- Trang Chủ
- Luận Văn - Báo Cáo
- Luận văn: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR (part 1)
Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN
CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR
NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2001 – 2005
SINH VIÊN THỰC HIỆN: VŨ THỊ QUỲNH CHI
Thành phố Hồ Chí Minh
-2005-
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM
Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN
CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR
Hội đồng hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN VŨ THỊ QUỲNH CHI
ThS. PHAN THÀNH DŨNG
Thành phố Hồ Chí Minh
-2005-
- LỜI CẢM TẠ
Chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt nhữn g
kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .
PGS.TS Bùi Cách Tuyến cùng ThS. Phan Thành Dũng – Viện Nghiên Cứu Cao
Su Việt Nam – đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
TS. Bùi Minh Trí và TS. Đinh Duy Kháng đã có những chỉ dẫn, động viên giúp
tôi thực hiện tốt khóa luận này.
KS. Nguyễn Ngọc Mai cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ
Môn Bảo Vệ Thực Vật/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt
Nam.
Chị Huỳnh Kim Hưng cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí
Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã
hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa
luận.
Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng
tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt
nghiệp.
Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên
người, để Con được như ngày hôm nay.
iii
- TÓM TẮT
VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tháng 09/2005. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR.
Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN.
ThS. PHAN THÀNH DŨNG.
Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền
kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu
chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá
khác. Do đó tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora
cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên
cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài,
C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ
đó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su
khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở
nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di
truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được
trồng ở Việt Nam.
Kết quả đạt được:
Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây
cao su.
Thu thập mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình
chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp
RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính.
Qua phân tích chúng tôi đi đến kết luận:
Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự
(1998) có thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam.
Chẩn đoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng
ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận được
không đặc trưng cho nấm C. cassiicola.
iv
- Không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên
cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI,
MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI.
Các mẫu nấm được dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm
C. cassiicola và đây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam
hiện nay
v
- MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................ ii
Mục lục ......................................................................................................................iii
Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................... vi
Danh sách các hình ................................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................... vii
1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. ....................................
2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 4
2.2.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 4
2.2.2. Phạm vi phân bố .................................................................................. 4
2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh ................................................. 5
2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola ..................................................... 5
2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis
Muell. Arg ....................................................................................................... 6
2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su
Hevea brasiliensis .................................................................................... 6
2.3.2. Tình hình bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại một số nước
trồng cao su .............................................................................................. 6
2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su ..................... 9
2.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh do C. cassiicola ............... 9
vi
- Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) .............................................. 10
2.5.
2.5.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR ........................................................... 10
2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 12
2.6. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE) ................................. 14
2.6.1. Giới thiệu ............................................................................................ 16
2.6.2. Định danh các enzyme ....................................................................... 15
2.6.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn ................................. 16
2.6.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA .................... 16
2.6.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE ............................... 18
2.6.6. Bản đồ giới hạn ................................................................................... 19
2.7. Vùng ITS và vai trò của nó trong phân tích đa dạng di truyền .................... 19
2.8. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nước ............................ 21
2.8.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước ................................. 21
2.8.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước ................................. 23
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................................. 24
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 24
3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 24
3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 24
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 24
3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 24
3.2.1. Phân lập nấm nguồn nấm C. cassiicola ............................................. 24
3.2.1.1. Hóa chất và dụng cụ .................................................................... 24
3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. 25
3.2.1.3. Phương pháp phân lập ................................................................. 25
3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR ........................................... 26
3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR........................... 26
3.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ............................................................ 28
3.2.2.3. Đọc kết quả của phản ứng PCR................................................... 30
3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) ........... 30
vii
- 3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ ................................................................... 31
3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP .................................. 31
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 32
4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora ................................................ 32
4.2. Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola .................................................... 37
4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola ............................................ 37
4.4. Kết quả phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS ..................................... 40
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 46
5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48
7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 52
viii
- DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PCR: Polymerase Chain Reaction.
RE: Restriction endonuclease.
PDA: Potato Dextrose Agar.
PSA: Potato Saccharose Agar.
EtBr: Ethidium Bromide.
TE: Tris EDTA.
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA.
RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
Bp: base pairs
rRNA: ribosomal RNA.
dvt: dòng vô tính.
BVTV: bảo vệ thực vật
VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam
ix
- DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó ........................................................ 15
Bảng 2.2: Liệt kê các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó ......................... 17
Bảng 2.3: Trình tự một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS
của nấm ..................................................................................................................... 21
Bảng 3 .1: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ................................................ 29
Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP ............................................... 31
Bảng 4.1: Các dòng vô tính cao su được lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh
(đặc trưng/ không đặc trưng)..................................................................................... 33
Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập được nấm C. cassiicola ................ 36
x
nguon tai.lieu . vn
