- Trang Chủ
- Khoa học tự nhiên
- Luận văn : ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR TP. HCM SẢN XUẤT part 2
Xem mẫu
- 11
Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng
khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều so
với các aflatoxin khác.
Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đ ã tiến h ành thực hiện đề tài
Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đ ã cho
hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1.
Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính,
cũng có khả năng gây hại cao cho n gười và vật nuôi, h ơn nữa cấu trúc hoá học lại khá
tương đồng với aflatoxin B1 n ên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành
nghiên cứu.
Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS.
TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải,
tôi tiến h ành đề tài “Đánh giá khả năng bắ t aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch
do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”.
1.2 Mục đích
Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch.
1.3 Yêu cầu
Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch trong việc bắt aflatoxin G1:
Độ nhạy của cột
Độ lặp lại của cột
- 12
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cương về aflatoxin
2.1.1 Lịch sử phát hiện
Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi
mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận m à nguyên nhân
không đư ợc biết rõ. Do đó, người ta gọi là b ệnh “X” của gà tây.
Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò
ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đ ã nhanh chóng
tìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họ
cũng thấy rằng bệnh này không những xảy ra đối với gia cầm mà còn với cả gia
súc, đặc biệt là heo, bê, cừu…
Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan,
các nhà bác học đ ã quan sát và phân lập được lo ài vi nấm Aspergillus flavus trên
các hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm
nấm Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong b ản báo cáo của Forgacs và
Carl xuất bản năm 1962, n gười ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus và
toxin có ngh ĩa là chất độc).
Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con
đường polyketide của một số loài n ấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng
50% chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4],
Aspergillus nomius; ngoài ra còn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai
trò gây bệnh trong thực tế. Ở A. flavus và A. parasiticus, con đường sinh tổng h ợp
aflatoxin liên quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa b ởi 25 gen tập trung
thành nhóm trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19].
(1) (2)
Hình 2.1: A. flavus (1) [20] và A. parasiticus (2) [21 ].
- 13
Việc khám phá ra aflatoxin đ ã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập
trung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ của
con người và động vật.
2.1.2 Phân loại
Có thể nói Sargeant (1962) là người có công xác định các độc tố n ày. Chúng
là các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau và có khung hoá học giống với dẫn
xu ất của cumarin nên gọi là flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin,
2 nhân furan và 1 vòng lacton [11].
Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4].
Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1,
AFB2, AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV:
B: Blue; G: Green). Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có
1 nhóm chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton.
O
O
O
O
O
O
O
P L
L
C
F
C
F
O O
O O OMe
O Me
AFG1
AFB1
F: Vòng fu ran
C: Vò ng cumarin
L: Vò ng lactone
P: Vòng p entenone
Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của AFB1 và AFG1.
Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm
và trong cơ thể động vật.
AFB2 và AFG2 là d ẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1.
AFB2a và AFG2a là d ẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1.
AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa,
thận và gan động vật.
Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol),
dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1,
AFQ1…
- 14
O
O O
O
O O
O
O
O O O
OMe OMe
AFB2 AFG2
O
O O
O
O O O
HO O O O
HO O
OMe OMe
AFB2a AFG2a
O
O O
O
O O
OH OH
O O O O
O Me O Me
AFM1 AFM2
Hình 2.3 : Cấu trúc hoá học của các aflatoxin.
2.1.3 Tính chất hóa lí
Aflatoxin dễ bị huỷ bởi những chất kiềm, nhưng tương đối bền với nhiệt. Ở
nhiệt độ cao h ơn 100 oC chỉ khử đư ợc phần n ào aflatoxin.
Aflatoxin ít tan trong nước, tan trong các dung môi phân cực như:
chloroform, acetonitril, aceton, methanol…
Aflatoxin không tan trong những dung môi hòa tan chất béo nh ư n-hexan,
ether ethylic, ether dầu hoả…
Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng b ước sóng 440
nm khi kích thích b ởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10].
Các đ ặc tính lí hóa đư ợc trình bày trong phụ lục 1.
2.1.4 Tác động sinh học
Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con
người. Tuy nhiên, mức độ độc ho àn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống lo ài, lứa
tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm
lượng chất độc ăn ph ải.
- 15
Hấp thu qua đường tiêu hoá là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1
vào cơ th ể với 3 kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan trong lipid
và vận chuyển nhờ protein mang. Sau đó, AFB1 đ ược vận chuyển trong hệ tuần
hoàn nhờ liên kết với các tế b ào máu ho ặc protein huyết tương (90% ở dạng liên
kết với albumin). Sau khi vào gan qua h ệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ
yếu ở gan [11]. Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp:
O
O
DNA adducts OH OH
O O
O
O O O
O
OM e OM e
AFB1-8,9-epoxide Aflatoxicol
O
O O
O
O
O
O O
O
HO
GLUCURONIDE
Conjugates
HO O
O O CH3
O
OMe O O OM e
AFB1-dhd AFP1
AFB1
O
O O
O O
O
Protein adducts
O O O
OH
OH
HO O O OMe O O O O
OM e OMe
AFM1
AFB2a
AFQ1
Milk
Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hoá cuả AFB1 [13].
Các chất chuyển hóa được cơ thể cố gắng bài thải, như: AFM1 và AFM2 qua
sữa; AFP1 và AFQ1 qua nước tiểu.
Đáng kể, dưới xúc tác của hệ enzyme monooxygenase trong cytochrome P450
(CYP 450) rất phong phú ở tế bào gan, chất tạo thành là AFB1-8,9-epoxide được coi
như ch ất biến dưỡng có hoạt tính rất cao, có thể gắn với các đaị phân tử (DNA, RNA
và protein) làm rối loạn hoạt động bình thường của tế b ào (Swenson, 1975).
- 16
2.1.4.1 Độc tính cấp của aflatoxin
Nhiễm độc cấp tính khi ăn phải một lượng lớn aflatoxin. Thú non
mẫn cảm hơn thú trưởng thành, gia cầm mẫn cảm hơn gia súc, được biểu hiện theo thứ
tự sau:
Vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà > chó > heo > bò > ngựa > cừu
(Allcroft, 1962) [11].
Tính gây độc cấp thể hiện qua liều gây chết 50% (LD50).
Bảng 2.1: LD50 của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật
(Ciegler, 1975) [2]
Loài động vật LD50
(Xếp theo thứ tự (mg/ kg th ể trọng)
mẫn cảm)
Vịt con 0,3-0,6
Heo 0,6
Cá hồi 0,8
Chó 1,0
Chuột lang 1,4-2,0
Cừu 2,0
Kh ỉ 2,2
Chuột cống 5,5-17,9
Gà 6,3
Chuột bạch 9,0
Theo b ản g trên và b ảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD50 trên
động vật (xem phụ lục 2), có thể thấy aflatoxin thuộc nhóm độc tố cực độc. Triệu
chứng nhiễm độc thể hiện qua sự tổn thương ở gan và triệu chứng thần kinh nh ư nằm
liệt và co giật. Chết có thể xảy ra đột ngột sau một thời gian ngắn, thường dưới 72 giờ.
Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ
máu ở phổi [11 ]. Nguyên nhân gây chết là do gan b ị huỷ hoại rất nhanh (necrosis) theo
cơ ch ế phân tử:
- 17
O
O
O
O
O
O
enzyme HO
Gan
O O OM e
O
HO O OMe
AFB1 AFB1-dhd
acid base (pH=7,4)
R2 N C=O O
O O
O
H OH
H H OH
CNC OC
HO
R1 H HO
R3 protein
C
CH N CH
O
H
R4 N C=O
O O
H OMe OM e
Shiff's base Di-aldehyd resonance hybrid
Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5]
Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo
thành kiềm Shiff (Shiff’s base). Các kiềm Shiff có thể ức chế sinh tổng hợp DNA,
RNA dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động ở gan bị rối loạn tạo nên
tình trạng nhiễm độc cấp tính.
Như vậy, AFG1 cũng có thể tạo thành kiềm Shiff do cũng mang liên
kết đôi ở vị trí 8,9 ở đầu cùng trên vòng furan. Liên kết này đư ợc b ão hoà trong cấu
trúc của AFB2 và AFG2, do đó, không thể trực tiếp tạo th ành kiềm Shiff nên mang
tính độ c ít hơn so với AFB1 và AFG1 [5].
2.1.4.2 Độc tính mãn
Th ường xảy ra nhiều h ơn so với nhiễm độc cấp tính và có tác động
dài hơn do cơ th ể có thể chịu đựng được một mức nào đó trong kh ẩu phần.
Khi có sự nhiễm độc m ãn tính, các triệu chứng thấy đư ợc là kém ăn
và ch ậm lớn; gan chịu ảnh h ưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết. Khi kiểm tra vi
thể thì xuất hiện sự thoái hoá tế bào biểu mô, thoái hoá mỡ gan, tế bào lympho b ị thâm
nhiễm. Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan. Nếu nhiễm aflatoxin trong
thời kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2].
Năm 1988, IARC đã xếp AFB1 vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người,
đặc biệt là ung thư gan [22]. Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin trong 89 ngày sẽ thấy xuất
hiện ung th ư gan sau một năm. Tại Việt Nam đ ã có công trình nghiên cứu tìm
- 18
aflatoxin trong dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát đều có hàm lượng từ
1,1 – 3,5 ppb [13 ].
Cơ chế phân tử của nhiễm độc mãn tính:
OMe
O
O
O AFB1-N7-Gua
O O OH
O
O
DNA
O O
O OH
O O OMe O
- -
+ O3PO OPO3
N
AFB1-8,9-exo epoxide
HN
AP Site
N
H2N N
OMe
O
O
- -
O3PO OPO3
O
AFB1-N7-Gua O
O
DNA Adduct
O OH
O
N
HN CHO
H
N
H2N N
O
AFB1-FAPY
DNA Adduct
- -
O3PO OPO3
Hình 2.6: AFB1 -8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001) [14].
AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA ở vị trí N7 của một
guanine. Do cầu nối glycoside mất ổn định, nhóm purine có thể bị tách khỏi DNA.
Ho ặc khả năng khác là vòng imidazole trong cấu trúc purine bị mở ra th ành cấu trúc
formamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định và tồn tại trong điều kiện sinh học. Các
điểm đột biến do AFB1 thư ờng nhận thấy là sự đảo chuyển GC TA (dị hoán). Điểm
nóng của đột biến đã được phát hiện là ở vị trí thứ ba trong đơn vị m ã (codon) 249 của
gen p53. Gen này mã hoá cho một phosphoprotein có hoạt tính tăng cường hoặc kiềm
ch ế phiên mã của một số gen có chức năng kiểm soát chu trình nhân lên của tế bào, đ ể
ngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, có thể dẫn đến h ình thành u. Khi
cấu trúc DNA bị biến đổi, tế b ào phản ứng lại bằng cách thể hiện nhiều
phosphoprotein p53 đ ể ức chế sự sao chép của DNA bị biến đổi. Nếu thời gian sửa
- 19
chữa lại DNA kịp thời (do một số enzyme) trước khi DNA biến đổi được sao chép,
bảo tồn di truyền được ổn định. Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếp
đều làm tăng mức protein p53 tế bào. Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53
bị biến đổi, mất hoạt tính, hậu quả là tế b ào tăng trưởng không kiểm soát dẫn đến hình
thành khối u (Bennett và Klich, 2003) [14]. Liên quan giữa nhiễm siêu vi viêm gan B
(HBV), ung thư tế bào gan và vai trò của p53 cũng đ ã đ ược khảo sát và nghiên cứu
nhiều. Với bệnh nhân trong nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gan
cao hơn 3 lần so với trường hợp âm tính. Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặt
HbsAg trong huyết thanh, tỉ lệ này là 6 lần cao hơn bệnh nhân âm tính HbsAg. Và nếu
xuất hiện cả AFB1-N7-Gua và HbsAg, tỉ lệ n ày cao gấp 60 lần [14].
2 .1.5 Sự hiện diện của aflatoxin trong thực phẩm
Theo tài liệu của FAO, không có thực phẩm nào được xem như an toàn
tuyệt đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn
từ lúc cây trồng còn ở ngoài đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận
chuyển. Và theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên th ế giới bị
nhiễm độc tố vi nấm [4]. Hầu hết các số liệu liên quan cho th ấy sự nhiễm aflatoxin
thường xảy ra nhất ở đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạt
khác như gạo, lúa mì, đậu nành, hạt bông vải… Theo Carlos A. Muro-Cacho (2004),
sự tiêu thụ aflatoxin của con người từ 0 – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200
ng/kg/ngày [1 5].
Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho sự phát triển vi
nấm và sản sinh độc tố trong thực phẩm, nhất là aflatoxin. Do đó, vấn đề an toàn thực
phẩm được đặt ra nhằm hạn chế những thiệt hại về kinh tế (gây chết đ àn vịt, gà, lợn…)
cũng như bảo đảm an toàn thực phẩm cho người, vì những dạng chuyển hóa của
aflatoxin còn độc tính vẫn có thể hiện diện trong gan, sữa, trứng, là những thức ăn
hằng ngày của người.
2.1.6 Giới hạn về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc
Aflatoxin hiện diện trong thực phẩm như là một sự nhiễm bẩn tự nhiên nên
con người không thể kiểm soát để ngăn chặn chúng. Dựa vào nhiều yếu tố nh ư: số liệu
giám sát, sự phân bố aflatoxin trong thực phẩm, dữ liệu về độc chất học, phương pháp
phân tích và tiêu chuẩn cho phép của các quốc gia có quan hệ mua bán với nhau m à
- 20
từng quốc gia, từng khu vực trên th ế giới ra các quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin
tổng cộng tối đa cho phép trong các loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau.
Bảng 2.2 : Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14 ]
Loaị thực phẩm Đối tượng sử dụng Giới hạn (ppb)
Sữa nước Trẻ em < 3 tuổi 0,03
Sữa bột Trẻ em < 3 tuổi 0 ,3
Sữa nước Thông dụng 0,05
Sữa bột Thông dụng 0 ,5
Dầu ăn và các chất béo 5
Thực phẩm Trẻ em và thiếu niên 1
Thực phẩm Các loaị 10
Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm
hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm
ban hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT.
Bảng 2.3 : Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam
STT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối
đa cho phép (ppm)
1 Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn 10
2 Aflatoxin M1 Sữa 0.5
3 Các độc tố vi nấm khác Thức ăn 35
Bảng 2.4 : Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm.
Lo ại vật nuôi AFB1 (ppb) AFT tổng (ppb)
Gà con từ 1-28 ngày tuổi 20 30
Nhóm gà còn lại 30 50
Vịt con từ 1 -28 ngày tuổi Không có 10
Nhóm vịt còn lại 10 20
Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tu ổi 10 30
Nhóm lợn còn lại 100 200
Bò nuôi lấy sữa 20 50
nguon tai.lieu . vn
