................................................... 14 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP ........................................................................ 15 2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn ......................................................... 15 2.4.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 15 2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn .............................................. 15 2.4.1.3. Các loại RE .............................................................................. 16 2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE ................................................. 17 2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) ............................. 17 2.4.2.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 17 2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP ................................ 17 2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR ............................................ 18 2.6. Giới thiệu về vùng ITS ................................................................................. 19 2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước ......................... 20
  9. 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 22 Thời gian và địa điểm tiến hành .............................................................. 22 3.1. Thời gian ....................................................................................... 22 3.1.1. Địa điểm ........................................................................................ 22 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 22 3.1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22 3.2. 3.3. Vật liệu và phương pháp .............................................................................. 22 3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối.......................................... 22 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm .................................................. 22 3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu ............................................................... 23 3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm ...................................................... 23 3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử................................................... 23 3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối .................................................... 24 3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm ............................................... 24 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm............................................... 24 3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA .................................................. 24 3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di ...................................... 25 3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích ..................................................... 25 3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR ........... 26 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm............................................... 26 3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ......................................................... 26 3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di ................. 27 3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ..................................... 28 3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm ............................................ 28 3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP .................................................... 28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 29 4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su ............................................................... 29 4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây
  10. bệnh rụng lá Corynespora................................................................... 29 4.1.2. Kết quả phân lập .................................................................................. 32 4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử ....................................................................... 32 4.1.4. Kết quả nhân sinh khối ........................................................................ 35 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm ................................................. 36 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR ........................................ 37 4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola ........ 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 46 Kết luận .................................................................................................... 46 5.1. Đề nghị ..................................................................................................... 46 5.2. 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 48 7. PHỤ LỤC ........................................................................................................... 52
  11. DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. CLFP: Corynespora leaf fall disease. centimét. cm: deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate. dNTPs: ITS: Internal Transcribed Spacer. Kb: Kilobase pair. mét. m: milimét. mm: Nu: Nucleotide. PCR: Polymerase Chain Reaction. PDA: Potato Dextrose Agar. PGA: Potato Glucose Agar. PSA: Potato Sucrose Agar. R – M: Restriction – Modification. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid. RE: Restriction Endonuclease. RFLP – PCR: Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. rRNA: ribosome Deoxyribonucleotide acid. TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate. Tm: melting Tempereture. Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam VNCCSVN:
  12. DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí cắt của nó ................................................................ 16 Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 26 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng enzyme cắt ............................................................ 28 Bảng 4.1. Tình hình nhiễm bệnh tại một số vườn trên địa bàn Lai Khê – Bình Dương ......................................................... 30 Bảng 4.2. Các dòng nấm được tách đơn bào tử........................................................ 33 Bảng 4.3. Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi............................................... 39 Bảng 4.4. Kích thước các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme giới hạn ... 44
  13. DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình dạng bào tử nấm C. cassiicola ........................................................... 7 Hình 2.2. Mô tả phản ứng RFLP .............................................................................. 18 Hình 2.3. Sơ đồ vùng ITS của nấm .......................................................................... 19 Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora ..................................................... 31 Hình 4.2. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường nhân tạo (3 ngày sau khi cấy) ................................................................................. 32 Hình 4.3. Bào tử nấm C. cassiicola .......................................................................... 32 Hình 4.4. Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm .......... 34 Hình 4.5. Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc ................................................................... 35 Hình 4.6. Kết quả li trích 24 dòng nấm khác nhau ................................................... 36 Hình 4.7. DNA tổng số đã tinh sạch ......................................................................... 37 Hình 4.8. Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) ................ 38 Hình 4.9.Sản phẩm PCR theo quy trình mới ............................................................ 39 Hình 4.10. Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III............................................................. 41 Hình 4.11. Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I ............................................................. 41 Hình 4.12. Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I ........................................................... 42 Hình 4.13. Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I ................................................................ 42 Hình 4.14. Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I ................................................................ 43 Hình 4.15. Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II .............................................................. 43 Hình 4.16. Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I ................................................................ 43
  14. PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đối với thực vật thì những tác nhân gây thiệt hại về năng suất, chất lượng chủ yếu là sâu hại, virus hoặc nấm gây ra. Trên cây cao su cũng vậy, đặc biệt là các loại bệnh do nấm và vi khuẩn. Ngay từ khi xuất hiện, bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra đã gây thiệt hại rất lớn đối với năng suất và chất lượng của nhiều cây trồng khác nhau (khoảng trên 11 loại cây vùng nhiệt đới) như đậu nành, đu đủ, cao su…Từ đó, ảnh hưởng rất lớn đến nền kinh tế của các quốc gia, đặc biệt là các quốc gia có thu nhập chính từ nông nghiệp, trong đó có Việt Nam. Đối với cây cao su bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra hay còn gọi là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng đối với ngành cao su ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới. Đợt dịch bệnh bùng phát đầu tiên trên cây cao su vào năm 1985 đã gây rất nhiều sự chú ý của các nhà khoa học. Cho đến nay, tính chất của bệnh rụng lá Corynespora càng ngày càng nghiêm trọng, quy mô và phổ ký chủ càng ngày càng mở rộng. Đồng thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Bệnh này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng suất mủ của cây cao su. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999 tại các nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Nó đã gây ra cho ngành cao su những mối lo mới và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của ngành cao su. Lúc mới xuất hiện, bệnh chỉ xuất hiện trên một số ít dòng vô tính như RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều dòng vô tính bị nhiễm bệnh này. Hiện trên thế giới đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola. Tuy nhiên những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ hình thái cũng như đặc điểm sinh lý của nấm, còn những nghiên cứu về mặt sinh học phân tử thì rất ít. Để chuẩn bị cho những nghiên cứu sâu hơn về mặt sinh học phân tử của nấm C. cassiicola tại Việt Nam, đồng thời được sự đồng ý của Bộ Môn Công
  15. Nghệ Sinh Học, của thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến, ThS. Phan Thành Dũng và đặc biệt là sự giúp đỡ của Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, tôi thực hiện đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR”. 1.2. Mục đích yêu cầu - Phân lập thành công các dòng nấm gây bệnh trên các dòng vô tính cây cao su khác nhau. - Đánh giá được sự sai khác về mặt di truyền của một số dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei phân lập từ các dòng vô tính cao su khác nhau bằng kỹ thuật RFLP – PCR. 1.3. Yêu cầu - Phân biệt được bệnh do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra trên cây cao su với những bệnh do các nấm khác. - Nắm vững quy trình nuôi cấy, phân lập và tách đơn bào tử nấm C. cassiicola. - Nắm vững quy trình kỹ thuật PCR và kỹ thuật RFLP.
  16. PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg 2.1. 2.1.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis Mull. Arg trên thế giới và tại Việt Nam Cây cao su có tên khoa học là Hevea brasiliensis Mull. Arg., thuộc họ Euphorbiaceae (họ thầu dầu) có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 36. Đây là loại cây công nghiệp dài ngày (chu kỳ khai thác là 20 – 30 năm), có giá trị tổng hợp trong tất cả các lĩnh vực nông – lâm – ngư nghiệp. Cây cao su có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ). Sau đó đến năm 1876, cây cao su được du nhập vào Châu Á và Châu Phi bởi H. Wickham. Khi Pháp đô hộ nước ta thì ngoài những thay đổi về mặt chính trị thì các nhà tư bản Pháp khi vào Việt Nam cũng đã làm biến đổi cả cơ cấu cây trồng, đặc biệt là các cây công nghiệp. Cây cao su cũng là một loại trong số đó, năm 1877 hai cây cao su đầu tiên do một người Pháp tên là Pierre đem về trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài Gòn) nhưng sau đó hai cây này đã bị chết. Sau nhiều nỗ lực trong việc đưa cây cao su vào Việt Nam thì cuối cùng vườn cây cao su đầu tiên cũng đã được trồng tại Suối Dầu – Nha Trang do bác sĩ Yersin (Theo Đặng Văn Vinh, 2000). Có được thành công đó phải kể đến nỗ lực của Seeligmann khi ông liên tiếp trong 2 năm 1881 và 1883 đã gửi cây cao su về Sài Gòn trồng. Yếu tố chính trị quyết định rất lớn đến sự phân bố và phát triển của cây cao su trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng. Sau khi người Pháp đã thành công trong việc đưa cây cao su vào trồng tại Việt Nam, thì hàng loạt vườn cao su đã được trồng với mục đích thí nghiệm trong khoảng thời gian 1900 – 1920. Trong khoảng thời gian đầu thế kỷ 20 từ năm 1920 – 1945, cao su được trồng chủ yếu tại Đông Nam Bộ với diện tích là 10.000 ha, chủ yếu trong các đồn điền của người Pháp. Đến trước những năm 1945, khi mà các công ty tư bản Pháp khuyến khích người dân trồng cao su làm cho diện tích tăng lên 138.000 ha, với sản lượng bình quân là 77.400 tấn/năm (Hourt Borek, 2003).
  17. Trong giai đoạn 1945 – 1954, đây là giai đoạn cả Việt Nam và Pháp đều tập trung cho cuộc chiến do vậy mà diện tích cây cao su không những không tăng mà còn giảm đáng kể. Trong những năm đầu thập niên 50, cây cao su đã được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số tỉnh miền Bắc ( Đặng Văn Vinh, 2000). Đến năm 1955, diện tích cây cao su đã giảm xuống chỉ còn 24.000 ha với sản lượng 15.000 tấn/năm, chủ yếu do tư nhân quản lý. Cuối năm 1960, diện tích cây cao su đã tăng nhanh lên 142.000 ha và sản lượng đạt 76.650 tấn/năm (Hourt Borek, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005). Sau đó, diện tích không tăng do cuộc chiến giữa Pháp và Việt Nam bước vào giai đoạn quyết liệt. Cuối thời kỳ chiến tranh khoảng những năm 1970 – 1975, thì diện tích cây cao su giảm mạnh chỉ còn 25.000 ha và sản lượng chỉ còn 21.000 tấn/năm. Sau giải phóng (năm 1975) theo tài liệu của cục thống kê tháng 5/1975 thì diện tích cây cao su cả nước còn khoảng 75.200 ha. Trong đó, Tổng công ty cao su Việt Nam quản lý 55.790 ha, số còn lại do tư nhân và địa phương quản lý. Đến năm 1995, trên thế giới có khoảng 9,5 triệu ha, trong đó cao su tiểu điền chiếm từ 75% - 95% (theo Báo cáo nghiên cứu phát triển cây cao su tiểu điền - Tổng công ty cao su Việt Nam từ 28/10/1995 – 1/11/1995, Malaysia – Indonesia – Thái Lan). Ở Việt Nam, diện tích cao su cả nước khoảng 450.000 ha và sản lượng đạt 400.000 tấn /năm (Tổng công ty cao su Việt Nam, 2004). Trong số này, Tổng công ty cao su quản lý 219.600 ha, trong đó có 173.700 ha đang khai thác mủ. Năng suất năm 2003 bình quân đạt 0,52 tấn/ha/năm, trong đó năng suất ở khu vực Đông Nam Bộ là cao nhất với 1,56 tấn/ha/năm. 2.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, lƣợng mƣa, tốc độ gió đến sự phát triển cây cao su Nhiệt độ tốt nhất đối với cây cao su là 25 – 30oC, trên 40oC cây sẽ khô héo, còn dưới 10oC trong thời gian dài cây sẽ héo, rụng lá, rụng chồi… Còn nếu nhiệt độ ở 5oC thì cây sẽ chết.
  18. Lượng mưa thay đổi tùy theo tình trạng đất. Thông thường lượng mưa thuận lợi nhất là từ 1.500 – 2.000 mm/năm, còn ở những vùng đất không thuận lợi thì lượng mưa cần là 1.800 – 2.000 mm/năm. Tốc độ gió có lợi cho cây cao su là từ 1 – 2 m/giây. Nếu tốc độ gió cao từ 8 – 13,8 m/giây sẽ làm lá cây bị rách, bị co lại, phiến lá dày lên. nhỏ lại. Nhiệt độ, lượng mưa và tốc độ gió thuận lợi cho sự phát triển cây cao su thì cũng thuận lợi cho sự phát triển của nấm. 2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, rất nhạy cảm với thời tiết. Do vậy, cây cao su bị rất nhiều côn trùng và vi sinh vật gây hại. Hiện nay, trên cây cao su có rất nhiều bệnh như bệnh về lá, bệnh về thân cành, bệnh rễ... (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Các bệnh này ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng và phẩm chất mủ. Đặc biệt là các bệnh về lá như bệnh phấn trắng do nấm Oidium heveae Steinm gây ra, bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) gây ra, bệnh rụng lá mùa mưa do nấm Phytophthora spp. Và nghiêm trọng nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. gây ra (Báo cáo tại hội thảo chuyên đề “Bảo vệ thực vật cây Cao su Việt nam - Hợp tác nghiên cứu và đào tạo giữa Đại học Nông Lâm và Ngành Cao su Việt Nam” – Phan Thành Dũng, 2006). Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới, mức độ tàn phá của nó trên cây cao su và nhiều loại cây trồng khác là vô cùng lớn. Ngoài các bệnh do vi sinh vật gây ra, trên cây cao su còn có các bệnh do côn trùng gây ra. Các loại côn trùng gây hại cây cao su có thể kể đến như: mối, sâu, sùng hại rễ, nhện, ốc sên, rệp… (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây hại trên cây cao su ở Việt Nam.
  19. 2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei Do nấm Corynespora có phổ ký chủ rộng nên đã có rất nhiều nhà khoa học tìm thấy loại nấm này trên nhiều ký chủ khác nhau. Đầu tiên, vào năm 1896 nó Cooke phát hiện nấm này trên cây dưa leo và cây dưa hấu tạ i Mỹ, đặt tên là Cercospora melonis. Sau đó, Gusgow (1906) đã đặt tên là Corynespora maizei khi ông tìm thấy chúng trên cây dưa leo tại Đức. Đến năm 1948, các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng loại nấm họ tìm được trên cây đậu nành, đậu đũa tại Trung Quốc tương tự như những loại nấm gây bệnh trên cùng loại ký chủ ở Mỹ trước đó và họ đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura. Liu. Mặc dù có rất nhiều tên gọi khác nhau nhưng cuối cùng Wei cũng đã thu thập, phân tích tất cả những tài liệu về nấm này và khẳng định chúng đều thuộc một loài là Corynespora cassiicola. Và ông đã đặt tên cho chúng là Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, càng khẳng định nhận định của Wei là hoàn toàn đúng. Nấm C. cassiicola ký sinh trên rất nhiều loài ký chủ khác nhau nhờ khả năng biến đổi sinh hóa rất nhanh. Nhưng mãi đến năm 1949, bệnh mới được phát hiện trên cây cao su đầu tiên ở Sri Lanka. Sau đó chúng xuất hiện rất nhiều ở các quốc gia trồng cao su khác như Thái Lan, Indonesia, Braxin…Tuy xuất hiện sớm nhưng đợt dịch bệnh đầu tiên gây nhiều sự chú ý của các nhà khoa học xảy ra vào năm 1985 tại Sri Lanka. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên tại một số nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên vào năm 1999. 2 .2.2. Đ ặc đ iểm p hân loại học của nấm C orynespora cassiicola ( Berk. & Curt.) Wei Nấm C. cassiicola có hệ thống phân loại học như sau: Ngành: Ascomycota. - Lớp: Ascomycetes. - Bộ: Pleosporales. - Họ: Corynesporascaceae. - Giống: Corynespora. -
  20. 2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei Trong môi trường tự nhiên, nấm phát triển trên thực vật bằng cách thức ký sinh hay hoại sinh trên xác bã thực vật. Chúng phát triển rất nhanh nhờ phát sinh bào tử. Khuẩn ty của nấm có màu sắc biến thiên từ mà u xám trắng đến xám đen và nâu. Hình dạng bào tử cũng rất đa dạng từ hình lưỡi liềm đến hình que. Bào tử có màu nâu nhạt, ở dạng đơn nhưng đôi khi ở dạng chuỗi dính có chứa nhiều vách ngăn chiều dài khoảng 700 m (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Bào tử của nấm được phát tán nhờ gió và mưa. Nó được phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Trong môi trường tự nhiên, số lượng bào tử phụ thuộc nhiều vào thời tiết, nhiều nhất là sau khoảng thời gian nắng ráo sau những trận mưa dài. Cũng như các nấm khác, bào tử nấm Corynespora có khả năng tồn tại lâu trong vết bệnh cũng như trong đất mà vẫn giữ được khả năng gây bệnh. Hình 2.1: Hình dạng bào tử nấm C. cassiicola (Nguồn: http://www-ang.kfunigraz.ac.at) Đây là loại nấm sinh độc tố cassiicoline gây rụng lá rất nhanh. Nấm Corynespora cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới của lá qua lớp biểu bì và khí khổng. Trái với ngoài tự nhiên, nấm này rất khó sinh bào tử trên môi trường nhân tạo. Chúng chỉ sinh bào tử ở những điều kiện rất đặc biệt về nhu cầu ánh sáng,
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược