- Trang Chủ
- Khoa học tự nhiên
- Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài lá kim: Pinus dalatensis, pinus kesiya và podocarpus neriifolius ở Việt Nam
Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN HOÀNG SA
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,
PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI – 2017
- VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………
NGUYỄN HOÀNG SA
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,
PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
Mã số: 62 44 01 14
Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trịnh Thị Thủy
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Thanh Tâm
Hà Nội – 2017
- LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học
của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm. Các kết quả
thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác. Toàn bộ trích dẫn trong luận án đều
chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận án
Nguyễn Hoàng Sa
- LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý
báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy
và TS. Nguyễn Thanh Tâm là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên,
Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm
luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công
nghệ, lãnh đạo Viện Hóa học, bộ phận đào tạo Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện
và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khánh Hòa, trưởng Khoa
cùng cán bộ của Khoa Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong thời gian làm luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TSKH. Trần Văn Sung đã có những định
hướng xây dựng nền móng ban đầu cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa
học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi
hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !
Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2017
Tác giả luận án
Nguyễn Hoàng Sa
- MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... iv
DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG....................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................. viii
PHỤ LỤC ............................................................................................................................ ix
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................................. 3
1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu .......................................................................... 3
1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis)........................................................................ 3
1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya) ............................................................................... 3
1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius) .................................................. 4
1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus ............................... 5
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus ............................................. 5
1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus ................................................................ 6
1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus ............................................................. 14
1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus ................................................................... 17
1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus ...................................................................... 19
1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Thông ba lá ................................. 20
1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi
Pinus.. .............................................................................................................................. 20
1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau ................................................................ 21
1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư ............................................... 22
1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm ............................................................ 24
1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................................. 26
1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác ............................................. 27
1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi
Podocarpus. .................................................................................................................... 28
1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus
neriifolius).... ................................................................................................................... 39
Chương 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................................ 42
i
- 2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học ........................................................... 42
2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu........................................................................... 42
2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật ........ 42
2.4. Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................................. 43
2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học.......................................................... 43
2.6. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 46
2.7. Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu .................. 47
2.8. Phân lập chất từ các chiết xuất .............................................................................. 48
2.8.1. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt ................. 48
2.8.2. Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt ...................... 49
2.8.3. Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt ....................... 49
2.8.4. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt .................. 50
2.8.5. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá ................... 51
2.8.6. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài ............ 52
2.9. Dữ kiện phổ của các chất tách được ..................................................................... 60
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 70
3.1. Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis) ................................. 70
3.1.1. Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol ................................................................... 70
3.1.2. Hỗn hợp TT2 ................................................................................................. 71
3.1.3. Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid ........................................................ 73
3.1.4. Chất TT4: Lambertianic acid ........................................................................ 75
3.1.5. Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid ................. 77
3.1.6. Chất TT6: Isopimaric acid ............................................................................. 78
3.1.7. Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one ................................................ 79
3.1.8. Chất TF1: Pinocembrin.................................................................................. 81
3.1.9. Chất TF2: Chrysin ......................................................................................... 82
3.1.10. Chất TF3: Pinostrobin.................................................................................... 83
3.1.11. Chất TF4: (+) Catechin .................................................................................. 84
3.1.12. Chất TF5: Kaempferol ................................................................................... 85
ii
- 3.1.13. Chất TF7: Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyrano-
side........ ....................................................................................................................... 86
3.1.14. Chất TP1: Dihydropinosylvin ........................................................................ 89
3.1.15. Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether ............................................... 89
3.1.16. Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene ..................................................... 90
3.1.17. Hỗn hợp TP5 .................................................................................................. 90
3.1.18. Chất TP6: Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside) ....................................... 92
3.1.19. Chất TL1: (+) Lariciresinol ........................................................................... 94
3.1.20. Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside ............................................ 95
3.1.21. Chất TS1: β-Sitosterol.................................................................................... 97
3.1.22. Chất TS2: Daucosterol ................................................................................... 98
3.2. Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya) ......................................... 99
3.2.1. Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid ...................................... 99
3.2.2. Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside ........................ 101
3.2.3. Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside. ................................................. 102
3.2.4. Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -β-
D-glucopyranoside ..................................................................................................... 103
3.2.5. Chất TL2: Cedrusin ..................................................................................... 105
3.3. Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius)................ 105
3.3.1. Chất TT7: Totarol ........................................................................................ 105
3.3.2. Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid ......................................................... 106
3.3.3. Chất TT9: Inumakiol D ............................................................................... 107
3.3.4. Chất TT10: Macrophyllic acid..................................................................... 108
3.4. Hoạt tính sinh học của một số chất sạch ............................................................. 111
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 116
DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...................................................... 119
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 120
iii
- DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Các phương pháp sắc ký
CC Column Chromatography Sắc ký cột thường
GFC Gel filtration chromatography Sắc ký lọc Gel
TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng
Các phương pháp phổ
1
H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
1
Spectroscopy H
13
C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Spectroscopy carbon 13
COSY Phổ tương tác hai chiều 1H-
Correlation Spectroscopy 1
H
DEPT Distortionless Enhancement by Polarisa-
Phổ DEPT
tion Transfer
ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spec- Phổ khối ion hóa phun mù
trometry điện tử
HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ioniza- Phổ khối phân giải cao ion
tion - Mass Spectrometry hóa phun mù điện tử
HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân
Heteronuclear Multiple Bond Correlation
qua nhiều liên kết
s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet
m: multiplet brs: broad singlet brd: broad doublet
dd: doublet of doublets ddd: doublet of doublet of doublets
td: triplet of doublets dt: doublet of triplets
HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân
Coherence qua một liên kết
IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY
Các dòng tế bào
Ung thư biểu mô họng ở
9-KB Human epidermoid carcinoma
người
26-L5 Murine colon carcinoma Ung thư ruột kết ở chuột
A-431 Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người
A-549 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người
iv
- Bel-7402 Human hepatoma Ung thư gan ở người
Ung thư tuyến tiền liệt ở
DU-145 Human prostate adenocarcinoma
người
HeLa HeLa cell line Tế bào ung thư Hela
Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người
Ung thư máu cấp tính ở
HL-60 Human promyelocytic leukemia
người
bào ung thư biểu mô liên kết
HT-1080 Human fibrosarcoma
di căn ở người
KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người
Ung thư biểu mô liên kết sợi
L-929 Mouse fibroblast
ở chuột
Ung thư tuyến tiền liệt ở
LNCaP Human prostate adenocarcinoma
người
LU Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người
MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú ở người
Ung thư biểu mô phổi ở
NCI-H292 Human lung mucoepidermoid
người
Tế bào ung thư bạch cầu
OCI-AML Acute Myeloid Leukemia cells
myeloid cấp tính
Ung thư máu lympho
P-388 Lymphocytic leukemia
(Ung thư bạch cầu)
Ung thư tuyến tiền liệt ở
PC-3 Human prostate adenocarcinoma
người
SK-LU-1 Human Caucasian Lung adenocarcinoma Ung thư phổi ở người
U nguyên bào thần kinh ở
SK-N-SH Human neuroblastoma cell line
người
SMMC- Ung thư biểu mô tế bào gan
Human hepatocarcinoma
7721 ở người
T-47D Human ductal breast epithelial tumor Ung thư vú ở người
U-397 Human leukemic monocyte lymphoma Ung thư máu ở người
Các viết tắt khác
COX-2 Cyclooxygenase-2 Enzym cyclooxygenase-2
CTPT Công thức phân tử
EBV Epstein-Barr Virus Virus Epstein-Barr
Liều tác dụng tối đa trên 50%
ED50 Effective Dose
đối tượng thử
v
- Virus gây suy giảm miễn
FIV Feline immunodeficiency virus
dịch ở động vật họ mèo
HSV Herpes simplex virus Virus Herpes simplex
Virus gây suy giảm miễn
HIV Human immunodeficiency virus
dịch ở người
Nồng độ ức chế 50% đối
IC50 Inhibitory Concentration 50%
tượng thử
LD50 Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% thú thử
MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
Chủng virus gây ung thư vú
MMTV Mouse mammary tumour virus
ở chuột
OD Optical Density Mật độ quang
Những phần tử hoạt động
ROS Reactive oxygen species
chứa Oxygen
mp Melting point Điểm nóng chảy
n-BuOH n-Butanol Ac Acetoxyl
CDCl3 Chloroform deuteri (d) Bz Benzoyl
DCM Dichloromethane OMe Methoxy
DMSO Dimethylsulfoxide Ph Phenyl
EtOAc Ethyl acetate Et Ethyl
EtOH Ethanol Me Methyl
MeOH Methanol Glc Glucose
CD3OD Methanol deuteri (d4)
TMS Tetramethylsilane Xyl Xylose
Retardation factor
C Carbon bậc 4 Rf
(retention factor)
dm Dung môi
vi
- DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG
Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus ......... 8
Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus ....................... 9
Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus... 14
Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus ................ 16
Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus ..................... 18
Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus .................. 19
Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus ............................ 33
Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus
neriifolius) .......................................................................................................................... 40
Bảng 3.1. Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol ................................................... 70
Bảng 3.2. Số liệu gán phổ 1HNMR và 13CNMR của TT2a và TT2b .................................. 72
Bảng 3.3. Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid ......................................... 74
Bảng 3.4. Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid ......................................................... 76
Bảng 3.5. Số liệu phổ của chất TT5 và 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid
............................................................................................................................................ 78
Bảng 3.6. Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430............................................................ 81
Bảng 3.7. Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside
............................................................................................................................................ 87
Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-D-
glucopyranoside.................................................................................................................. 93
Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432 ............................................. 97
Bảng 3.10. Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O ................................... 100
Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-
rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside ......................................................................... 104
Bảng 3.12. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của TT7, TT8 và TT9 ..................................... 108
Bảng 3.13. Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8) ..................... 111
Bảng 3.14. Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2 của một
số chất sạch ...................................................................................................................... 112
vii
- DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3).. .... 3
Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá ............................... 4
Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài ............................... 4
Hình 2.1. Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất......................... 47
Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 54
Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 55
Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 56
Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông
đà lạt ........................................................................................................................ 57
Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông
ba lá ......................................................................................................................... 58
Hình 2.7. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông
tre lá dài ................................................................................................................... 59
Hình 3.1. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b ................................ 73
Hình 3.2. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4 ................................................. 76
Hình 3.3. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6 ............................... 79
Hình 3.4. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6 ................................................. 94
Hình 3.5. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1 ............................... 95
Hình 3.6. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11 ............................................. 100
Hình 3.7. TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10. ............ 109
Hình 3.8. Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6,
TT10, TF1, TP2 và TL1 ........................................................................................ 113
Hình 3.9. Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24
giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1. ............................... 114
Hình 3.10. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi
được xử lí. (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác
nhau ....................................................................................................................... 115
viii
- PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Các phổ của hợp chất TT1 PL1
Phụ lục 2 Các phổ của hỗn hợp TT2 PL5
Phụ lục 3 Các phổ của hợp chất TT3 PL13
Phụ lục 4 Các phổ của hợp chất TT4 PL17
Phụ lục 5 Các phổ của hợp chất TT5 PL24
Phụ lục 6 Các phổ của hợp chất TT6 PL28
Phụ lục 7 Các phổ của hợp chất TT12 PL38
Phụ lục 8 Các phổ của hợp chất TF1 PL41
Phụ lục 9 Các phổ của hợp chất TF2 PL45
Phụ lục 10 Các phổ của hợp chất TF3 PL48
Phụ lục 11 Các phổ của hợp chất TF4 PL51
Phụ lục 12 Các phổ của hợp chất TF5 PL53
Phụ lục 13 Các phổ của hợp chất TF7 PL56
Phụ lục 14 Các phổ của hợp chất TP1 PL60
Phụ lục 15 Các phổ của hợp chất TP2 PL64
Phụ lục 16 Các phổ của hợp chất TP3 PL67
Phụ lục 17 Các phổ của hỗn hợp TP5 PL69
Phụ lục 18 Các phổ của hợp chất TP6 PL74
Phụ lục 19 Các phổ của hợp chất TL1 PL80
Phụ lục 20 Các phổ của hợp chất TL3 PL89
Phụ lục 21 Các phổ của hợp chất TS1 PL94
Phụ lục 22 Các phổ của hợp chất TS2 PL97
Phụ lục 23 Các phổ của hợp chất TT11 PL101
Phụ lục 24 Các phổ của hợp chất TF6 PL108
Phụ lục 25 Các phổ của hợp chất TP4 PL113
Phụ lục 26 Các phổ của hợp chất TP7 PL117
Phụ lục 27 Các phổ của hợp chất TL2 PL122
Phụ lục 28 Các phổ của hợp chất TT7 PL126
Phụ lục 29 Các phổ của hợp chất TT8 PL130
Phụ lục 30 Các phổ của hợp chất TT9 PL135
Phụ lục 31 Các phổ của hợp chất TT10 PL147
Các biểu đồ biểu thị kết quả thử hoạt tính chống tăng
Phụ lục 32 PL155
sinh trên dòng tế bào OCI-AML của TF3
Phụ lục 33 Kết quả phân tích protein bằng Western plot của hỗn PL155
hợp TT2 với các tế bào OCI-AML
ix
- MỞ ĐẦU
Ngày nay, đi đôi với sự phát triển nhanh chóng về mọi mặt của xã hội loài người là
nhiều vấn đề nghiêm trọng mà cả thế giới đang phải đối mặt. Trong tám mục tiêu thiên niên
kỷ mà nhân loại cố gắng đạt được trong thế kỷ 21 (gọi tắt là MDGs từ tiếng Anh:
Millennium Development Goals), thì vấn đề có liên quan tới sức khỏe của con người là một
trong số mục tiêu được đặt lên hàng đầu. Rõ ràng, biến đổi khí hậu đang diễn ra trên phạm
vi toàn cầu cùng với sự ô nhiễm ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng và vấn đề thực
phẩm bẩn đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng tiêu cực đến sức khỏe của con người
nói riêng và sự sống của toàn thể sinh vật trên trái đất nói chung. Cụ thể là, gần đây nhân
loại luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại
dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các loại ung
thư, các loại bệnh viêm nhiễm, các loại cúm virus, bệnh do virus Ebola, các biến chứng do
nhiễm virus Zika, tim mạch, đái tháo đường, vv... Việc tìm ra phương pháp hiệu quả để
điều trị các bệnh này là vấn đề vô cùng khó khăn, nó đặt ra nhiều thách thức lớn cho các
nhà khoa học. Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra
các chất có hoạt tính tiềm năng có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật
nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Và như thế, người ta có thể sử dụng các
hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng
làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới.
Việt Nam là nước có khí hậu và địa hình rất đa dạng, gồm có bốn miền khí hậu chủ
yếu: khí hậu phía Bắc, phía Nam, Trung và nam Trung bộ, khí hậu Biển Đông. Việt nam
với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi. Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên
và khí hậu như trên đã tạo ra thảm thực vật có đa dạng sinh học cao. Theo những nghiên
cứu mới đây ở Việt Nam có hơn 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600
loài nấm, hơn 2000 loài tảo, 537 loài vi tảo, 667 loài rong biển và 15 loài cỏ biển, trong đó
nhiều loài được dùng làm thuốc [1].
Trong thảm thực vật phong phú và đa dạng ấy, các loài cây lá kim là những cây rừng
quan trọng cả về sinh thái, kinh tế, thương mại và văn hóa. Ngoài nguồn cung cấp gỗ, tinh
dầu thông còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, công
1
- nghiệp chất béo, vv...), một số loài Thông còn được dùng là vị thuốc dân tộc. Thông còn là
môi trường của nhiều loài nấm nội kí sinh, Taxol® (paclitaxel) là thuốc chống ung thư được
cho là tốt nhất hiện nay được phát hiện từ loài thông đỏ ở châu Âu.
Cũng như các chi khác trong bộ Thông (Pinales), nhiều loài trong chi Pinus L.
(Pinaceae) và chi Podocarpus L'Hér. ex Pers. (Podocarpaceae) từ lâu đã gắn bó với đời
sống hằng ngày của người dân và cũng được sử dụng trong y học cổ truyền để trị nhiều loại
bệnh khác nhau. Trong khi đó, tính tới thời điểm này (2017) tuy đã có nhiều công trình
nghiên cứu nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của trên một trăm loài
Pinus và khoảng tám mươi loài Podocarpus nhưng vẫn còn có nhiều loài trong hai chi này
hầu như chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu. Trong đó, loài
Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) là một loài gần như đặc hữu của Việt Nam và chưa
được nghiên cứu về mặt hóa học; Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) và loài
Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên
cứu nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài này là rất
cần thiết, nhằm góp phần tạo cơ sở để hướng đến nghiên cứu khai thác và sử dụng sau này.
Chính vì lý do trên, mục tiêu của các nghiên cứu trong luận án này là:
1. Nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài lá kim: Thông đà lạt (P. dalatensis),
Thông ba lá (P. kesiya) và Thông tre lá dài (P. neriifolius)
2. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch tách ra từ các loài trên để
tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng vào cuộc sống.
2
- Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu
1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré)
Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré), tên đồng nghĩa: Pinus wallichiana A.B. Jacks.
[2] thuộc họ Thông (Pinaceae). Đây là một loài thông năm lá gần đặc hữu của Việt Nam,
cây phân bố chủ yếu ở Đà Lạt và một số vùng lân cận, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở
Quảng Nam, Quảng Bình và biên giới Việt-Lào. Cây mọc trong rừng rậm, trên núi trung
bình, ở độ cao 1500-2000 m. Cây gỗ to, cao đến hơn 30 m và đường kính thân 0.6-0.8 m
[2]. Gỗ không bị mối mọt, được sử dụng trong xây dựng, làm đồ gỗ gia dụng và mỹ nghệ.
Đến nay, chưa có công bố nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thành phầ n hóa ho ̣c
và hoa ̣t tính sinh học của loài này.
Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3)
(Tiêu bản số VNMN.B000005006 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)
1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon)
Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon; tên đồng nghĩa: Pinus langbianensis A.
Chev., Pinus insularis var. khasyana (Griff.) Silba, Pinus yunnanensis Franch.) là một loài
lá kim thuộc họ Thông (Pinaceae). Trên thế giới, cây phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Thái
Lan, Lào, Việt Nam và Philippines. Ở Việt Nam, thông ba lá lần đầu được phát hiện ở cao
nguyên Langbiang, đó là loài có diện tích lớn nhất trong số các loài thông ở Việt Nam, phân
bố ở Hà Giang, Sơn La, Gia Lai, Kon Tum,... nhưng nhiều nhất (90% diện tích) là trên cao
3
- nguyên Langbiang. Lá cây hình kim, thường đính ba lá kim trên một đầu cành ngắn, thường
có màu xanh ngọc, mỗi lá kim thường dài 20-25 cm. Đầu cành ngắn đính lá thường có độ
dài 1.5 cm, đính cách vòng xoắn ốc trên cành lớn [3]. Cây thường được trồng để lấy gỗ
phục vụ cho công nghiệp giấy, ngành xây dựng và mỹ nghệ. Đến nay, chỉ mới có vài công
bố về thành phần hóa học và hoạt tính của tinh dầu từ loài này. Gần đây (năm 2013 và
2014), có một vài công bố nghiên cứu bước đầu về thành phầ n hóa ho ̣c của loài này ở Trung
Quốc [4, 5].
Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá
(Tiêu bản số VNMN.B000005007 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)
1.1.3. Thông tre lá dài dài (Podocarpus neriifolius D. Don)
Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài
(Tiêu bản số VNMN.B0000050013 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)
Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) là một loài thực vật họ Thông tre
4
- (Podocarpaceae). Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng nguyên sinh các tỉnh Kon Tum,
Gia Lai, ĐakLak, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang,
Nghệ An, Hà Tĩnh, Yên Bái, Tuyên Quang... và mọc ở độ cao 2300 m ở Vườn quốc gia Bì
Đúp - Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng. Cây gỗ cao 20–25 m, đường kính có thể tới 50 cm,
thân thẳng, tròn. Vỏ xám nâu, mỏng, nhẵn. Cành lá mọc vòng, màu xanh non hoặc xanh
vàng. Lá mọc cách, hình mác dài, đầu nhọn dần, dài 7–15 cm, rộng 0.9–1.9 cm, đầu và đuôi
nhọn, đầu mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh vàng. Gân chính nổi ở giữa rõ cả 2 mặt, mép
lá cong xuống phía dưới. Cuống lá dài 0.3–0.5 cm, phía dưới có rãnh. Nón đực dạng bông
không cuống, thường 3 bông mọc chụm ở nách lá gần đầu cành, khi non hình trứng, khi già
hình trụ dài 2–5 cm. Nón cái mọc lẻ ở nách lá, chỉ có một lá noãn phát triển mang một noãn,
các lá noãn khác hợp thành đế. Nón hình trứng dài 1.2–1.6 cm, đường kính 0.8–12 cm, đế
mập to gần bằng nón, có cuống dài 0.5-1 cm. Có 2 lá bắc sớm rụng, dài 1,5 cm, rộng 1 cm.
Hạt hình trứng, dài 1,2–1.6 cm, rộng 1.1 cm, dưới có đế mập, đường kính gần bằng đường
kính hạt, quả màu tím [6].
1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus
Về thành phần hóa học thì hầu hết các loài lá kim đều có chứa tinh dầu. Bên cạnh
đó, theo thống kê trên thế giới đến nay đã có trên 450 hợp chất được phân lập từ trên một
trăm loài thuộc chi Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpenoid,
phổ biến nhất là diterpene có khung carbon rất đa dạng như: cembrane pimarane, labdane
và abietane; triterpene khung seratane và lanostane, lignan, steroid, các phenol, flavonoid
và flavonoid glycoside [7].
1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus
Hầu hết các loài trong chi Pinus đều có tinh dầu, có rất nhiều nghiên cứu trong vòng
40 năm trở lại đây chỉ ra rằng thành phần chính của có trong dầu thông của nhiều loài thuộc
chi Pinus có chứa chủ yếu là các hợp chất terpenoid như: sesquiterpenoid và monoterpe-
noid; trong đó thường hay gặp với hàm lượng cao là các chất α-pinene (1) và β-pinene (2),
camphene (3), α-myrcene (4), β-myrcene (5) α-terpineol (6), limonene (7) và α-terpinene
(8) [8, 9, 10, 11, 12]; các sesquiterpenoid thường thấy nhất là longifolene (9), caryo-
phyllene (10) và germacrene D (11) [10, 11]. Ngoài ra, theo một nghiên cứu gần đây vào
5
- 2014 về thành phần tinh dầu của loài P. nigra, người ta đã nhận thấy sự có mặt lượng lớn
các nhóm chất oxygen–diterpene và sesquiterpene [13]. Trong một công bố vào năm 2015
của Zhouqi Li và các cộng sự, ngoài α-pinene (1) còn tìm thấy thêm hàm lượng β-
caryophellen (12) tương đối cao trong tinh dầu ở sáu loài thuộc chi Pinus bản địa ở Trung
Quốc [14].
1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus
Các triterpenoid được tìm thấy trong chi Pinus chủ yếu có khung seratane và
lanostane. Trong một công bố vào năm 1991, từ vỏ loài thông trắng Trung Quốc P.
armandii các nhà khoa học đã tách ra được các chất (13-22) có khung seratane [15]. Từ các
loài thông trắng miền Tây ở Bắc Mỹ là P. monticola, và loài thông Luchu P. luchuensis đã
tách được tám triterpenoid khung seratane (23-30) trong các công bố vào năm 1984, 1975
và 2001 [16, 17, 18]. Ngoài ra, các seratane triterpenoid kể trên cũng được tìm thấy từ các
loài P. massoniana, P. taiwanensis, P. monticola và P. strobus [12]. Các lanostane
triterpenoid được tìm thấy chủ yếu từ loài P. monticola và P. luchuensis. Cụ thể là, năm
1981, mười chất (31-40) đã được phân lập từ loài P. monticola [19]; năm 2000, có bốn
chất mới (41-44) được xác định từ loài P. luchuensis [20]; năm 2010, hợp chất mới
pinusyunnanol (45) được phân lập từ loài P. yunnanensis phân bố ở vùng Vân Nam, Trung
Quốc [21]. Ngoài ra trước đó, trong một công bố khác, các chất (24S)-3β-methoxy-5α-
lanost-9(11)-ene-24,25-diol (31), (32) và (5α,24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46),
(3α,5α,24S)-lanost-9(11)-ene-3,24,25-triol (47) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [18].
Có thể nói diterpenoid là nhóm chất chính có trong chi Pinus. Cho đến nay, các
diterpenoid chủ yếu được tách ra từ các loài thuộc chi này có thể chia thành ba nhóm với
đặc trưng cấu trúc chứa các bộ khung pimarane, abietane và labdane. Các chất 48-58 thuộc
nhóm có khung pimarane thường hay gặp ở loài P. massoniana và P. armandii. Cụ thể là
sandaracopimaric acid (49), 2β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-oic acid (53), pimaric
acid (54), pimara-8(14),15-dien-18-al (55), 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56) và
ent-8,13-epoxylabd-14-en-19-oic acid (57) được tách ra từ loài P. massoniana [12, 22, 23];
từ loài P. armandii đã tách được isopimaric acid (48), isodextropimaric acid (51) cùng với
49 và 54 [12, 24]. Các chất isopimarol (50) và pimarol (52) có trong loài P. kesiya còn
6
- manoyl oxide acid (58) đã được tìm thấy trong các loài P. sylvestris, P. nigra và P. pumila
[12].
Cho đến nay, trong các loài Pinus thì các chất thuộc nhóm abietane (59-118) được
tìm thấy với số lượng nhiều nhất so với các diterpenoid còn lại. Từ loài P. massoniana đã
tách được hai mươi ba chất abietane diterpenoid đó là levopimaric acid (60), palustric acid
(61), neoabietic acid (62), abietic acid (63), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic
acid (67), 7α- hydroxydehydroabietan-18-oic acid (68), 7β- hydroxydehydroabietan-18-
oic acid (69), abieta-6,8,11,13-tetraene-15,19-diol (70), 2β-hydroxydehydroabietic acid
(72), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 7β-hydroxydehydroabiet-15-enoic acid (76),
13β-ethoxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (90), podocarp-8(14)-ene-7,13-dion-18-oic
acid (92), 12α-hydroxydehyroabietic acid (98), abieta-7,13,15-trien-18-oic acid (99), 15-
hydroxy-12-oxoabietic acid (100), 12β-methoxyabietic acid (103), 13-hydroxypodocarpa-
8,11,13-trien-18-oic acid (113), 12-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (114), 7β-
hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (115), 7α-hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-
en-15-oic acid (116) và 13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (117) trong các công bố vào
năm 1993 và 2010 [12, 22, 23]. Trong các năm 2010 và 2011, từ loài P. yunnanensis các
nhà khoa học đã phân lập được dehydroabietane (64), 66, abieta-6,8,11,13-tetraene-15,18-
diol (71), 73, abiesadine N (75), 15-hydroxy-7-oxodehydroabietic acid (79), 15,18-
dihydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (80), 4,15-dihydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7-
one (81), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), 4-hydroxy-19-norabieta-8,11,13-
trien-7-one (83), abieta-8,11,13-triene-7a ,15,18-triol (84), methyl 7α ,15-
dihydroxydehydroabietate (85), 7α,15-dihydroxypodocarp-8(14)-en-13-one (86), 12α,13β-
dihydroxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (87), daturabietatriene (93), 18-norabieta-
8,11,13-triene-4,15-diol (94), abiesadine I (95), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-
8,11,13-trien-4-ol (97), 12α -methoxyabietic acid (102), pinyunin A (104), pinyunin B
(105), 113 và 117 [25, 26]. Ngoài ra, các hợp chất abietane diterpenoid cũng đã được tìm
thấy từ các loài P. koraiensis, P. pumila, P. densiflora, P. strobus, P. taeda, P. kesiya, P.
armandii, P. sylvestris, P. luchuensis, P. sibirica và P. banksiana trong các công bố khoa
học từ năm 1970-2010 [12].
7
nguon tai.lieu . vn