Xem mẫu
- ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM
NẤM MỐC và ĐỘC TỐ
AFLATOXIN
GVHD: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
HVCH: HUỲNH NGUYỄN QUẾ ANH
-2009-
1
- MỤC LỤC
1 Mở đầu ................................ ................................ ................................ ..................... 1
1.1 Đặc điểm sinh học của nấm mốc ................................ ................................ ............ 1
1.2 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc ................................ ......................... 2
1.2.1 Hình dạng và kích thước ................................ ................................ ...................... 2
1.2.2 Cấu tạo................................ ................................ ................................ ................. 2
1.3 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc ................................ ............................... 3
1.4 Sinh sản của nấm mốc ................................ ................................ ............................ 4
1.4.1 Sinh sản vô tính ................................ ................................ ................................ ... 4
1.4.2 Sinh sản hữu tính ................................ ................................ ................................ . 5
1.5 Vị trí và vai trò của nấm mốc ................................ ................................ ................. 6
2 Độc tố ................................ ................................ ................................ ...................... 7
2.1 Loại độc tố điển hình đối với chủng nấm mốc ................................ ........................ 7
2.2 Cơ chế tác dụng của độc tố trong cơ thể con người và súc vật ................................ 8
2.2.1 Trên súc vật thí nghiệm: biểu hiện ở 4 nhóm bệnh chính ................................ ...... 8
2.2.2 Trên người ................................ ................................ ................................ ........... 8
3 Cơ chế sinh tổng hợp độc tố ................................ ................................ ................... 11
3.1 Norsolorinic acid-averatin ................................ ................................ .................... 12
3.2 Versicolorin A – sterigmatocystin ................................ ................................ ........ 13
3.3 Quá trình chuyển Sterigmatocystin thành Aflatoxin: ................................ ............ 13
4 Phương pháp xác định độc tố ................................ ................................ ................. 14
4.1 Phương pháp truyền thống ................................ ................................ ................... 14
4.1.1 Dùng Kit để xác định Aflatoxin trong thực phẩm ................................ ............... 14
4.1.2 Dùng VERATOX ................................ ................................ .............................. 14
4.1.3 Dùng Reveal ................................ ................................ ................................ ...... 17
4.1.4 Dùng thử nghiệm sinh hóa phát hiện độc tố Aflatoxin ................................ ........ 19
4.2 Phương pháp hiện đại ................................ ................................ ........................... 22
4.2.1 Phương pháp đo mật độ huỳnh quang ................................ ................................ 22
i
- 4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................ ............................. 28
5.2.2.5 Phương pháp tiến hành................................ ................................ ................... 31
5 Biện pháp phòng nhiễm độc tố Aflatoxin ................................ ............................... 34
6 Tài liệu tham khảo ................................ ................................ ................................ .. 35
ii
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
1 Mở đầu
Độc tố nấm mốc ít khi gây ngộ độc cấp tính, nó gây hại cơ thể từ từ do đó làm
người ta không để ý. Nhưng khi phát hiện ra triệu chứng thì những cơ quan bộ phận
đã hư hại nghiêm trọng khó lòng chữa trị. Tùy theo lọai nấm mốc và độc tố của
chúng mà tác động chính của mỗi loại có khác nhau. Nếu tổng hợp chung lại thì độc
tố nấm mốc tác động hầu hết các cơ quan bộ phận trong cơ thể như: Tác động vào
gan và thận gây viêm, nếu kéo dài có thể gây ung thư (Aflatoxin, Ochratoxm… );
Tác động vào hệ tuần hoàn gây ra xuất huyết mãn tính, ngưng kết hồng c ầu, giảm
lượng kháng thể (Aflatoxin..); Tác động hệ thần khinh gây ra hôn mê mất tính ngon
miệng(Deoxynivalenol, DON); Tác động lên hệ hô hấp gây viêm nám
phổi(Aspergillus fumigatus); Tác động vào hệ tiêu hóa gây ra viêm lở lóet miệng,
da dầy … Khác với bệnh nhiễm trùng là kháng sinh không điều trị được nhiễm độc
tố nấm mốc. Cách tốt nhất là ngăn ngừa không cho độc tố nhiễm vào thức ăn.
1 .1 Đặc điểm sinh học của nấm mốc
Nấm mốc (fungus, mushroom) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản (thalophyte), tế
b ào không có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh), vách tế bào
cấu tạo chủ yếu là chitin, có hay không có celuloz và một số thành phần khác có
h àm lượng thấp. Nấm học (Mycology) đư ợc khai sinh bỡi nhà thực vật học người Ý
tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova
Plantarum Genera) nhưng theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công
n ghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794 - 1874). Theo Elizabeth Tootyll
(1984) nấm mốc có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả, tuy nhiên, ước
tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất. Nhiều loài nấm
mốc có kh ả năng ký sinh trên nhiều ký chủ như động vật, thực vật, đặc biệt trên con
n gười, cây trồng, vật nuôi, sản phẩm sau thu hoạch chưa hoặc đã qua ch ế biến, bảo
quản. Một số là tác nhân gây bệnh, làm hư các thiết bị thủy tinh bảo quản không tốt
nhưng cũng có nhiều loài có ích như tổng hợp ra acid hữu cơ, thuốc kháng sinh,
vitamin, kích thích tố tăng trưởng thực vật đ ã được đưa vào sản xuất công nghiệp và
có một số nấm được dùng làm đối tượng nghiên cứu về di truyền học.
1
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
1 .2 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm mốc
1 .2.1 H ình dạng và kích thước
Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast = nấm men), đa số có hình sợi
(filamentous fungi=nấm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách
(đơn bào). Sợi nấm thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau
tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến
1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển
chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở n gọn (Hình 1.1). Các sợi nấm có thể phân nhánh
và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí
sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào
tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi n ấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấ m
có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm (Hình 1.2).
Hình 1.1: Sợi nấm và cấu tạo
Hình 1.2: Một số dạng khuẩn lạc nấm (theo Samson và ctv., 1995)
1 .2.2 Cấu tạo
Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào vi sinh vật chân hạch khác
được mô tả và trình bày như ở Hình 1.3
2
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
Hình 1.3: Cấu tạo tế bào đỉnh sợi nấm Fusarium (theo Howard R J & Heist J R., 1979)
(Chú thích: MT: vi ống, M: ty thể, SC: bộ Golgi, V: bọng(túi) đỉnh, P: màng sinh chất 4 lớp)
Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có celluloz. Chitin là
thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina.
Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzim chitin syntaz
Tế bào chất của tế bào nấm chứa mạng nộ i mạc (endoplasmic reticulum), không
bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu
trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra, tế
bào nấm còn có ribô thể (ribosomes) và những thể khác chưa rỏ chức năng.
Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một
loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda và ctv. (1978) đầu tiên ly trích được và gọi là
neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi.
Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. Nhân của tế
bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi m, bên trong màng nhân chứa ARN
vàphospholipid và protein dầy 0,02 ADN.
1 .3 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc
Hầu hết các loài nấm mốc không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy
nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950).
Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2oC đến 5oC, tối hảo từ 22oC đến
27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt
có một số ít loài có thể sống sót ở OoC và ở 60oC. Nói chung, nấm mốc có thể phát
triển tốt ở môi trường acit (pH=6) nhưng pH tối hảo là 5 - 6,5, một số loài phát triển
tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967).
Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm mốc vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc
và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dỉ nhiên nước là yếu tố cần thiết cho
sự phát triển.
Theo Alexopoulos và Minns (1979) cho biết nấm mốc có thể phát triển liên tục
trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát
triển của chúng.
3
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
Nấm mốc không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên
ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống
ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên xác bã
hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất
định.
Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấ m
được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca.
Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucoz,
muối ammonium... sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn th ức ăn hữu cơ phức
tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzim thích hợp để cắt các đại phân
tử này thành những phân tử nhỏ để dể hấp thu vào trong tế bào.
1 .4 Sinh sản của nấm mốc
Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính. Trong sinh
sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh
sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái.
1 .4.1 Sinh sản vô tính
The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2
dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và
sinh sản bằng các loại bào tử.
Một số loài nấm có những bào tử đặc trưng như sau:
a. Bào tử túi (bào tử bọc)(sporangiospores): các bào tử động (zoospores) (Hình
1.4 a, b, c) có ở nấm Saprolegnia
Hình 1.4: Bào tử động (theo Samson và ctv., 1995)
b. Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấ m
Aspergillus, Penicillium, ... Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí và cách sắp
xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu
chuẩn để phân loại nấm.
Cuống bào tử đính dạng bình có thể không phân nhánh như ở Aspergillus (Hình
1.5) hay dạng thẻ phân nhánh như ở Penicillium (Hình 1.6).
4
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
Hình 1.5: Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus. a. 1 lớp, b. 2 lớp, c. phiến, d. tia, e. tể
(theo Samson và ctv., 1995)
Hình 1.6: Bào tử đính và cuống bào tử đính ở Penicillium chrysogenum (theo Samson và ctv. 1995)
1 .4.2 Sinh sản hữu tính
Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes)
có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:
Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast)
của 2 giao tử
Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để
tạo một nhân nhị bội (diploid)
Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua
sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội).
Theo Machlis (1966) tất cả các giai đoạn trên kể cả giai đoạn tạo cơ quan sinh
dục được điều khiển bởi một số kích thích tố sinh dục (sexual hormones).
Cơ quan sinh dục của nấm mốc có tên là túi giao tử (gametangia) có 2 loại: cơ
quan sinh dục đực gọi là túi đực (antheridium) chứa các giao tử đực (antherozoids),
còn cơ quan sinh dục cái gọi túi noãn (oogonium) chứa giao tử cái hay noãn, khi có
5
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
sự kết hợp giữa giao tử đực và noãn sẽ tạo thành bào tử, bào tử di động được gọi là
bào tử động (zoospores).
Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên là
tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử là đặc trưng của nhóm nấm Myxomycetes
Bào tử sinh dục khi hình thành có dạng túi gọi là nang (ascus) và túi này ch ứa
những bào tử gọi là bào tử nang (ascospores). Nang và bào tử nang là đặc trưng của
nhóm Ascomycetes
Trong nhóm Basidiomycetes, 4 bào tử phát triển ở phần tận cùng c ủa cấu trúc thể
quả gọi là đãm (basidium) và bào tử được gọi là bào tử đãm (basidiospores)
Nhóm Nấm bất toàn (Deuteromycetes=Deuteromycotina)) gồm những nấm cho
đến nay chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính của chúng.
Hình 1.7: Các kiểu bào tử đảm. a. Astrea, b. Bovista, c. Agaricales,
d. Clavulina,
e. Dacrymyces,
f. Sistotrema,
g. Repetobasidium,
h. Xenasma,
i-n. bào tử đảm có vách,
n. Puccinia. (theo Kreisel, 1995)
1 .5 Vị trí và vai trò của nấm mốc
Nấm mốc có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng
cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thự c, thực phẩm trước và sau thu hoạch,
trong chế biến, bảo quản. Nấm mốc còn gây hư hại vật dụng, quần áo... hay gây
bệnh cho người, động vật khác và cây trồng. Tuy nhiên, các qui trình chế biến thực
phẩm có liên quan đến lên men đều cần đến sự có mặt của vi sinh vật trong đó có
6
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
nấm mố c. Nấm mốc cũng giúp tổ ng hợp những loại kháng sinh (penicillin,
griseofulvin), acit hữu cơ (acit oxalic, citric, gluconic...), vitamin (nhóm B,
riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzim và các hoạt
chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược ... đã được sử dụng rộng
rãi trên thế giới. Ngoài ra, nấm còn giử vai trò quan trọng trong việc phân giải chất
hữu cơ trả lại độ mầu mỡ cho đất trồng.
Một số loài thuộc giố ng Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người,
Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim;
Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên
cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora.... đặc biệt nấm Aspergilus
flavus và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong điều kiện thuận lợi
sinh ra độc tố aflatoxin.
Bên cạnh tác động gây hại, một số loài nấm mốc rất hữu ích trong sản xuất và
đời sống như nấm ăn, nấm dược phẩm (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp
nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin...), nấm
Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, nấm
Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc
nhóm Phycomycetina hay Deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại
qua đó có thể dùng làm thiên địch diệt côn trùng. Ngoài ra, những loài nấm sống
cộng sinh với th ực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút được nhiều
hơn lượng phân vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng.
2 Độc tố
2 .1 Loại độc tố điển hình đối với chủng nấm mốc
Aspergillus flavus và A. parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các lòai
nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố
mycotoxin có thể được tạo ra từ nhiều chuẩn của hai loài này được gọi chung là
aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ
7 – 40oC và tối ưu ở 24 – 28oC, do vậy có khả năng tăng tưởng tốt trên các lọai ngũ
cốc, nông sản( lúa, gạo, bắp ...) không được phơi sấy tốt, đặc biệt là các nước nhiệt
đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt độ không khí cao. Từ các nguyên liệu này, nấ m
mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người. Ở các chủng có
khả năng dinh độc tố, sau khi tăng tưởng 1 – 3 ngày độc tố đượ tạo ra và tiến vào cơ
chất. Bốn loại aflatoxin được tạo ra bởi Aspergillus flavus và A. parasiticus là
aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) va G1, G2 phát huỳnh quang
màu lục (green). Khi ăn cỏ hoặc thức ăn chứa B1 hoặc B2, bò sữa có thể chuyển hóa
chúng thành các độc tố aflatoxin M1, M2 hiện diện trong sữa bò. Do aflatoxin là
chất gây ung thư mạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt. Hầu hết các nước đều có
7
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
tiêu chuẩn qu ốc gia về hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong
nông sản, thực phẩm, thường la 10ppb.
Hình 2.1: Nấm sợi Aspergillus flav
2 .2 Cơ chế tác dụng của độc tố trong cơ thể con người và súc vật
2 .2.1 Trên súc vật thí nghiệm: biểu hiện ở 4 nhóm bệnh chính
Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan - thể hiện một nhiễm độc cấp tính.
Thường là do Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đó độc tố có độc tính mạnh nhất là
B1, sau đó đến G1, rồi đến B2, và sau cùng là G2. Bên cạnh gan, các cơ quan khác
như: phổi, thận, mạc treo, túi mật... cũng bị tổn thương ít nhiều.
- Hiện tượng xơ gan: sau một nhiễm độc cấp tính như trên có hai khả năng có thể
diễn ra:
Một là các tổ chức mới ở gan sẽ được tái tạo dần dần và gan trở lại hồi phục
hoàn toàn.
Hai là chuyển thành xơ gan.
- Ung thư gan: liều gây ung thư gan trên chu ột nhắt trắng là 0,4ppm, tức là cho
chuột ăn hàng ngày với liều 0,4mg aflatoxin/kg thức ăn. Sau 2-3 tuần có thể gây
ung thư gan. Riêng Aflatoxin B1 liều gây ung thư gan có thể là 10ppm tức là mỗi
ngày cho chuột ăn 10mg/kg th ức ăn.
- Hiện tượng gây viêm sưng nặng nề dẫn đến hoại tử các tổ chức và nội tạng .
2 .2.2 Trên người
Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng
-
Kwashiorkor, được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may
bột lạc này đã bị nhiễm độc tố Aflatoxin. Trẻ đã ăn mỗi ngày 70-100g bột lạc bị
nhiễm Aflatoxin với hàm lượng 0,5-1ppm ăn kéo dài trong 10 tháng, đến khi trẻ 4
8
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan. Sinh thiết gan thấy
có hiện tượng loét mô gan ở cả 2 trẻ.
- Bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu là bệnh không do độc tố nấm Anatoxin gây
ra, lần đầu tiên xuất hiện ở Xiberi (Liên Xô cũ) và một số vùng khác thuộc Liên Xô.
Ở những vùng này thức ăn cơ bản là kê, lúa mì, lúa mạch. Sau này, các công trình
nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh là nấm fusarium. Về lâm sàng bệnh
thường tiến triển theo 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Kéo dài 3-6 ngày, biểu hiện đầu tiên là viêm niêm mạc miệng,
họng... sau đó lan xuống dạ dày, ruột. Sang ngày thứ 3 có đi ngoài nhiều lần, đau
bụng, nôn mửa.
Giai đoạn 2: còn gọi là giai đoạn bất sản của hệ bạch huyết và cơ quan tạo
máu, kéo dài 15-30 ngày. Xét nghiệm máu: Bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm và thiếu
máu rõ rệt.
Sự chuyển hóa aflatoxin trong cơ thể
Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị
phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 120oC phải đun 30 phút mới mất
tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của
n ấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại
không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có
nhiều biện pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau , nhưng thường gặp và độc nhất
là aflatoxin B1.
Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, d ễ dàng được hấp
thu sau khi ăn , sự hấp thu là h oàn toàn. Khi đến ruột non , aflatoxin B1 sẽ được
nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng
là nhiều nhất. Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyển dạng sinh học aflatoxin
B1 nhờ sự gắn kết với protein – đây là con đường chính để giải độc aflatoxin B1
cho gan. Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan
nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ,
mô mỡ, tụy, lách... Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% b ị đào thải theo đường tiêu
hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua cả sữa.
Độc tính trên động vật thí nghiệm
Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính.
Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các
triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận
cấp . Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ
m áu , chảy máu và hoại tử nhu mô . Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền
tương ứng với 3 kiểu gây ung thư , gây quái thai và gây đột biến.
9
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
Độc tính của aflatoxin trên người
Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu
h iện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan.
Bên cạnh các nghiên cứu về vai trò của virut viêm gan, ký sinh trùng, d inh
dưỡng, các chất độc... đối với ung thư gan, các nhà khoa học cũng đang tập trung
n ghiên cứu về vai trò của aflatoxin với căn bệnh phổ biến này.
Trên người, một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát
tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của
aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã
tìm thấy sự gắn kết của aflatoxin B1 với AND của tế bào gan ở những bệnh nhân bị
ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi,
trong máu rau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1.
Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở
các bệnh nhân này, m à nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự
chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên
kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính.
Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của
aflatoxin qua 5 giai đoạn.
- Tác động qua lại với AND và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp
AND và ARN.
- Ngừng tổng hợp AND.
- Giảm tổng hợp AND và ức chế tổng hợp ARN truyền tin.
- Biến đổi hình thái nhân tế bào.
- Giảm tổng hợp protein.
Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gâ y ung thư biểu
mô tế bào gan.
Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật và
con người. Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên
phát. Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm
b ằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin . Một loạt các nghiên cứu cũng
cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư
gan nguyên phát trên người.
Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm,
không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, b ị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan
trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên
phát.
10
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
3 Cơ chế sinh tổng hợp độc tố
Aflatoxin là sản phẩm của quá trình trao đổi chất thứ cấp của A. flavus và
A.parasiticus. Các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin có trong bộ
đơn trong hệ gene của nh ững loài nấm sợi. Những nghiên cứu trực tiếp đi sâu về
sinh học phân tử của quá trình sinh tổng hợp. Cặp gen sinh tổng hợp acid béo (fatty
acid synthase) được xác định có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp. 2 gene này
đặc trưng cho dòng cytochrome P450 monooxygenase.
Các độc tố này thường được thấy trước quá trình thu hoạch bắp, cây bông, đậu
phụng. Aflatoxin ảnh hưởng lớn đến thức ăn và công ngành công nghiệp hạt giống
vì nó có độ độc cao và có khả năng gây ung thư. Aflatoxin B1 liên quan đến quá
trình chuyển G – T ở codon 249 của hệ gene
Gen đầu tiên được tìm ra có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin là
vào năm 1992. Kể từ đó ngành sinh học phân tử tiến hành nghiên cứu về bộ gen
tổng hợp aflatoxin từ A. Flavus và A. parasiticus nhanh và chính xác hơn. Bộ gen
trong A. Flavus nằm trong 4.9 mb chromosome. Tác giả Prieto et al chỉ ra rằng việc
bổ sung vào bộ gene loại bỏ các đột biến của A. flavus là các gen được tổng hợp
aflatoxin ở trong gần 90kb đoạn gen vô tính DNA. Yu et al đã sắp xếp lại từng bộ
gen trong A. Flavus và A. parasiticus, và ước lượng kích thước của mỗi bộ khoảng
75kb. Các vị trí liên quan trong bộ và các nucleotide tạo thành của các bộ gene
tương đối giống nhau giữa 2 loài, mặc dù A.parasiticus có bản sao bổ sung của một
vài gen xác định có một số ít phần trong gene nhân đôi.
Việc tìm hiểu về quá trình sinh tổ ng hợp Aflatoxin dựa vào hệ gene trong
A.nidulans có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp sterigmatocystin. qua đó xác
định được tỉ lệ của các gen sinh tổng hợp aflatoxin cũng tâp trung thành bộ. Toàn
bộ nucleotide được tạo thành của A.nidulans cũng như 25 quá trình chuyển đổi để
tạo thành cuống đính bào tử đã được xác định, Việc sắp xếp các gen trong nhóm
này khác với việc sắp xếp các gen trong bộ tạo Aflatoxin nhưng các acid amin bị
giảm đi là giống nhau.
Sinh tổng hợp acid Norsolorinic :
Polyketide là viên gạch cấu trúc cơ bản tạo AFB1 liên quan đến quá trình kéo dài
1 đơn vị hexanoate bởi enzyme polyketide synthase (PKS) mà enzyme này là do tập
hợp của 7 đơn vị acetyl từ malonyl CoA mà không qua sự khử Ketone tạo
noranthrone. Việc tổng hợp acid norsolorinic là giai đoạn trung gian bền vững, được
tạo thành sau quá trình oxi hóa noranthrone từ enzyme oxidase. PKS và enzyme
tổng hợp acid béo (FAS) được lấy từ bộ gen có chứa pksA (pksL1) và fas1. Tác giả
Chang đã cho thấy pksA được xác định thông qua quá trình chuyển mạch NA của
11
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
A. parasiticus với phần DNA tham gia tổng hợp AFlatoxin. Gần 5% chất vận
chuyển bị mất khả năng sản xuất NA khi chất vận chuyển bị phá vỡ trong gene
pksA. Việc phá vỡ gene của pksL1 là do trong chất vận chuyển không liên kết với
Aflatoxin hay NA được xác định qua quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Gene FAS,
fas, được xác định bằng việc thêm vào A.parasiticus mạch, không sản sinh ra
Aflatoxin hay sản phẩm trung gian. Thí nghiệm loại bỏ gene thêm vào là lúc đầu
fas1 tham gia tạo NA và gene đó không cần thiết cho quá trình trưởng thành của
nấm. Gene FAS thứ 2, fas2, nằm sát fas1 làm nhiệm vụ như nhóm phụ tạo chức
năng cho FAS.
Việc phân tích để tạo nucleotide xác định motif thông thường để biết PKS và
FAS có trong sản phẩm gene, có tên là enzyme –cetoacyl synthase, acyltransferase
và protein chất mang acyl. Gene FAS cũng chứa enzyme –ketoacyl reductase, enoyl
reductase và anoyl hydrase. Thiếu enzyme ketoreductase trong PKS bao gồm thiếu
bước khử trong phản ứng PKS sản xuất noranthrone.
3 .1 Norsolorinic acid-averatin
Việc chuyển từ NA thành averatin (AVN) thông qua enzyme ketoreductase
Tương ứng là việc bổ sung vào lỗ hổng do đột biến của A.parasiticus qua viêc tập
hợp NA và aflatoxin. Nor1 mã hóa 1 protein 29kDa có acid amin tương tự như
enzyme dehydrogenase có liên kết NADPH. Tương tự NA đột biến ban đầu, chất
vận chuyển cắt đứt nor1 không tam gia sinh tổng hợp aflatoxin, người ta dự đoán là
có NA-reductase khác. Thực tế thì enzyme reductase thứ 2 này có khả năng chuyển
NA thành AVN khi nghiên cứu in vitro tạo dạng đồng nhất và cho protein phụ
khoảng 40kb. Sử dụng kháng thể đơn tính kháng lại enzyme reductase này. Cary et
al xác định cDNA đơn tính tương đương với gen norA nằm trong bộ gene của
Aflatoxin có trong loài A. parasiticus cũng như loài A.flavus. Các chuỗi acid amin
của NOR1 và NORA có độ đồng nhất thấp (22%) nhưng cả 2 loại đều có motif xác
định enzyme loại dehydrogenase với phần liên kết adenine nucleotide. Để loại bỏ 2
bản sao của norA trong A.parasiticus chưa xác định được. Tuy nhiên, người ta chưa
xác định chính xác chức năng các gene này.
Averatin-versicolorin A:
Gene liên quan đến quá trình chuyển AVN thành versicolorin A (VER A) xác
định gene trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Qua việc sử dụng các đoạn đột
biến, chất ức chế và các chất trung gian phóng xạ, thì quá trình trao đổi chất trong
quá trình chuyển đổi này sẽ quyết định:
AVN Averufanin (AVNN) Averufin (AVF) 1- hydrocyversicolorone
(HVN) versiconal hemiacetal cetate (VHA) Versiconal (VHOH)
12
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
versicolorin B (VERB) VER A (hình 1). Sử dụng cDNA vô tính, Yu et al đã loại
bỏ được gene tương ứng trong bộ gene tổng h ợp Aflatoxin của A.parasiticus và thu
đươc chất vận chuyển tích lũy với AVN. Gene avnA mã hóa 56.3 kDa cytochrome
P450 monooxygenase, gene có liên quan đến quá trình chuyển AVN thành AVNN.
Prieto et al thay đổi gen đột biến của A. flavus thiếu toàn bộ bộ gen Aflatoxin
thành 2 phage cos (5E6 và 8B9) và lấy lại chất vận chuyển tham gia với AVF.
Thêm vào phage cos th ứ 3 sẽ giữ được quá trình sinh tổng hợp aflatoxin trong gene
đột biến này, người ta cho rằng có 1 gene liên quan đến quá trình chuyển AVF
thành VHA nằm ở phage cos 13B9. Gene avf1 nằm trong phần 7kb trên phage cos
13B9. Kết quả phân tích cho thấy phần DNA chứa 2 loại gene, aflB và aflW, mã
hóa protein với các acid amin tương ứng với stc B và stcW.
Quá trình chuyển VHOH thành VER A rất quan trọng trong quá trình sinh tổng
hợp Aflatoxin vì hệ thống dihidrobisfuran sẽ được tạo thành trong bước này.
Dihyrobisfuran là cần thiết cho quá trình đột biến tự n hiên của Aflatoxin B1. Liên
kết đôi giữa vị trí 2 và 3 trong phần difuran là do enzyme cytochrome P450 hay
lipozygenase tạo ra nhóm epoxide linh động có trong thận và gan. Các enzyme
dehydrative cyclization, là quá trình oxy hóa VER B thành VER A cùng enzyme
versicolorin B synthase (VBS), tạo dihydrobisfuran. Gene mã hóa VBS , vbs, tương
ứng với mồi PCR được tạo ra dựa vào phần peptide của enzyme . Sản phẩm gene
vbs cho thấy khả năng đồng nhất đặc trưng củ a các enzyme tự do flavin oxydase và
dehydrogenase. Các nghiên cứu gần đây cho thấy cấu trúc của Aflatoxin B2 đúng
hơn AFB2 khi nó thiếu liên kết đôi trong cấu trúc của bifuran.
3 .2 Versicolorin A – sterigmatocystin
Sterigmatocystin được tạo thành từ VERA thông qua một số phản ứng enzyme
gồm: phản ứng oxy hóa, khử ceton, decarboxyl hóa và methyl hóa. Việc thêm gene
vào VER A của A.parasiticus dẫn đến việc cô lập được ver1A mã hóa 1 NADPH –
ketoreductase. Gene thứ 2, ver1B, trong A.parasiticus có 95% tương đồng với ver1
A và không nằm trong bộ gene.
3 .3 Quá trình chuyển Sterigmatocystin thành Aflatoxin:
Sterigmatoxystin được chuyển thành O-methylsterigmatocystin (OMST) bởi
enzyme O-methyltransferase 40 kDa. Huyết thanh miễn dịch được đưa vào chố ng
lại protein được dùng để che chắn cDNA và tách omt1. Các acid amin từ cDNA xác
định OMT1 có trong chuỗi amino nhờ liên kết S-adenosylmethionine. Cả A. flavus
và A.parasiticus đều chứa 1 bản sao của omt1.
Đoạn gene chuyển OMST thành AFB1 của A. flavus xóa đi bộ gene Aflatoxin.
Chất vận chuyển chứa phage cos không sản sinh ra Aflatoxin hay bất kỳ chất trung
gian nào nhưng có chuyển OMST thành AFB1. Gen ord1 chịu trách nhiệm hoạt hóa
13
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
enzyme nằm ở phần gene DNA 3.3kb trên phage cos 8B9. Sản phẩm của ORD1 là
cytochrome P450 mono oxygenase (CYP64)
4 Phương pháp xác định độc tố
4 .1 Phương pháp truyền thống
4 .1.1 Dùng Kit để xác định Aflatoxin trong thực phẩm
Kit xác định Aflatoxin
- Agri-Screen xác đinh Aflatoxin
- Reveal xác định Aflatoxin
- Veratox xác định Aflatoxin
- Veratox xác định Aflatoxin thử nghiệm đơn (AST)
- Veratox xác định Aflatoxin độ nhạy cao
4 .1.2 Dùng VERATOX
4.1.2.1 Mục đích sử dụng
Veratox xác định Aflatoxin AST (th ử nghiệm đơn Aflatoxin) sử dụng để phân
tích định lượng Aflatoxin trong các mặt hàng như ngũ cốc, bột ngũ cốc, hỗn hợp
protein trong ngũ cốc, hỗn hợp ngũ cốc/ đậu phộng, lúa mỳ, gạo, sữa, tương, hạt
bông, bột hạt bông, đậu phộng, bơ đậu phộng và hỗn hợp khác.
14
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
4.1.2.2 Nguyên tắc
Thí nghiệm này dùng phương pháp cạnh tranh trực tiếp Elisa có thể xác định
chính xác nồng độ Aflatoxin tới cỡ phần tỉ (ppb). Aflatoxin được chiết được chiết từ
mẫu nền với dung dịch methanol bằng cách đánh đều và lọc. Độc tố được chiết ra
trong lọc là mẫu đwocj trộn với độc tố găn enzyme (tiếp hợp). Dung dịch hỗn hợp
này được chuyển tới những giếng tẩm kháng thể, tại đây độc tố tự do và chất tiếp
hợp cạnh tranh để liên kết . Sau khi rửa, chất nền được thêm vào, đ ộ hấp thụ của
mẫu và mẫu so sánh 20ppb được đọc so sánh với đường chuẩn. Kết quả mẫu được
tính toán sau đó.
4.1.2.3 Phương pháp
Thêm 100 ml chất tiếp hợp vào mỗi giếng trộn.
Thêm 100 ml mẫu so sánh vào giếng thứ nhất.
Thêm 100 ml của mẫu đầu tiên vào giếng thư hai và thứ ba.
Trộn đều. Chuyển 100 ml vào mỗi giếng kháng thể. Ủ khoảng 5 phút.
Trút dung dịch từ giếng kháng thể
Rửa sạch với nước loại ion
Thấm khô bằng giấy thấm.
Chuyển 100 ml chất nền từ thuyền thuốc thử vào mỗi giếng kháng thể sử dụng
pipet 12 kênh.
Chuyển 100 ml chất hãm đỏ từ thuyền thuốc thử vào các giếng kháng thể.
Kết quả đọc bằng cách sử dụng bộ đọc giếng với kính lọc 650 nm.
Thông số kỹ thuật của sản phẩm
Giới hạn xác định thấp nhất :5 ppb
Khoảng địmh lượng: 5 ppb - 320 ppb
Mẫu so sánh: 20 ppb
Thời gian thử: 10 phút
Kháng thể phản ứng
Tổng Aflatoxin (B1, B2, G1, G2)
Số test/kit 16
Phê chuẩn USDA/GIPSA # 94-10
15
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
4.1.2.4 Cách tiến hành:
B1:Xử lý mẫu:
B2: Tiến trình thí nghiệm
B3:Đọc kết quả
16
- NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN
4 .1.3 Dùng Reveal
4.1.3.1 Mục đích sử d ụng
Reveal xác định Aflatoxin với mục đích sàng lọc Aflatoxin trong ngũ cốc.
4.1.3.2 Nguyên tắc
Reveal xác định Aflatoxin sử dụng phương pháp màu miễn dịch dòng Lateral bậc
đơn trên cơ sở sự cạnh tranh dạng miễn d ịch. Dịch chiết được thấm qua vùng thuốc
thử, có chứa kháng thể đặc biệt với Aflatoxin tiếp hợp với những tiểu phẩm màu.
Nếu Aflatoxin có mặt, nó sẽ bắt các phức kháng thể tiểu phần. Các phức tiểu phần
kháng thể-Aflatoxin sẽ thấm vào màng có chứa trong phần Aflatoxin tiếp hợp tới
chất mang protein. Vùng này sẽ bắt tất cả các kháng thể Aflatoxin không tạo phức,
cho phép các tiểu phần tập trung và hình thành đường màu.
4.1.3.3 Phương pháp
Mẫu phải được chiết trước khi thử:
17
nguon tai.lieu . vn
