Xem mẫu
- 28
Chƣơng 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm đƣợc tiến hành từ 1/3/2005 đến 1/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ
Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.1 Vật liệu
3.1.1 Trang thiết bị và dụng cụ
3.1.1.1 Trang thiết bị
Tủ cấy, nồi hấp, kính hiển vi, máy đo pH, cân điện tử, máy nƣớc cất, máy lạnh..
3.1.1.2 Dụng cụ
Dao ghép, dao cắt mẫu, kẹp, đĩa cấy, kéo, đèn cồn, nhíp...
3.1.2 Mẫu cấy
Bƣởi dùng làm chồi ghép đƣợc lấy ở các nhà vƣờn trồng giống bƣởi có giá trị
kinh tế cao (bƣởi Năm Roi ở Cần Thơ, bƣởi Da Xanh ở Bến Tre và bƣởi Đƣờng Lá
Cam ở Đồng Nai).
Bƣởi dùng làm gốc ghép đƣợc lấy từ các giống bƣởi có khả năng sinh trƣởng
mạnh và sức chống chịu tốt nhƣ giống bƣởi Bồng ở Huế và giống bƣởi Xim Vang ở
Đồng Nai.
3.1.3 Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng MS là môi trƣờng đƣợc dùng trong thí nghiệm kết hợp với các nồng
độ khác nhau của chất kích thích sinh trƣởng.
Môi trƣờng dùng để ƣơm hạt nảy mầm: môi trƣờng MS với 7g agar và không
có chất kích thích nảy mầm.
Môi trƣờng dùng để giâm cành và lấy chồi ghép: môi trƣờng MS kết hợp với 7g
agar và 3 mg/l BA cùng với 0.1 mg/l NAA.
Môi trƣờng dùng để nuôi cây sau khi ghép: môi trƣờng MS với nồng độ đƣờng
cao 75 g/l kết hợp với chất kích thích ra rễ 0.5 mg/l.
Môi trƣờng đƣợc chuẩn bị và hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 atm, trong 25
phút.
- 29
Thành phần môi trƣờng MS (Murashige&Skoog, 1962)
Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng MS (Murashige & Skoog)
KNO3 1900 mg/l
NH4NO3 1650 mg/l
MgSO4 . 7H2O 370 mg/l
Đa lƣợng CaCl2 .2H2O 440 mg/l
KH2PO4 170 mg/l
FeSO4 .7H2O 27.8 mg/l
Na2EDTA 37.3 mg/l
MnSO4 .4H2O 22.3 mg/l
KI 0.83 mg/l
H3BO3 6.2 mg/l
Vi lƣợng ZnSO4 .7H2O 8.6 mg/l
CuSO4 .5H2O 0.025 mg/l
Na2MoO4 .2H2O 0.25 mg/l
CoCl2 .6H2O 0.025 mg/l
Nicotinic acid 0.5 mg/l
Pyridoxine-HCl 0.5 mg/l
Vitamine
Thiamine-HCl 0.1 mg/l
myo-Inositol 100 mg/l
Aminoacid Glycine 3.0 mg/l
Agar Agar 7 g/l
Đƣờng Sucrose 75 g/l
3.2 Điều kiện nuôi cấy
Cây ghép đƣợc đặt ở điều kiện nhiệt độ là 250C – 280C , ánh sáng đèn huỳnh
quang (cƣờng độ ánh sáng: 50 – 100 µmol m-2 s-1), ẩm độ 60 – 65%, với thời gian
chiếu sáng 16 giờ/ngày đêm.
- 30
Đối với giai đoạn tạo cây con làm gốc ghép thì hạt đƣợc ƣơm trong điều kiện
tối hoàn toàn cho đến khi hạt nảy mầm thì chuyển ra điều kiện ở phòng nuôi cây bình
thƣờng.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Bố trí thí nghiệm
Thực hiện thí nghiệm vi ghép trên cây bƣởi với 3 yếu tố đƣợc bố trí theo kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên.
Yếu tố 1: Gốc ghép với 2 loại là gốc bƣởi Bồng và gốc bƣởi Xim Vang.
Yếu tố 2: Chồi ghép với 3 loại là chồi bƣởi Năm Roi, chồi bƣởi Da Xanh và
chồi bƣởi Đƣờng Lá Cam.
Yếu tố 3: Cách ghép, có 3 cách ghép là cách ghép hàm ếch (E), cách ghép mặt
cắt (M) và cách ghép chữ T ngƣợc (T).
Tổ hợp 3 yếu tố ta có 18 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức tiến
hành trên 5 cây, mỗi cây đƣợc nuôi cấy trong một ống nghiệm. Tổng cộng có 18*3*5
= 270 cây.
Bảng 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Gốc ghép Chồi ghép Cách ghép
NT
Năm Roi (NR) E
1
Năm Roi (NR) T
2
Năm Roi (NR) M
3
Da Xanh (DX) E
4
Xim Vang (XV) Da Xanh (DX) T
5
Da Xanh (DX) M
6
Đƣờng Lá Cam (ĐLC) E
7
Đƣờng Lá Cam (ĐLC) T
8
Đƣờng Lá Cam (ĐLC) M
9
Năm Roi (NR)
10 E
Năm Roi (NR)
11 T
Bồng (B) Năm Roi (NR)
12 M
13 Da Xanh (DX) E
14 Da Xanh (DX) T
- 31
15 Da Xanh (DX) M
Đƣờng Lá Cam (ĐLC)
16 E
Đƣờng Lá Cam (ĐLC)
17 T
Đƣờng Lá Cam (ĐLC)
18 M
Ghi chú:
NT: Nghiệm thức
3.3.2 Chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm đƣợc theo dõi với các chỉ tiêu sau:
(a) Tỷ lệ sống của cây vi ghép
Cây vi ghép sống: là cây vi ghép (chồi trên gốc ghép) còn xanh và có mô sẹo
hình thành nơi vết cắt sau 7 ngày vi ghép.
Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%) = (số cây vi ghép sống/tổng số cây vi
ghép)*100.
(b) Số chồi bật mầm của cây vi ghép
Chồi mới đƣợc hình thành: là chồi mới bật lên từ chồi ghép ban đầu khi cây vi
ghép còn sống (sau 7 ngày vi ghép).
Tỷ lệ chồi mới đƣợc hình thành (%) = (số chồi mới đƣợc hình thành/số cây vi
ghép sống).
(c) Chiều cao chồi cây vi ghép (mm)
Chiều cao chồi của cây vi ghép là chiều cao của chồi ghép đƣợc ghép lên gốc
ghép.
Tốc độ tăng trƣởng chiều cao (mm/7 ngày) = (chiều cao chồi 28 ngày sau vi
ghép) – (chiều cao chồi 21 ngày sau vi ghép)/7 ngày.
(d) Số lá của chồi ghép
Số lá của chồi ghép là số lá có trên chồi ghép của cây vi ghép.
Tốc độ ra lá (lá/7 ngày) = (số lá 28 ngày sau vi ghép) – (số lá 21 ngày sau vi
ghép)/7 ngày
3.3.3 Xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý dựa trên phần mềm Statgraphics 7.0 và Excel
3.3.4 Quy trình thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo quy trình sau:
- 32
a. Chuẩn bị chồi ghép
Chồi bƣởi đƣợc nuôi cấy in vitro bằng phƣơng pháp vi giâm cành để tạo chồi
ghép, dùng dao mổ cắt lấy đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc từ 0.1 – 1 mm, cắt nhọn
phần gốc.
Các cành non của các giống bƣởi dùng tạo chồi
đƣợc cắt bỏ hết lá, cắt từng đoạn 2 – 3 cm, cho vào
erlen rửa sạch bằng nƣớc xà phòng loãng, sau đó rửa
sạch xà phòng bằng nƣớc cất nhiều lần.
Đƣa mẫu vào tủ cấy vô trùng, lắc với cồn 700
trong 1 phút. Rửa sạch cồn bằng nƣớc cất vô trùng. Xử
lý bằng nƣớc javel trong 30 phút, sau đó rửa sạch bằng
nƣớc cất vô trùng.
Cành mẫu sau đó đƣợc cắt bỏ cuống lá và hai
đầu của phần thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng và cắm
Hình 3.1: Vi giâm cành
các cành đó vào môi trƣờng MS có BA 3 mg/l + NAA
bƣởi Da Xanh trên môi
0.1 mg/l, cho phần cuống hƣớng lên trên, chồi ngủ phải
trƣờng MS
nằm trên mặt môi trƣờng.
- 33
Lá đầu tiên
Đỉnh sinh
trƣởng
Biểu bì
Nách lá chứa
chồi
Biểu bì
Mạch dẫn
Mạch dẫn
Hình 3.2: Cấu trúc chồi đỉnh
Nuôi mẫu ở điều kiện ánh sáng 2000 lux, chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ
25oC. Sau 3 tuần, các chồi ngủ bật mầm đƣợc tách ra và lấy chồi đỉnh nuôi trong
môi trƣờng MS có BA 2 mg/l, sau 7 ngày lấy đỉnh sinh trƣởng để ghép.
b. Chuẩn bị gốc ghép
Gốc ghép đƣợc tạo ra bằng cách gieo hạt, cây mầm tạo ra đƣợc dù ng làm
gốc ghép.
Hạt lấy trực tiếp từ trái chín, rửa sạch
bằng nƣớc xà phòng loãng, sau đó rửa lại
nhiều lần bằng nƣớc cất cho đến khi sạch hết
lớp nhớt bám trên vỏ hạt, rồi cho vào erlen vô
trùng, chuyển vào tủ cấy.
Ngâm hạt trong cồn 700 trong 2 – 3
phút, sau đó rửa sạch cồn bằng nƣớc cất vô
Hình 3.3: Hạt bƣởi Bồng đã khử
trùng 3 lần.
trùng
Xử lý hạt bằng dung dịch nƣớc javel
trong 30 phút.
Rửa sạch lại bằng nƣớc cất khoảng 3 lần cho đến khi không còn mùi javel nữa.
- 34
Từng hạt đƣợc tách lớp vỏ trấu, vỏ lụa sau đó gieo vào các ống nghiệm
Cây mầm cao 5 – 8 cm có thể chọn làm gốc ghép.
Gốc ghép ở độ tuổi từ 14 – 20 ngày sau khi nảy mầm thì đƣợc cắt bỏ phần thân
trên và rễ sao cho phần thân trên hai lá mầm còn khoảng 3 cm và phần rễ còn rễ trụ
dài khoảng 2 cm. Gốc ghép đó đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có 75 g đƣờng và chất
kích thích sinh trƣởng NAA 0.5 mg/l, sau 1 tuần gốc ghép sẵn sàng để ghép.
c. Thực hiện vi ghép
Tạo chồi ghép: Chồi ghép là các đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 0,1 – 1
mm đƣợc cắt từ đỉnh chồi của các giống bƣởi NR, DX và ĐLC sau khi nuôi cấy trong
ống nghiệm.
Tạo gốc ghép: Các cây mầm B và XV đƣợc tạo ra trong ống nghiệm
đƣợc cắt bỏ phần trụ trên lá mầm để lại phần thân cao khoảng 2 – 3 cm mang 2 lá mầm
và rễ. Dùng dao nhọn cắt vào đƣờng kính thân, nơi vòng tƣợng tầng khoảng 1 mm
chiều sâu, đặt chồi ghép vào. Mỗi cách cắt gốc ghép sẽ tạo ra một cách ghép khác
nhau. Có các cách ghép chủ yếu sau:
Ghép áp mặt cắt (M): đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt vết cắt, ngay trên vòng
tƣợng tầng.
Ghép chữ T ngƣợc (T): dùng lƣỡi dao cắt vết ghép hình chữ T ngƣợc, chân chữ
T đẻ lộ vùng tƣợng tầng là nơi đặt mắt ghép.
Ghép hàm ếch (E): tạo vết ghép lõm hình hàm ếch sâu đến vùng tƣợng tầng,
mắt ghép đặt vào đáy hàm ếch.
Ghép: chồi ghép đƣợc ghép lên vị trí cắt trên gốc ghép, tạo nên cây vi
ghép.
Hình 3.4: Gốc ghép với ba cách ghép mắt cắt, chữ T
ngƣợc và ghép vào lỗ trên thân (hàm ếch)
- 35
d. Nuôi cây ghép
Vi ghép là một kỹ thuật phối hợp giữa ghép và nuôi đỉnh sinh trƣởng. Cây vi
ghép đƣợc nuôi trong môi trƣờng MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, nồng độ đƣờng là
7,5%, agar đƣợc dùng 7 g/l.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tỷ lệ sống của cây vi ghép
Kỹ thuật vi ghép tạo cây có múi sạch bệnh và có khả năng chống chịu điều kiện
khắc nghiệt của thời tiết đã đƣợc nhiều tác giả khác nhau trong và ngoài nƣớc tiến
hành. Mỗi tác giả thu đƣợc một kết quả khác nhau và tỷ lệ sống của cây đƣợc nâng dần
lên thông qua các kỹ thuật ngày càng tối tân hơn và việc dùng các chất kích thích khác
nhau. Sau 4 tuần thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau:
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến tỷ lệ sống của cây vi ghép
Số Số cây vi ghép sống Tỷ lệ sống của cây vi ghép (%)
cây T1, T2, T3, T4,
NT T1, T2, T3, T4,
vi 7 14 21 28
7 NSG 14 NSG 21NSG 28 NSG
ghép NSG NSG NSG NSG
80,00ab 73,33abc 73,33abcd
1 15 15 12 11 11 100
93,33a 93,33a 86,66ab
2 15 15 14 14 13 100
66,67ab 66,67abc 53,33bcd
3 15 15 10 10 8 100
86,67ab 86,67ab 86,66ab
4 15 15 13 13 13 100
- 36
80,00ab 66,67abc 53,33bcd
5 15 15 12 10 8 100
73,33ab 60,00bc 53,33bcd
6 15 15 11 9 8 100
60,00b 46,67c 46,67cd
7 15 15 9 7 7 100
73,33ab 53,33c 46,67cd
8 15 15 11 8 7 100
73,33ab 60,00bc 40,00d
9 15 15 11 9 6 100
86,67ab 86,67ab 80,00abc
10 15 15 13 13 12 100
93,33a 93,33a 93,33a
11 15 15 14 14 14 100
80,00ab 73,33abc 53,33bcd
12 15 15 12 11 8 100
93,33a 93,33a 93,33a
13 15 15 14 14 14 100
80,00ab 73,33abc 66,67abcd
14 15 15 12 11 10 100
80,00ab 73,33abc 66,67abcd
15 15 15 12 11 10 100
80,00ab 66,67abc 53,33bcd
16 15 15 12 10 8 100
86,67ab 73,33abc 53,33bcd
17 15 15 13 11 8 100
80,00ab 66,67abc 46,67cd
18 15 15 12 10 7 100
Ghi chú:
NT: Nghiệm thức
T1, 7 NSG: Tuần 1, 7 ngày sau ghép.
T2, 14 NSG: Tuần 2, 14 ngày sau ghép.
T3, 21 NSG: Tuần 3, 21 ngày sau ghép.
T4, 28 NSG: Tuần 4, 28 ngày sau ghép.
Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác
biệt rất có ý nghĩa ở mức 0.05 dựa theo trắc nghiệm DUNCAN.
Qua bảng ảnh hƣởng của kỹ thuật vi ghép đến
tỷ lệ sống của cây vi ghép có thể nhận xét sau:
Đối với gốc ghép
Ở tuần 1 (từ ngày 1 đến ngày thứ 7 sau vi
ghép), các cây vi ghép sống toàn bộ (100%)
và không có sự khác biệt về mặt thống kê
giữa các loại cây vi ghép đƣợc tạo ra. Điều
này có thể đƣợc giải thích do chồi ghép đƣợc
Hình 4.1: Cây vi ghép hình
thành rễ mới sau 21 ngày
- 37
nuôi cấy trƣớc một thời gian trên môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng
BA, dinh dƣỡng đƣợc chồi ghép hấp thụ có thể nuôi chồi ghép trong những
ngày đầu vi ghép mà không bị ảnh hƣởng bởi dinh dƣỡng của gốc ghép.
Tuần thứ 2 (từ ngày 8 đến 14 sau vi ghép), tỷ lệ sống của cây vi ghép có giảm
so với tuần 1 chứng tỏ có sự liên kết giữa chồi ghép và gốc ghép để hình thành
hệ thống mạch dẫn. Gốc ghép XV đạt 76,29% sống và gốc ghép B đạt 84,44%,
tuy nhiên sự khác biệt về tỷ lệ sống của hai loại gốc ghép này là không có ý
nghĩa về mặt thống kê.
Sau 21 ngày vi ghép tỷ lệ sống của cây vi ghép có giảm và đều giảm ở cả hai
loại gốc ghép. Sau 28 ngày vi ghép tỷ lệ sống của cây vi ghép đã ổn định, gốc
ghép XV đạt 60% tỷ lệ sống và gốc ghép B đạt 77%. Chúng tôi nhận thấy rằng
các cây vi ghép bị mất từ ngày 21 đến ngày 28 chủ yếu là do bị nhiễm nấm
(điều kiện khách quan). Sự khác biệt về tỷ lệ sống của hai loại gốc ghép này là
sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và thấy rằng gốc ghép bƣởi B cho tỷ lệ
sống 77% tốt hơn gốc ghép XV 60%.
Đối với chồi ghép
Tỷ lệ thành công của cây vi ghép chủ yếu
phụ thuộc vào tỷ lệ sống của chồi ghép.
Nhận thấy ở tuần 1 tỷ lệ sống của chồi ghép
đều đạt 100% và lý do nhƣ đã giải thích ở
trên. Sự khác biệt về tỷ lệ sống của cây ghép
ở tuần 2 (NR: 83,33%, DX: 82,22%, ĐLC:
75,56%) không có ý nghĩa về mặt thống kê.
Tuy nhiên tỷ lệ sống của cây vi ghép ở tuần
3 lại có sự khác biệt về mặt thống kê, chồi
NR: 81,11% và chồi DX: 75,56% tỷ lệ sống,
tuy nhiên chồi ghép ĐLC chỉ đạt 61,12%.
Nhìn chung cả ba loại chồi ghép đều giảm tỷ
Hình 4.2: Cây vi ghép ở
lệ sống nhƣng có sự khác biệt của ba loại
tuần thứ 3 (XV-NR-M):
chồi ghép này, sự khác biệt này do nhiều
gốc ghép Xim Vang, chồi
điều kiện tác động mà trong đó sự tiếp xúc
ghép Năm Roi, cách ghép
mặt cắt (M)
nguon tai.lieu . vn
