- Trang Chủ
- Khoa học tự nhiên
- Luận văn : BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP part 3
Xem mẫu
- 19
Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR không
những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm
mà còn có thể phân loại kiểu di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi
cấy được vi khuẩn. Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu
mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng. Ngoài ra, PCR còn có thể
phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh, ví dụ phát hiện M. tuberculosis kháng
rifampicin, một chìa khóa chủ yếu để bác sĩ điều trị có thể sử dụng phát đồ điều trị
đúng cho bệnh nhân ( www.ykhoa.net).
2.11.6. PCR với tiến hóa và khảo cổ học
Từ năm 1963, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu nghiên cứu về tiến hóa dựa trên cấu
trúc phân tử của protein (cytochrome c, hemoglobin, ribonuclease). Sau đó, bắt đầu
nghiên cứu tập trung vào trình tự chuỗi 16S RNA của ribosome trên vi khuẩn hay bộ
gene của ty thể và lục lạp của thực vật. Ngày nay, PCR đã góp phần làm công việc
nghiên cứu về tiến hóa phân tử học trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Người ta có
thể so sánh các loài với nhau bằng cách dùng các mồi đặc hiệu cho những vùng có tí nh
ổn định cao trong bộ gen, nhờ đó khuếch đại các vùng biến đổi, rồi so sánh với nhau.
Ưu điểm vượt trội nhất của PCR trong lĩnh vực này là chỉ cần một số lượng rất nhỏ
mẫu vật là đủ để có thể tiến hành phân tích.
Trong lĩnh vực khảo cổ học, nhờ DNA là một loại phân tử khá bền vững, có
những mảnh DNA có thể tồn tại nguyên vẹn trong thời gian khá dài. Có rất nhiều
trường hợp những mảnh DNA cổ đại đã được PCR khuếch đại thành công: người ta có
thể khuếch đại DNA ty thể từ một người Châu Mỹ sống cách đây 700 0 năm hay từ các
mảnh xương của cọp răng chồn sống cách đây 14.000 năm ( www.ykhoa.net).
2.11.7. PCR với phát hiện các khiếm khuyết gene
Khiếm khuyết gene gây các bệnh di truyền hay ung thư là do bị đột biến đoạn hay
đột biến điểm. Phát hiện các đột biến bằng phương pháp PCR, khi đoạn DNA đặc hiệu
đuợc khuếch đại lên có kích thước khác bình thường (do thêm hay mất đoạn). Với các
trường hợp đột biến điểm, PCR hiện nay đã chiếm độc quyền trong lãnh vực này vì
khả năng thực hiện các thí nghiệm tương đối đơn giản và ít tốn thời gian so với các thử
- 20
nghiệm sinh học phân tử không dùng PCR. Dùng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để
khuếch đại các đoạn DNA có chứa đột biến điểm rồi phân tích bằng các kỹ thuật sinh
học phân tử khác; hay dùng cặp primer chỉ khuếch đại đuợc đoạn DNA có đột biến
điểm mà không khuếch đại đoạn gene bình thường ( www.ykhoa.net).
2.11.8. PCR và việc định loại các mô
Các mô được định loại (type) khác nhau dựa vào sự khác nhau về các kháng
nguyên của phức hợp phù hợp tổ chức chính (MHC), ở người gọi là kháng nguyên
HLA. Ðịnh type các mô là một việc hết sức cần thiết trong ngân hàng dữ liệu mô ghép
và trước khi thực hiện phẫu thuật ghép mô hay cơ quan. Hiện nay, định type các mô
được dựa vào các phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, PCR cũng là một triển vọng
đầy hứa hẹn trong lĩnh vực này, vì định type các mô dựa vào PCR cho được nhiều
thông tin hơn là các phương pháp miễn dịch học ( www.ykhoa.net).
2.11.9. PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền
Dấu ấn di truyền được nói ở đây là những dấu ấn giúp phân biệt c ác cá thể trong
cùng loài, xem có liên hệ với nhau hay không. Các dấu ấn này hoàn toàn không có ý
nghĩa gì trong việc biểu hiện kiểu hình thông qua tổng hợp protein.
Trước đây, để phát hiện các dấu ấn di truyền phải ly trích được bộ gene từ một
khối lượng khá nhiều tế bào của cá thể cần khảo sát (mô, máu,..) sau đó cắt đoạn bộ
gene này bằng các restriction enzyme, điện di trên thạch, làm Southern blotting, rồi
dùng các đoạn dò đặc hiệu được đánh dấu để phát hiện. Kết quả là mỗi cá thể sẽ có
một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dò khi lai ghép
trên Southern blotting. Người ta gọi kỹ thuật này là kỹ thuật phân tích sự đa hình về
chiều dài của các mảnh DNA bị cắt đoạn, RFLP (Restriction Fragment Lengh
Polymorphism).
Với PCR, công việc trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Có hai kiểu PCR phát hiện
dấu ấn di truyền hiện đang được dùng. Kiểu thứ nhất là dùng PCR với các đoạn mồi
nằm trước và sau các microsatellite, là các cấu trúc CACACA lặp đi lặp lại khoảng
100000 lần trong bộ gene của động vật có vú và khuếch đại các microsatellite này. Vì
các cá thể khác nhau có sự khác nhau về số lượng các cấu trúc CA tạo thành các
- 21
microsatellite nên sau khi khuếch đại bằng PCR và phân tích các vạch trên thạch điện
di, sẽ thấy các kiểu mẫu vạch khác nhau tùy từng cá thể được phân tích. Kiểu thứ hai
gọi là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các DNA đa hình (Random Amplified
polymorphic DNA - RAPD) là dùng các đoạn mồi ngẫu nhiên, thường ngắn khoảng 10
nucleotide, cho bắt cặp với nucleic acid đích trong điều kiện bắt cặp không chặt chẽ, ở
nhiệt độ khoảng 30 – 40oC chẳng hạn. Nhờ vậy khi thực hiện PCR, sẽ có sản phẩm
PCR là những đoạn DNA dài ngắn khác nhau do các đoạn mồi bắt cặp ngẫu nhiên trên
DNA đích (ngẫu nhiên nhưng là tất nhiên, vì đoạn mồi sẽ bắt cặp trên chuỗi đích nào
tương đối bổ sung nhất với nó) và các kích thước của những đoạn này sẽ được phát
hiện trên thạch điện di. Sự giống và khác nhau về hình ảnh trên thạch điện di sẽ cho
biết các cá thể đuợc phân tích có giống hay khác nhau, hay có liên hệ v ới nhau như thế
nào.
Kỹ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa
học hình sự. Chỉ cần tội phạm để lại trên hiện trường rất ít mẫu vật: một vài giọt máu
khô, vết tinh dịch, vài sợi lông hay tóc, hay thậm chí mẫu tàn thuốc có dính lại vài tế
bào niêm mạc miệng, là có thể truy tìm được dấu ấn di truyền và phát hiện được ngay
đúng tội phạm mà không thể nào chối cãi được. (www.ykhoa.net)
2.11.10. PCR và kỹ thuật phát hiện trình tự chuỗi của một đoạn DNA (DNA
sequencing)
Trước đây, để làm DNA sequencing, người ta phải dùng kỹ thuật Maxam và
Gilbert, kỹ thuật này tương đối phức tạp.
Hiện nay làm DNA sequencing bằng kỹ thuật PCR đơn giản hơn nhiều, kỹ thuật
này được gọi là kỹ thuật Sanger. Được rất được nhiều phòng thí nghiệm sinh học phân
tử hiện nay sử dụng.
Giá trị sử dụng Phương pháp PCR có ý nghĩa lớn vì nhiều lí do :
Thời gian thực hiện cực nhanh : Chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại một trình tự
DNA được quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kĩ thuật tái tổ hợp DNA phải
mất cả tuần hoặc lâu hơn.
Đơn giản và ít tốn kém: Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các
thành phần tối thiểu được sử dụng đồng thời. Trong khi đó, phương pháp tạo dòng
- 22
điển hình cần các vật liệu đắt tiền như màng, nucleotide triphosphate mang dấu phóng
xạ và việc thực hiện cần thao tác khéo léo đặc biệt.
Độ tinh sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu
nucleotide thô. Ví dụ mẫu máu hay dấu vết trong phân tích pháp y. Điều này ngược
với kĩ thuật tái tổ hợp DNA, đoạn gen hoặc vector đều cần tương đối tinh khiết.
Nhờ ưu thế trên, PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời trong việc
khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu và chẩn đoán phân tử.
Giới hạn duy nhất đối với phương pháp này là phải biết trình tự nucleotide (hoặc ít
nhất một phần) của đoạn DNA cần khuếch đại. Nó không thay thế kĩ thuật tái tổ hợp
DNA mà góp phần đáng kể bổ sung kĩ thuật này.
Như vậy, từ khi ra đời đến nay, PCR đã có vai trò cách mạng hóa trong nghiên
cứu cấu trúc và chức năng gene. Nó được hoàn thiện không ngừng và có nhiều ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như xác định trình tự nucleotide của
gene, gây đột biến điểm định hướng,…Có thể thực hiện PCR in situ (ngay trong tế
bào) với cả DNA, RNA.
Nó được sử dụng trong pháp y để phân tích di truyền vệt máu khô, chẩn đoán các
bệnh di truyền và lây nhiễm, dự báo các sai hỏng di truyền. PCR có thể dùng để
nghiên cứu DNA cổ xưa từ mẫu khảo cổ.
PCR kết hợp với các kĩ thuật khác của tạo dòng phân tử giúp sinh học xâm nhập
vào nhiều lĩnh vực mà trước đây khó với tới (www.ykhoa.net).
2.12. Thành phần hóa học của DNA
Deoxyribonucleic acid là một hợp chất polymer cấu tạo bởi các đơn phân
nucleotide. Nó được tạo nên do sự nối liền nhiều đơn phân cùng kiểu là các nucleotide.
Kết quả phân tích hóa học DNA của những sinh vật khác nhau cho thấy sự giống nhau
đặc biệt giữa các đơn chất hợp thành DNA. Thành phần hóa học của DNA gồm có gốc
acid phosphoric, đường 5-desoxyribose và các base nitrogenous. base nitrogenuos ở
DNA gồm có hai purine là adenine (A) và guanine (G) và hai pyrimidine là cytosine
(C) và thymine (T); ở RNA còn có uracil (U) thay cho thymine (T). Đường pentose
(5C) desoxyribose gắn với nitrogenous base ở vị trí C1 sẽ tạo nên nucleoside.
Nucleoside được gắn thêm nhóm phosphate vào C5 của đường pentose thành
- 23
nucleotide. Tính đặc hiệu của nucleotide do base, nên khi nói đến acid nucleic, base
thường được sử dụng thay cho nucleotide. Cách gọi thường dùng là cặp base, kí hiệu
bp hay kb (Phạm Thành Hổ, 2000, trang 140 - 141).
Hình 2.11 Cấu tạo hóa học của acid nucleic
- 24
Phần 3. Vật liệu và cách thức tiến hành
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
Quá trình chế tạo bắt đầu từ 3 / 2005 đến 8 / 2005.
Tiến hành chế tạo tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM.
Quá trình chế tạo tại Bộ môn Điều Khiển Tự Động trực thuộc khoa Cơ Khí.
Chạy mẫu kiểm tra và so sánh kết quả tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Linh kiện cho bộ khuếch đại tín hiệu từ cảm biến
Nhiệt điện trở Platine Pt100 (sản xuất tại Đức)
Sensor cảm ứng nhiệt Lm35 (sản xuất tại Đài Loan)
Tụ 1000 µF , 100 µF ,10 µF, 1 µF, 104 pF (sản xuất tại Đài Loan)
Điện trở sai số 1% không thay đổi theo nhiệt độ (sản xuất tại Singapore)
Biến trở vi chỉnh (sản xuất tại Đài Loan)
Điốt cầu 3A (sản xuất tại Trung Quốc)
Op07 (sản xuất tại Đài Loan)
Ổn áp 7805, 7905 (sản xuất tại Đài Loan)
3.2.2. Linh kiện cho mạch vi xử lý
Tụ 1000 µF,100 µF (sản xuất tại Đài Loan)
Tụ 33 pF,1000 µF, 100 µF (sản xuất tại Đài Loan)
Điốt cầu 3A
Vi xử lý AT90S8535 (sản xuất tại Đài Loan)
Thạch anh 4M
LM358 (sản xuất tại Đài Loan)
LCD 20 x 4 (Sản xuất tại Trung Quốc)
Ổn áp 7805
Phím 4x4
Optodiac P521 (sản xuất tại Đài Loan)
- 25
3.2.3. Linh kiện cho mạch khuyếch đại công suất
Điôt 10A, N4007 (sản xuất tại Nga và Trung Quốc)
Tụ : 2200 µF, 10000 µF
IRF 2807 (sản xuất tại Đài Loan)
Điện trở 1 MΩ
3.2.4. Linh kiện và thiết bị cho bộ nguồn
Biến áp các nguồn ra 9V(3A), 9-0-9(3A), 24V(15A) (sản xuất tại Việt Nam)
Điôt cầu 50A (sản xuất tại Đài Loan)
Tụ 10000µF,4700 µF
Ổn áp 7805, 7809, 7812, 7818, 7824
Transitor C3998 (sản xuất tại Đài Loan)
3.2.5. Linh kiện cho bộ luân nhiệt và nắp chống ngưng
TE 7000/127/085BS (sản xuất tại Singapore)
Dây điện trở cung cấp nhiệt
Nhôm tản nhiệt 10 x 21 x 3 mm
Quạt 10 cm x10 cm, DC 12V, 0,6A (sản xuất tại Nhật)
Mỡ Silicon
Keo chịu nhiệt (sản xuất tại Mỹ)
Fip 5 mm
Cao su silicon
Dây dẫn chịu nhiệt (sản xuất tại Nhật)
Giấy cách điện dẫn nhiệt
3.2.6. Vật liệu làm khung và vỏ máy
Inox 5 dem
Sắt V 2
Giấy cách điện
Thép chống từ
Máy bào kim loại
- 26
Máy khoan kim loại
Máy hàn
Máy cắt
Que hàn 5 mm
Máy đánh bóng
3.2.7. Hoá chất chạy PCR và dụng cụ điện di
DNA khuôn mẫu
dNTP
Taq polymerase
Primer
Dung dịch đệm thích hợp và MgCl2
3.3. Cách thức tiến hành
3.3.1. Thiết kế
3.3.1.1. Thiết kế khung và vỏ máy
a. Bộ phận bên ngoài của máy
Nắp chống ngưng tụ hơi nước được bố trí bên trên tiện sử dụng, phía trên nắp
được thiết kế thêm nút điều khiển dễ sử dụng và chế tạo.
Nút điều khiển điều khiển vị trí chống ngưng tụ hơi nước có hai chế độ: điều
chỉnh theo ý muốn và điều chỉnh tự động nhờ lực đàn hồi của lò xo.
Khóa cố định giữ nắp chống ngưng áp sát vào ống eppendorff trong suốt quá trình
chạy mẫu. Khoá được thiết kế đơn giản và dễ chế tạo.
Bàn phím nhập số liệu và LCD thiết kế nghiêng góc 480 so với đáy, thuận tiện cho
thao tác và quan sát hiển thị trên LCD.
b. Bộ phận bên trong
Gồm biến áp, bộ khuếch đại, nhôm tản nhiệt, mạch vi xử lý, bộ chỉnh lưu điện
xoay chiều thành điện một chiều. Biến áp và bộ khuếch đại được bố trí xa với mạch
điều khiển nhằm hạn chế nhiễu.
- 27
Hình 3.1 Vỏ máy
nguon tai.lieu . vn