1. Trang Chủ
  2. Luận Văn - Báo Cáo
  3. Luận văn: KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN CHI ĐEN TRAMETES VERSICOLOR L.:Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC (part 6)

Luận văn: KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN CHI ĐEN TRAMETES VERSICOLOR L.:Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC (part 6)

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu – Công ty cổ phần dược liệu TW2 thành phố Hồ Chí Minh. Phòng vi sinh - Bộ môn Công Nghệ sinh Học - Trường đại học Nông Lâm TpHCM. 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 3.2.1. ... 28 chiết được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệ

Thể loại Tài liệu miễn phí Luận Văn - Báo Cáo

Số trang 10

Ngày tạo 8/29/2018 9:09:39 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước

Tên tệp

Tải Luận văn: KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN C... (.pdf)

Xem mẫu

  1. 28 chiết được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao.
  2. 29 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu – Công ty cổ phần dược liệu TW2 thành phố Hồ Chí Minh. Phòng vi sinh - Bộ môn Công Nghệ sinh Học - Trường đại học Nông Lâm TpHCM. 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 3.2.1. Nguyên liệu Nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc do Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu thuộc Công ty cổ phần Dược Liệu TW2 TpHCM cung cấp. 3.2.2. Hoá chất, môi trường sử dụng 3.2.2.1.Hoá chất: Cồn 96oC, Vôi bột, Urea, DAP (diamon phosphat), SA (sulphat amon), Nitrate canxi, supe lân, NPK 20-20-15, Dynamic lifter. 3.2.2.2. Các môi trường sử dụng a. Môi trường PSA (Potato saccharose agar) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g Agar : 20g Nước cất cho đủ : 1000ml
  3. 30 b. Môi trường bán tổng hợp - BTH (Khoai tây - muối khoáng) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 1,5g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml c. Môi trường Crapek [2] Saccharose : 30g NaNO3 : 3g KH2PO4 : 1g MgSO4 : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4 : 0,01g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml d. Môi trường dinh dưỡng bổ sung Nước chiết giá: 100g giá đậu + nước xay nhuyễn lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết giá. Nước chiết bắp: 100g bắp xay + nước nấu chín lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết bắp. Nước chiết khoai tây: khoai tây (200g) gọt vỏ, rủa sạch, cắt sợi, nấu và lọc lấy nước chiết + nước cất để tạo dung dịch nước khoai tây 1 lít. e. Môi trường nhân giống cấp hai Môi trường hạt: Chọn loại lúa gạo tốt, ngâm nước 24 giờ, nấu vừa nứt vỏ trấu, vớt ra để ráo, bổ sung lớp cám bắp 5%. Phân lúa vào các chai thuỷ tinh không quá 2/3 thể tích. Hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong 2 giờ. Để nguội 24 giờ cấy giống gốc từ môi trường thạch, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) để tạo giống trung gian. Môi trường bắp xay: Bắp xay nấu cho nở và bổ sung các thành phần dinh dưỡng.
  4. 31 Môi trường mùn cưa: Mùn cưa cao su khô còn tốt trộn với vôi bột 1%, bổ sung nước, ủ qua đêm và tạo độ ẩm môi trường khoảng 60%. Bảng 3.1: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong mùn cưa (%)[11] Cơ chất Mùn cưa gỗ cao su Mùn cưa gỗ lim Mùn cưa gỗ tạp Nguyên tố N 1,68 ± 0,20 1,02 ± 0,20 1,27 ± 0,20 P 0,48 ± 0,04 0,37 ± 0,03 0,43 ± 0,06 K 1,18 ± 0,05 0,73 ± 0,04 0,77 ± 0,05 Ca 0,12 ± 0,03 0,15 ± 0,05 0,23 ± 0,06 Mg 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 Bảng 3.2: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong các loại bột (%) [11] Bộ t Cám gạo Cám bắp Bột bã đậu phộng Nguyên tố N 3,64 ± 0,70 3,08 ± 0,46 8,86 ± 0,54 P 1,37 ± 0,31 1,92 ± 0,22 0,88 ± 0,41 K 0,65 ± 0,16 0,24 ± 0,14 0,72 ± 0,18 Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa (Vanderberlt, 1954) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) K 3,12 Fe 0,01 Ca 1,50 Cu 0,04 Na 2,09 S 3,40 Mg 3,00 P 3,70 3.2.3. Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị cần sử dụng: đĩa petri, bình tam giác, chai thuỷ tinh, giấy lọc, máy đo pH, tủ ủ, cân điện tử, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ cấy.
  5. 32 3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1. Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 3.3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể Quan sát hình dạng quả thể, cấu tạo quả thể hoàn chỉnh, thân nấm và lớp bào tầng, cấu trúc cắt ngang quả thể, chụp hình. Quan sát hệ sợi trên quả thể dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.1.2. Hệ sợi tơ thứ cấp Lấy mẫu hệ sợi lan trên môi trường thạch cho lên mặt lame, không nhuộm màu mẫu, dùng lamelle đè nhẹ, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40, quan sát hình dạng hệ sợi, vách ngăn ngang, mấu liên kết và sau đó chụp hình. 3.3.1.3. Đảm và đảm bào tử Lấy cốc thuỷ tinh có đựng nước (không đầy đến miệng cốc), đặt quả thể nấm lên trên (quả thể nấm phải lớn hơn đường kính cốc) hướng lớp bào tầng về phía miệng cốc, để nơi kín gió. Sau 1 – 2 ngày, lấy bào tử có trong cốc, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 3.3.2.1. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên 5 môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau. Môi trường 1: PGA Môi trường 2: Bán tổng hợp (Khoai tây - muối khoáng) Môi trường 3: Crapek Môi trường 4: PGA + 10% nước dừa Môi trường 5: PGA + 10% nước chiết giá Tất cả các môi trường đều được hấp khử trùng 121oC/ 30phút, để nguội 50 – 55oC và đổ vào đĩa petri vô trùng. Mỗi môi trường đổ 10 đĩa. Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa 1 hạt lúa từ môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt). Tiến hành ủ ở nhiệt độ
  6. 33 phòng (30 ± 2oC). Ba ngày sau khi cấy, bắt đầu tiến hành đo đường kính hệ sợi lan theo thời gian. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Môi trường sử dụng là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng). Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng (mỗi môi trường đổ 10 đĩa). Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa một hạt lúa từ môi trường hạt. Tiến hành ủ ở hai mức nhiệt độ 27 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Sau 3 ngày tiến hành thu thập số liệu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH Môi trường dùng làm thí nghiệm là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng), điều chỉnh về các pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; 7. Điều chỉnh pH acid dùng dung dịch HCl 1M và pH kiềm dùng NaOH 1M. Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút, mỗi thí nghiệm đổ 10 đĩa, sau 24h cấy giống. Ủ nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Bắt đầu đo và thu thập số liệu sau 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai Thí nghiệm được tiến hành trên các môi trường có bổ sung thành phần dinh dường khác nhau để tìm môi trường nhân giống cấp hai tối ưu. MT 1: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám gạo 5% MT 2: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám bắp 5% MT 3: Lúa 80% Mùn cưa 5% Bắp xay 15% MT 4: Bắp xay 50% Cám gạo 25% Mùn cưa 25%
  7. 34 MT 5: Bắp xay 50% Mùn cưa 25% Đậu xanh 25% MT 6: Bắp xay 50% Mùn cưa 50% MT 7: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% (NH4)2SO4 0,2% MT 8: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% Urea 0,1% MT 9: Mùn cưa 50% Cám bắp 50% Tất cả các môi trường đều được bổ sung nước để tạo ẩm độ (khoảng 60%) cho hệ sợi nấm phát triển. Mỗi môi trường phân vào 10 ống nghiệm, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ cấy giống từ môi trưòng hạt, ủ ở nhiệt độ phòng (khoảng 30 ± 2oC). Tiến hành đo và thu thập số liệu sau 4, 6, 8, 10 và 12 ngày. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp lại. Các chỉ tiêu theo dõi, quan sát. - Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi qua các ngày 4, 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy. - Màu sắc hệ sợi trên ống nghiệm. 3.3.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Thử nghiệm khả năng cho quả thể trên các môi trường sau: MT 1: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% MT 2: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% + DAP 0,25% MT 3: Mùn cưa + cám gạo 5% + SA 0,5% + DAP 0,25% MT 4: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Nitrate Canxi 0,5% + DAP 0,25% MT 5: Mùn cưa + Cám gạo 5% + NPK 20-20-15 0,5% MT 6: Mùn cưa + Cám gạo 10% MT 7: Mùn cưa + Cám bắp 10% MT 8: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Supe lân 0,5% + Urea 0,25%
  8. 35 MT 9: Mùn cưa + Urea 0,25% + DAP 0,25% MT 10: Mùn cưa + Cám 5% + Dynamic lifter 0,25% Môi trường mùn cưa sau khi trộn vôi 1%, ủ qua đêm, được bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau và cho vào bịch polypropylen. Mỗi bịch nặng 600g và có ẩm độ 65%. Mỗi công thức cho vào 10 bịch, hấp khủ trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ, để cho các bịch môi trường thật nguội và cấy giống từ môi trường lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi thời gian xuất hiện hệ sợi nấm trên các bịch môi trường và thời gian xuất hiện tai nấm ở các nghiệm thức. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar. TN 1: Thử nghiệm trên 3 loại môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau Môi trường tự nhiên: PS (khoai tây + đường) Môi trường bán tổng hợp (BTH): khoai tây + muối khoáng + đường Môi trường tổng hợp: Crapek Mục đích thí nghiệm: dựa trên lượng sinh khối thu được từ các môi trường trong TN1, chọn môi trường có lượng sinh khối nhiều nhất để làm đối chứng cho TN2. TN 2: Thử nghiệm trên các môi trường được bổ sung các nguồn dinh dưỡng tự nhiên MT 1: PS + 5% Nước chiết bắp MT 2: PS + 10% Nước chiết bắp MT 3: PS + 15% Nước chiết bắp MT 4: PS + 5% Nước chiết giá MT 5: PS + 10% Nước chiết giá MT 6: PS + 15% Nước chiết giá MT 7: PS + 5% Nước dừa MT 8: PS + 10% Nước dừa MT 9: PS + 15% Nước dừa MTĐC: MT TN1 Cho 50ml môi trường vào chai thuỷ tinh (250ml hay 500ml). Mỗi môi trường thực hiện 10 chai, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/30phút. Để nguội một
  9. 36 ngày, cấy giống từ môi trường lúa, mỗi chai môi trường cấy một hạt lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC), tiến hành thu và cân sinh khối sau 5, 10, 15 ngày. Xử lý số liệu để chọn ra môi trường tạo sinh khối nhiều nhất. 3.3.6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor sấy ở 45oC đến khối lượng không đổi Sinh khối thu được từ TN1 và TN2 sấy khô ở 45oC xay nhuyễn cân P(g) ly trích lọc trên giấy đã cân bì định lượng. So sánh tỉ lệ hợp chất polysaccharide thô thu được giữa các nghiệm thức. So sánh tỉ lệ polysaccharide thô trích từ hệ sợi và quả thể nấm vân chi. Sinh khối lấy từ môi trường BTH sấy khô xay nhuyễn cân P(g) ly trích định lượng. Quả thể nấm sấy khô xay nhuyễn cân P(g) ly trích định lượng.
  10. 37 Bột nấm P(g) -Nguyên liệu : nước = 1:35 – 40 -Đun cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 1 Bã lần 1 -Nguyên liệu : nước = 1:10 -Cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 2 Bã lần 2 -Nguyên liệu : nước = 1:10 -Đun cách thuỷ 60 phút -Lọc Dịch chiết lần 3 Bã lần 3 Dịch chiết vân chi -Cô cách thuỷ Cao nước -Tủa bằng cồn 96o -Lọc tủa Polysaccharide thô Sơ đồ 3.2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi [16], [20]
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược