1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Luận văn : Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm Rhizoctonia solani Kuhn part 2

Luận văn : Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm Rhizoctonia solani Kuhn part 2

Hình 1: Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert Ưu điểm của phương pháp  Trình tự có thể được xác định trên cơ sở bản đồ giới hạn (restriction).  Trình tự có thể xác định được rất gần với vị trí đánh dấu. Khuyết điểm của phương pháp:  Trình tự nhận được thường rất ít.  Các phản ứng xảy ra chậm và độ tin cậy thấp.  Phản ứng đòi hỏi nhiều hóa chất có tính chất ngẫu nhiên. ... chuỗi đánh dấu (P32) ddNTP Reaction Mix 5’- xử lí với hoá chất để cắt đứt tại vị 4 tubes CTA G trí các b

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 10

Ngày tạo 8/29/2018 9:09:34 PM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước

Tên tệp

Tải Luận văn : Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của... (.pdf)

Xem mẫu

  1. chuỗi đánh dấu (P32) ddNTP Reaction Mix 5’- xử lí với hoá chất để cắt đứt tại vị 4 tubes CTA G trí các base đặc biệt. 3’ G-rxn A>G T>C G -rxn C-rxn -rxn C A T 5’- T C C C 5’- A C T A 5’- G C G 5’ Hình 1: Lược đồ đọc trình tự của phương pháp Maxam và Gilbert Ưu điểm của phương pháp  Trình tự có thể được xác định trên cơ sở bản đồ giới hạn (restriction).  Trình tự có thể xác định được rất gần với vị trí đánh dấu. Khuyết điểm của phương pháp:  Trình tự nhận được thường rất ít.  Các phản ứng xảy ra chậm và độ tin cậy thấp.  Phản ứng đòi hỏi nhiều hóa chất có tính chất ngẫu nhiên.  Hóa chất sử dụng cho phương pháp này rất độc hại cho người. 2.3.2.2. Phƣơng pháp đọc chuỗi mã Sanger Sanger và cộng sự đã phát minh phương pháp giải trình tự bằng enzyme hay còn gọi là phương pháp dideoxynucleotide (1977). Nguyên tắc cơ bản của phương pháp dideoxynucleotide dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí đầu 3’-OH, khi 11
  2. gặp các nucleotide không có nhóm –OH (dideoxynucleotide) thì phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một các ngẫu nhiên. Thành phần của phản ứng sequencing cũng gần giống như thành phần trong một phản ứng PCR gồm 1 primer, Taq polymerase, dung dich đệm, DNA khuôn và phần khác là dideoxynucleotide. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn DNA dài ngắn khác nhau một nucleotide, nhờ điện di trên gel polyacrylamide mà ta có thể phân biệt các đoạn này. ddNTP Reaction Mix ống phản ống phản ống phản ống phản ứng A ứng T ứng C ứng G dATP dATP dATP dATP C T AG dCTP dCTP dCTP dCTP dTTP dTTP dTTP dTTP dGTP dGTP dGTP dGTP ddCTP ddGTP ddTTP ddATP đoạn DNA cần giải trình tự 3’ CCTATGGAATGC Primer sequencing sản phẩm * * * * * Phãng x¹ tù ghi sîi AND ®¬n tæng hîp trong mçi èng ph¶n øng. Hình 2: Lược đồ phương pháp đọc trình tự của Sanger 12
  3. Base Base (P)-(P)-(P)- O (P)-(P)-(P)- O (A) (B) H Khi một ddNTP mới được thêm OH H H vào để kéo dài chuỗi DNA thì sẽ không thêm vào được vì dNTP ddNTP không có nhóm –OH. Hình 3: Lược đồ công thức của dNTP và ddNTP A: dNTP B: ddNTP 2.4. Vùng ITS (internal transcribed spacer) của rDNA (ribosomal deoxynucleotide acide) ITS1F ITS5 ITS1 ITS3 ITS1 ITS2 18S 5,8S 28S ITS4 ITS2 ITS4B Hình 4: Lược đồ đoạn ITS – rDNA và các primer Trình tự của rDNA được dùng để nghiên cứu rất nhiều về mối quan hệ di truyền của nhiều dòng nấm. Đối với nấm R. solani, rDNA có chứa các trình tự của các ribosome 18S; 5,8S; 28S và các vùng ITS nằm xen kẽ giữa các trình tự rDNA đó. Vùng ITS này đã được nghiên cứu rất nhiều bằng kỹ thuật PCR, RFLP và kỹ thuật đọc trình tự (Kuninaga và ctv, 1997). Vùng ITS lặp lại rất nhiều lần trong hệ gen của nấm. Trình tự của các vùng ITS này có tính bảo toàn cao, đây là những vị trí rất thuận lợi 13
  4. cho việc thiết kế các primer cho phản ứng PCR, RAPD, đọc trình tự. Nhưng cũng có những vùng biến động rất lớn, đặc điểm này thích hợp cho việc đánh giá sự đa dạng di truyền của các dòng nấm khác nhau bằng kỹ thuật RFLP. Ở nấm R. solani sự đa dạng di truyền có liên quan nhiều tới trình tự của các đoạn ITS. Khi các dòng nấm gần giống nhau về mặt di truyền thì chúng càng giống nhau về trình tự của các đoạn ITS. 2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về sự đa dang di truyền của nấm Rhizoctoniac solani 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997), bằng phương pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR với 2 primer riệng biệt ERIC1 và ERIC2 đã phân chia 137 dòng nấm Rhizoctonia solani Kuhn thu thập ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau. 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Kuninaga và ctv (1997), đã phân tích trình tự của rDNA chứa những vùng ITS và 5,8S rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa 45 dòng nấm R. Solani đại diện cho các nhóm liên hợp khác nhau. Kết quả của họ cho thấy trình tự rDNA 5,8S thì hoàn toàn bảo toàn trong khi trình tự của các vùng ITS lại có sự biến động cao giữa các dòng. Trình tự của các vùng ITS giữa các dòng trong cùng một nhóm phụ có tỉ lệ tương đồng là 96%. Đối với các dòng thuộc các nhóm phụ khác nhau trong cùng nhóm liên hợp thì tỉ lệ này là 66 – 100%. Đối với các dòng thuộc các nhóm liên hợp khác nhau thì tỉ lệ này là 55 – 96 %. Marianne và ctv (1996), đã thực hiện phản ứng PCR trên vùng ITS và 5,8S rDNA của rDNA và đọc trình tự vùng này đối với 10 dòng nấm Rhizoctonia solani gồm 9 dòng nấm thuộc nhóm tiếp hợp AG4 và 1 dòng nấm thuộc nhóm tiếp hợp AG1. Ông cho rằng 5,8S rDNA thì bảo toàn và hai vùng ITS thì có sự khác nhau giữa các dòng nấm. Dựa vào kết quả đọc trình tự trên ông đã chia các 9 dòng nấm trong nhóm AG4 thành 3 nhóm phụ. Matsumoto và ctv (1996) đã dùng kỹ thuật RFLP dựa trên đoạn 28S rDNA cũng đã xác định sự đa dạng di truyền giữa các nhóm tiếp hợp khác nhau. Khi cắt enzyme giới hạn HpaII đối với các dòng thuộc nhóm phụ AG-2- 14
  5. 1và AG-2-2 thì không có sự khác biệt về vị trí giới hạn trong đoạn DNA này. Nhưng cắt bằng enzyme HhaI thì có sự khác biệt về vị trí giới hạn trong đoạn DNA này giữa các nhóm phụ AG-2-2-IIIB và AG-2-2-IV. Ngoài ra, khi cắt bằng enzyme BamHI, HhaI và HpaI đối với các dòng nấm AG-HG-I, HG-II của nhóm AG4 thí cũng thấy có sự khác biệt. Schneider và ctv (1997) đã thực hiện phản ứng PCR trên vùng ITS – rDNA với 2 primer ITS1 và ITS4 đối với các dòng nấm Rhizoctonia solani phân lập trên cây hoa tulip. Ông cho rằng ông thu được là các đoạn DNA có kích thước từ 645 – 740 bp. 15
  6. PHẦN III PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Địa điểm và thời gian nghiên cứu  Địa điểm:  Phòng thực tập bệnh cây bộ môn bảo vệ thực vật, khoa Nông Học Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.  Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.  Thời gian: từ tháng 3 – 2005 đến tháng 8 – 2005. 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1. Lấy mẫu và phân lập Thu thập mẫu lúa bệnh khô vằn ở một số tỉnh phía nam như: Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, … Thu thập các mẫu lúa có triệu chứng bệnh đốm vằn do nấm R.solani gây ra. Sau khi lấy về cắt mẫu nhỏ ra khoảng 1 – 2mm chọn những nơi tiếp giáp giữa phần bệnh và phần không bệnh. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch, sau đó rửa với cồn 700 trong 1 phút. Rửa với nước vô trùng cho sạch cồn và tiếp tục rửa với dung dịch NaOCl 0,5% trong 1 phút. Rửa lại với nước vô trùng 3 lần cho sạch NaOCl (Hsiang và Dean, 2001). Làm khô mẫu trong giấy thấm đã được sấy diệt khuẩn. Cấy mẫu đã xử lí vào đĩa petri có chứa môi trường agar nước. Khi xuất hiện các sợi nấm thì cắt đầu sợi nấm và chuyển lên môi trường PGA (potato glucose agar). 3.2.2. Môi trƣờng phân lập và cấy nấm R. solani  Môi trường phân lập nấm R. solani chọn môi trường WA (water agar) Thành phần trong một lit môi trường gồm có: 18 g agar Nước cất vừa đủ 1lit  Nuôi cấy nấm trên môi trường PGA (potato glucose agar) 16
  7. Trong 1 lit môi trường có: 20g glucose 200g khoai tây 18g agar 1 lit nước cất 3.2.3. Nuôi thu sinh khối Nuôi thu sinh khối trong môi trường lỏng PGB (potato glucose broth) không có agar. Nấm dược nuôi cấy lắc trong máy lắc định ôn ở 28 0C trong vòng 3 – 4 ngày thì thu sinh khối được. Làm sạch khối sợi nấm và để khô chuẩn bị cho quá trình li trích DNA. 3.2.4. Li trích DNA Chúng tôi li trích theo hai qui trình.  Qui trình 1 ( Lee và Taylor, 1990)  Bước 1: Nghiền mịn khối sợi nấm trong nitơ lỏng  Bước 2: cho bột nấm đã nghiền trong nitơ lỏng vào eppendorf 1.5ml và cho thêm 600-700µl dung dịch li trích (200mM HCl pH=8,5; 250mM NaCl, 25mM EDTA và SDS 0,5%) lắc đều.  Bước 3: Ủ trong 1h ở nhiệt độ là 650C.  Bước 4: thêm vào ống 600 µl hỗn hợp dung dịch phenol:chloroform:isoamyl với tỉ lệ 25:24:1 đã cân bằng, lắc đều.  Bước 5 : li tâm 14000g/15phút  Bước 6 : thu 400 µl lấy phần nước ở trên và chuyển vào eppendorf mới.  Bước 7: cho vào 0.03V(6 µl) amonium acetate 5M và 100µl isopropanol.  Bước 8 : li tâm 14000g/5phút.  Bước 9 : đổ bỏ dung dịch nổi ở trên thu lấy cặn.  Bước 10 : rửa cặn với ethanol 70% lạnh 3 lần.  Bước 11 : làm khô ta thu được cặn DNA.  Bước 12: hòa tan cặn DNA trong dung dịch TE 1X, thu được dung dịch DNA. 17
  8.  Qui trình 2: chúng tôi có cải tiến thêm 3 bước mới vào qui trình 1, sau bước 6. Từ bước 1 – 6 như qui trình 1  Bước 7 : cho thêm 400µl hỗn hợp dung dịch chloroform:isoamyl (24:1).  Bước 8: li tâm 14000g/15phút.  Bước 9: hút lấy 200µl dung dịch nổi chuyển sang eppendorf mới. Các bước còn lại tương tự qui trình 1. Đo nồng độ DNA bằng phƣơng pháp đo OD Phương pháp này giúp chúng tôi có thể xác định tương đối chính xác nồng độ DNA và làm cơ sở để pha loãng mẫu cho phản ứng PCR. Khi thực hiện đo OD, tỉ lệ pha loãng DNA : buffer là 1 : 100. Công thức tính nồng độ DNA : Nồng độ DNA ban đầu = (-36 x A280 +62,9 x A260) x 100 (ng/µl) Trong đó A280 : bước sóng 280nm A 260: bước sóng 260 nm 3.2.5. Phản ứng PCR Phản ứng được thực hiện với các primer ITS4 và ITS5 cho vùng ITS của rDNA (White và ctv, 1999). Trình tự của primer ITS 4: 5’- TCCTCCGCTTATTATTGATATGC- 3’ Trình tự của primer ITS5: 5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3’ Sản phẩm sau khi khuếch đại có kích thước khoảng 700 – 800bp. Thể tích của mỗi phản ứng là 25µl. 18
  9. Bảng 1. Thành phần của phản ứng PCR Nồng độ đầu Nồng độ Thể tích 1 cuối phản ứng 2,5μl PCR buffer 10X 1X 0,75μl MgCl2 50mM 1,5mM 2μl dNTP 2mM 0,16mM 25μM 1μM 1μl primer 1μl Taq DNA polymerase 1U 0,04U DNA khuôn 50 – 100 ng 1μl Nước Vừa đủ 25 μl Qui trình phản ứng được đặt vào máy điều nhiệt tuần hoàn với chu kì như sau: Bảng 2. Qui trinh nhiệt của phản ứng PCR Các bước Nhiệt độ Thời gian 940C Biến tính (denature) 3 phút Số chu kì lặp lại 30 chu kì 940C Tách đoạn DNA 1 phút 560C Bắt cặp (Anealing) 45giây 720C Kéo dài (extension) 1 phút 720C Kéo dài 7 phút 3.2.6. Sequencing các dòng nấm với 2 primer ITS1 và ITS4 Trình tự của các primer ITS1 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’. ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTATTGATATGC- 3’. Trước khi đọc trình tự DNA thì sản phẩm PCR cần phải được tinh sạch. Thành phần một phản ứng  Bigdye 2,5X 2 l 19
  10.  Bigdye buffer 5X 1 l  Sản phẩm PCR 3 –10 ng 1 l  Primer 3,2 pmol 1 l  Nước 5 l Trong bigdye bao gồm cả enzyme kéo dài mẫu Trong bigdye buffer bao gồm cả dNTP, ddNTP Qui trình chạy chu kì (cycle) như sau:  960C 1 phút  960C 10 giây  500C 5 giây  600C 4 phút Lặp lại 25 chu kỳ. Sau khi chạy chu kì (cycle) thì cần phải tinh sạch sản phẩm để thực hiện phản ứng đọc sequencing. Qui trình thực hiện như sau:  Thêm vào 2,5 l EDTA 125mM mỗi ống eppendorf phản ứng.  Thêm vào 30 l ethanol 100% vào mỗi eppendorf, đảo nhẹ.  Để ở nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 12000 vòng 30 phút, 40C   Loại bỏ dịch trong  Cho 30 l ethanol 70% vào mỗi eppendorf Li tâm 12000 vòng, 20 phút, 40C   Hút bỏ dịch trong và để khô Qui trình biến tính  Cho vào mỗi eppendorf 10 l Hidi Biến tính ở 950C trong 2 phút   Đưa nhanh vào đá  Sau đó cho 10 l mẫu này vào máy giải trình tự. 20
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược