- Trang Chủ
- Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học
- Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới
Xem mẫu
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
Nguyễn Thị Thu Hường
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN Ở NGƯỜI BỆNH MẮC
BỆNH XIRÔ NIỆU, RỐI LOẠN CHU TRÌNH CHUYỂN
HÓA URÊ VÀ BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ Ở VIỆT NAM
BẰNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội, 2022
- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Nguyễn Thị Thu Hường
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI GEN Ở NGƯỜI BỆNH MẮC
BỆNH XIRÔ NIỆU, RỐI LOẠN CHU TRÌNH CHUYỂN
HÓA URÊ VÀ BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ Ở VIỆT NAM
BẰNG CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI
Nghiên cứu biến đổi gen ở các Người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rốNam bằng công nghệ giải
trình tự gen thế hệ mới
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Nguyễn Huy Hoàng
2. TS. Nguyễn Thị Kim Liên
Hà Nội, 2022
- i
LỜI CAM ĐOAN
Nghiên cứu sinh xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chính bản
thân dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Nguyễn Huy Hoàng và TS. Nguyễn Thị Kim
Liên. Những kết quả thu được trong luận án là mới, trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Thu Hường
- ii
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu sinh xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
GS.TS. Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện nghiên cứu hệ gen và TS. Nguyễn
Thị Kim Liên, Phó Trưởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen-
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, định hướng và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu sinh trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu cũng như thực hiện luận án.
Nghiên cứu sinh xin cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, ủng hộ và tham gia nhiệt tình
của các cán bộ thuộc Phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen;
TS.BS.Vũ Chí Dũng và các bác sỹ Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh
viện Nhi Trung ương trong suốt thời gian thực hiện luận án. Bằng những tình cảm
chân thành nhất, nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn những giúp đỡ quý báu đó.
Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo; Cán bộ Phòng Quản lý
tổng hợp, Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt,
hỗ trợ nghiên cứu sinh thực hiện các thủ tục cần thiết để hoàn thành chương trình
học tập và luận án.
Nhân dịp này, nghiên cứu sinh cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc,
tập thể cán bộ giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho nghiên cứu sinh trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài thuộc Chương trình phát triển
khoa học cơ bản trong lĩnh vực Hoá học, Khoa học sự sống, Khoa học trái đất và
Khoa học biển giai đoạn 2017 - 2025, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam và Chương trình sau tiến sỹ tạo nguồn lực khoa học công nghệ cho Học viện
Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm KHCNVN, nghiên cứu sinh xin chân thành
cảm ơn sự hỗ trợ quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN.
Nghiên cứu sinh xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban
Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức, tập thể cán bộ, giảng viên Khoa Nông Lâm
Ngư nghiệp và Phòng Quản lý đào tạo, Trường Đại học Hồng Đức đã ủng hộ, tạo
điều kiện cho nghiên cứu sinh trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận án.
Cuối cùng, nghiên cứu sinh bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình, bố,
mẹ, anh, chị, chồng, con, bạn bè đồng nghiệp đã luôn tin tưởng và là nguồn động
viên tinh thần lớn lao đối với nghiên cứu sinh trong suốt quá trình học tập, nghiên
cứu, hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Thu Hường
- iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. Bệnh xirô niệu (MSUD) ....................................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm .......................................................................................................... 3
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ............................................................................................... 3
1.1.3. Di truyền phân tử .............................................................................................. 4
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán .................................................................. 6
1.1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh xirô niệu trên thế giới và ở Việt Nam ................... 7
1.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê ............................................................. 11
1.2.1. Khái niệm ........................................................................................................ 11
1.2.2. Cơ chế bệnh sinh.............................................................................................. 11
1.2.3. Di truyền phân tử ............................................................................................ 13
1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê trên thế giới và
ở Việt Nam ................................................................................................................ 20
1.3. Bệnh loạn dưỡng cơ ........................................................................................... 26
1.3.1. Khái niệm ........................................................................................................ 26
1.3.2. Phân loại bệnh ................................................................................................. 26
1.3.3. Tình hình nghiên cứu bệnh loạn dưỡng cơ trên thế giới và ở Việt Nam ........ 34
1.4. Công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) ..................................................... 38
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 41
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 41
2.2. Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ người bệnh ...................................................... 42
2.2.1. Bệnh xirô niệu ................................................................................................. 42
2.2.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê .......................................................... 42
2.2.3. Bệnh loạn dưỡng cơ ........................................................................................ 43
- iv
2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 43
2.3.1. Thời gian nghiên cứu ...................................................................................... 43
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 43
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu .................................................................................. 43
2.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 44
2.6. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 44
2.6.1. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 45
2.6.2. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa bằng hệ thống Illumina ..................... 45
2.6.3. Sàng lọc các biến thể trên các gen chứa biến thể liên quan ............................ 48
2.6.4. Kiểm chứng biến thể có tiềm năng gây bệnh .................................................. 49
2.6.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 51
2.6.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của
Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 54
2.6.7. Cơ sở dữ liệu ................................................................................................... 56
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 58
3.1. Bệnh xirô niệu (MUSD) ..................................................................................... 58
3.1.1. Kết quả lâm sàng ............................................................................................. 58
3.1.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 59
3.1.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ............................................... 59
3.1.4. Kiểm chứng biến thể ....................................................................................... 65
3.1.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 68
3.1.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của
Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 73
3.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) ................................................. 75
3.2.1. Kết quả lâm sàng ............................................................................................. 75
3.2.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 76
3.2.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa................................................. 77
3.2.4. Kiểm chứng biến thể ........................................................................................ 81
3.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 84
3.2.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của
Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 86
3.3. Bệnh loạn dưỡng cơ (MD) ................................................................................. 88
- v
3.3.1. Kết quả lâm sàng ............................................................................................. 88
3.3.2. Tách chiết DNA tổng số .................................................................................. 89
3.3.3. Kết quả giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ............................................... 89
3.3.4. Kiểm chứng biến thể ....................................................................................... 93
3.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của các biến thể bằng một số công cụ tin sinh .............. 95
3.3.6. Phân loại khả năng gây bệnh của các biến thể có tiềm năng theo tiêu chí của
Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) .......................... 97
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN ..................................................................................... 99
4.1. Bệnh xirô niệu (MUSD) ..................................................................................... 99
4.2. Bệnh rối loạn chu trình chuyển hóa urê (UCD) ............................................... 109
4.3. Bệnh loạn dưỡng cơ ......................................................................................... 116
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 122
Kết luận ................................................................................................................... 122
Kiến nghị ................................................................................................................. 122
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................... 123
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................................ 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 125
PHỤ LỤC ....................................................................................................................P
- vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt dùng trong luận án
aa Amino acid
ACMG American Colleges of Medical Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di
Genetics and Genomics truyền Y học Hoa Kỳ
Di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể
AD Autosomal dominant
thường
Di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể
AR Autosomal recessive
thường
ASL Argininosuccinic acid lyase
ASS Argininosuccinic acid synthetase
BCAA Brand chain amino acid
Branched-chain ketoacid
BCKDH Ketoacid dehydrogenase mạch nhánh
dehydrogenase
Branched-chain α ketoacid
BCKDHA
dehydrogenase
Branched-chain β ketoacid
BCKDHB
dehydrogenase
BDK BCKD kinase
BDP BCKD phosphatase
CK Creatine kinase
CMD Congenital muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ bẩm sinh
CP Carbarmoyl phosphate
CPSI Carbamyl phosphate synthetase I
CSDL Cơ sở dữ liệu
Dihydrolipoamide
DBT
dehydrogenase
DD Distal muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ vùng ngọn chi
DLD Dihydrolipoamit transacylase
DM Myotonic dystrophy Loạn dưỡng tăng trương lực cơ
DNA Deoxyribonucleotide acid
DQ Developmental quotient Chỉ số phát triển
ExAC Exome aggregation consortium
F Family Gia đình
Facio -scapulo - humeral
FSHD Loạn dưỡng cơ mặt -vai- cánh tay
muscular dystrophy
GATK Genome analysis toolkit
HET Heterozygous Dị hợp tử
hg19 Human genome assembly 19
HMM Hidden Markov model Mô hình thống kê Markov ẩn
- vii
HOM Homozygous Đồng hợp tử
LAMA2 Laminine-2
LGMD Limb-girdle muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ vùng gốc chi
MAF Minor allele frequency Tần số allen
MAF Minor allele frequency Tần số allen hiếm
MD Muscular dystrophy Loạn dưỡng cơ
MK Marker Thang chuẩn
MRI Magnetic resonance imaging Hình ảnh cộng hưởng từ
MSUD Maple syrup urine disorder Bệnh xirô niệu
NAG N-acetylglutamate
NGS Next generation sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới
NST Nhiễm sắc thể
OTC Orinithinetranscarbamylase
PM Pathogenic moderate Gây bệnh mức trung bình
PolyPhen-2 Polymorphism phenotyping v2
PP Pathogenic supporting Gây bệnh mức hỗ trợ
PS Pathogenic strong Gây bệnh mạnh
PVS Pathogenic very strong Gây bệnh rất mạnh
Q Quality Chất lượng
RI Reliability index Chỉ số độ tin cậy
RNA Ribonucleic acid
SIFT Sorting intolerant from tolerant
SMG Serine-methionine-glycine
SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn
Single strand conformation
SSCP Đa hình sợi đơn
polymorphism
STR Short tandem repeat
STT Số thứ tự
TLTK Tài liệu tham khảo
UCD Urea cycle disorder Rối loạn chu trình chuyển hóa urê
WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa
- viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các gen liên quan đến bệnh xirô niệu…………………………………….4
Bảng 2.1. Thông tin về người bệnh và gia đình ........................................................41
Bảng 2.2. Điểm chất lượng .......................................................................................47
Bảng 2.3. Trình tự các đoạn mồi ...............................................................................50
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt khuếch đại từng vùng gen ...............................................51
Bảng 2.5. Quy tắc phân loại biến thể trên cơ sở kết hợp các tiêu chí .......................56
Bảng 3.1. Thông tin lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc xirô niệu ........58
Bảng 3.2. Thông tin đọc trình tự của người bệnh R01, R02, R03, R04 .....................61
Bảng 3.3. Kết quả phân tích và dự đoán biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa ở
người bệnh R01, R02, R03, R04 ...............................................................................62
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc biến thể có tiềm năng gây bệnh ở người bệnh R01, R02,
R03, R04....................................................................................................................63
Bảng 35. Phân tích tiềm năng gây bệnh của các biến thể ở người bệnh R01, R02,
R03, R04 bằng một số công cụ tin sinh ....................................................................70
Bảng 3.6. Phân loại các biến thể tiềm năng gây bệnh MUSD theo tiêu chí của Hiệp
hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) ...................................73
Bảng 3.7. Thông tin lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc rối loạn chu
trình chuyển hóa urê ..................................................................................................76
Bảng 3.8. Thông tin đọc trình tự của người bệnh R05, R06, R07 ..............................78
Bảng 3.9. Kết quả phân tích và dự đoán biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa của
người bệnh R05, R06, R07 ........................................................................................79
Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc biến thể tiềm năng gây bệnh ở người bệnh R05, R06,
R07 ............................................................................................................................80
Bảng 3.11. Kết quả phân tích biến thể IVS7+1G>A bằng phần mềm
MaxEntScan::score5ss ...............................................................................................85
Bảng 3.12. Phân tích ảnh hưởng của biến thể thay thế c.365A>T; p.E122V trên gen
OTC bằng một số công cụ tin sinh .............................................................................85
Bảng 3.13. Phân loại tiềm năng gây bệnh UCD của các biến thể theo tiêu chí của
Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) ..........................87
Bảng 3.14. Thông tin lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc loạn dưỡng cơ88
Bảng 3.15. Thông tin đọc trình tự của người bệnh R08, R09 và Bố, Mẹ ...................91
Bảng 3.16. Kết quả phân tích và dự đoán biến thể trong toàn bộ vùng gen mã hóa của
người bệnh R08, R09 và Bố, Mẹ ...............................................................................92
Bảng 3.17. Kết quả sàng lọc biến thể có tiềm năng gây bệnh loạn dưỡng cơ ..........93
Bảng 3.18. Phân tích ảnh hưởng của 02 biến thể c.778C>T (p.H260Y) và
c.2987G>A (p.C996Y) trên gen LAMA2 bằng một số công cụ tin sinh ...................95
Bảng 3.19. Phân loại các biến thể ở người bệnh loạn dưỡng cơ theo tiêu chuẩn của
Hiệp hội Bệnh học Phân tử và Di truyền Y học Hoa Kỳ (ACMG) ..........................98
Bảng 4.1. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 10 của gen BCKDHB..101
Bảng 4.2. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 9 của gen BCKDHB....104
Bảng 4.3. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 1 của gen BCKDHB....106
Bảng 4.4. Các biến thể thay thế đã được công bố tại exon 4 của gen OTC ............113
- ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh (BCAA) .........................4
Hình 1.2. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHA ...................................5
Hình 1.3. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHB ...................................5
Hình 1.4. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DBT ............................................5
Hình 1.5. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DLD............................................6
Hình 1.6. Chu trình Urê.............................................................................................12
Hình 1.7. Cấu trúc gen CPS1 ....................................................................................13
Hình 1.8. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen NAGS........................................14
Hình 1.9. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen ASS1 .........................................15
Hình 1.10. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen SLC25A13 ..............................16
Hình 1.11. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen ASL .........................................16
Hình 1.12. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen ARG1 ......................................18
Hình 1.13. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen SLC25A15 ..............................18
Hình 1.14. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen OTC ........................................19
Hình 1.15. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen LAMA2 ...................................33
Hình 2.1. Sơ đồ chi tiết quy trình nghiên cứu ...........................................................45
Hình 2.2. Quy trình phân tích và chú giải biến thể ...................................................47
Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnh
R01, R02, R03, R04 và các thành viên trong gia đình ..............................................59
Hình 3.2. Phả hệ và các biến thể trên gen BCKDHB ở gia đình người bệnh R01 ....65
Hình 3.3. Phả hệ và các biến thể trên gen BCKDHB ở gia đình người bệnh R02 ....66
Hình 3.4. Phả hệ và các biến thể trên gen BCKDHB ở gia đình người bệnh R03 ....67
Hình 3.5. Phả hệ và biến thể trên gen DBT ở gia đình người bệnh R04 ...................68
Hình 3.6. Kết quả phân tích các biến thể trên gen BCKDHB, DBT bằng một số công
cụ tin sinh. (a) PON-P2, (b) PROVEAN, (c) PANTHER, (d) Fathmm. ..................69
Hình 3.7. Gióng hàng trình tự amino acid bị thay thế xung quanh vị trí biến thể giữa
các loài.......................................................................................................................71
Hình 3.8. Cấu trúc 3D của protein BCKDHB xung quanh các vị trí biến thể ..........72
Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnh
R05, R06, R07 và các thành viên trong gia đình. .....................................................77
Hình 3.10. Phả hệ và biến thể trên gen OTC ở gia đình người bệnh R05 ................82
- x
Hình 3.11. Phả hệ và biến thể trên gen OTC ở gia đình người bệnh R06 ................83
Hình 3. 2. Phả hệ và biến thể trên gen OTC ở gia đình người bệnh R07 .................84
Hình 3.13. Gióng hàng trình tự amino acid bị thay thế xung quanh vị trí biến thể
giữa các loài ..............................................................................................................86
Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số trên gel agarose 1% của người bệnh
loạn dưỡng cơ R08, R09 và Bố Mẹ...........................................................................89
Hình 3.15. Phả hệ và biến thể trên gen LAMA2 ở gia đình người bệnh R08, R09 ...94
Hình 3.16. Phân tích biến thể p.H260Y và p.C996Y trên gen LAMA2 ....................96
Hình 3.17. Dự đoán các liên kết disulfide của biến thể p.H260Y và p.C996Y trên
chuỗi polypeptide của protein LAMA2 bằng công cụ ScanProsite. .........................97
- 1
MỞ ĐẦU
Tại Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có một cuộc điều tra hay thống kê chính
thức về các bệnh hiếm gặp. Hiện nay, Việt Nam có duy nhất một câu lạc bộ dành
cho các người bệnh mắc bệnh hiếm tại Bệnh viện Nhi Trung ương, được thành lập
vào ngày 11/11/2014. Ngày 16/5/2019, Bộ Y tế tổ chức phiên họp đầu tiên của Hội
đồng tư vấn về quản lý bệnh hiếm. Theo số liệu của Bộ Y tế, Việt Nam có khoảng 6
triệu người đang sống chung với các căn bệnh hiếm. Trong đó, hơn 50% trường hợp
phát hiện bệnh hiếm là ở trẻ em, có tới 30% trẻ mang bệnh tử vong trước 5 tuổi và
được xếp hàng thứ hai trong các nguyên nhân gây tử vong sơ sinh tại Việt Nam.
Thêm vào đó, 80% các hội chứng hiếm gặp có nguyên nhân di truyền và trẻ sẽ mắc
bệnh suốt đời.
Bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ là ba
trong những bệnh hiếm gặp ở trẻ nhỏ. Giai đoạn khởi phát bệnh các bệnh này phụ
thuộc vào mức độ nghiêm trọng khác nhau của bệnh. Do đó, việc chẩn đoán sớm và
chính xác nguyên nhân gây bệnh là cơ sở để đưa ra các liệu pháp điều trị phù hợp,
hạn chế được những biến chứng nghiêm trọng. Tuy nhiên, mức độ nghiêm trọng và
phổ lâm sàng rộng cùng với số lượng người bệnh hạn chế là các lý do gây khó khăn
cho các bác sĩ và chuyên gia y tế trong việc đưa ra các chẩn đoán chính xác.
Giải trình tự Sanger là phương pháp thường được sử dụng trong chẩn đoán
các bệnh di truyền nói chung và bệnh hiếm gặp nói riêng. Công việc này cần được
thực hiện trên tất cả các gen liên quan đến bệnh, do đó tiêu tốn nhiều thời gian và
cần đến chi phí lớn. Năm 2005, sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ
mới (NGS) cho phép phân tích đồng thời nhiều hoặc thậm chí tất cả các gen, nhờ đó
có thể khắc phục được nhược điểm nêu trên. Trong đó, phương pháp giải trình tự
toàn bộ vùng gen mã hóa (WES), một trong những ứng dụng của NGS, đã được
chứng minh là một công cụ hiệu quả trong việc xác định gen gây bệnh theo di
truyền Mendel do vùng gen mã hóa chỉ chiếm 1% hệ gen nhưng số lượng bệnh do
biến thể nằm trong vùng này lên tới 85%. Thực tế đã chứng minh, hàng chục nghìn
biến thể gen đã được xác định trong vùng gen mã hóa ở nhiều người mắc bệnh phức
tạp như: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa….
Trên cơ sở đó, phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa (WES)
được sử dụng để xác định nguyên nhân di truyền ở các người mắc bệnh xirô niệu, rối
- 2
loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ ở Việt Nam. Kết quả thu được có thể
là cơ sở hỗ trợ các bác sĩ đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp cho người bệnh và đề
xuất các phương án tư vấn di truyền cho gia đình người bệnh.
Xuất phát từ những lý do nêu trên nghiên cứu sinh đã lựa chọn đề tài “Nghiên
cứu biến đổi gen ở người bệnh mắc bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển
hóa urê và bệnh loạn dưỡng cơ ở Việt Nam bằng công nghệ giải trình tự gen thế
hệ mới”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa ở người bệnh mắc xirô niệu, rối loạn
chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại Việt Nam;
- Xác định được các biến thể mang tính di truyền theo phả hệ trong gia đình
của người bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ tại
Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
1. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu một số người bệnh
xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê, loạn dưỡng cơ và các thành viên trong
gia đình.
2. Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa của một số người bệnh xirô niệu, rối loạn
chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ.
3. Phân tích số liệu, phát hiện các đột biến di truyền trên các gen liên quan đến
bệnh xirô niệu, rối loạn chu trình chuyển hóa urê và loạn dưỡng cơ.
4. Phân tích in silico dự đoán ảnh hưởng của các đột biến đến chức năng
protein tương ứng.
- 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh xirô niệu (MSUD)
1.1.1. Khái niệm
Bệnh xirô niệu (MSUD) là một rối loạn chuyển hóa hiếm gặp, di truyền gen
lặn trên nhiễm sắc thể thường. Cơ thể của người bệnh không thể chuyển hóa được
các amino acid mạch nhánh (BCAA) bao gồm leucine, isoleucine và valine. Sự tích
tụ của các amino acid này trong nước tiểu tạo ra mùi đặc trưng và là nguồn gốc tên
của bệnh. Nếu không được điều trị kịp thời, bệnh có thể tiến triển đến co giật, hôn
mê và thậm chí tử vong sớm, thường trước 3 tháng tuổi.
Xirô niệu là bệnh hiếm gặp với tỷ lệ mắc ước tính khoảng 1/185.000 trên toàn
thế giới [1]. Tuy nhiên, ở các quốc gia có tỷ lệ hôn nhân cận huyết cao, con số này có
thể lớn hơn [2]. Đến nay, tỷ lệ mắc bệnh xirô niệu ở Việt Nam chưa được thống kê
đầy đủ và chính thức.
1.1.2. Cơ chế bệnh sinh
Bệnh xirô niệu gây ra do biến thể xuất hiện trên gen BCKDHA, BCKDHB,
DBT và DLD, mã hóa tương ứng cho các tiểu đơn vị E1α, E1β, E2, E3 của phức
hợp α-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD). Phức hợp BCKD xúc tác quá
trình khử carboxyl hóa các α-ketoacid mạch nhánh, bước thứ hai trong quá trình
phân giải các amino acid mạch nhánh. Biến thể trên các gen mã hóa làm suy giảm
hoặc mất chức năng của phức hợp, từ đó dẫn đến sự tích tụ các amino acid mạch
nhánh như leucine, isoleucine, valine trong máu và các α-ketoacid mạch nhánh
trong máu và nước tiểu [3]. Sự tích lũy các chất này có thể gây tổn thương hệ thần
kinh thông qua việc ngăn cản quá trình tổng hợp các chất dẫn truyền thần kinh quan
trọng và quá trình myelin hóa xảy ra ở các tế bào thần kinh [3].
Leucine, isoleucine, valine là 03 amino acid thiết yếu, không thể tự tổng hợp ở
động vật có vú và được đưa vào cơ thể qua đường thức ăn. Do BCAA cần thiết cho
quá trình tổng hợp protein, các acid béo mạch nhánh, chất dẫn truyền thần kinh nên
quá trình dị hóa các BCAA được kiểm soát chặt chẽ, thông qua phức hợp enzyme
BCKD. Bước đầu tiên trong quá trình dị hóa BCAA là chuyển nhóm amin của
leucine, isoleucine, valine cho α-ketoglutarate (α-KG) tạo thành glutamate và các
ketoacid mạch nhánh (BCKA) tương ứng bao gồm α-ketoisocaproate (KIC), α keto-
methylvalate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV), với sự xúc tác của aminotransferase
- 4
(Hình 1.1). Bước tiếp theo là quá trình khử carboxyl oxy hóa thông qua phức hợp
BCKD. Ở người mắc bệnh xirô niệu, bước này bị gián đoạn.
Hình 1.1. Quá trình phân giải các amino acid mạch nhánh (BCAA) [4]
Quá trình chuyển gốc amin của BCAA được thực hiện nhờ vào vai trò xúc tác của
aminotransferase tạo sản phẩm là các ketoacid mạch nhánh (BCKA): α-ketoisocaproate
(KIC), α-keto-β-methylvalerate (KMV), α-ketoisovalerate (KIV) (phản ứng 1). Quá trình
khử carboxyl oxi hóa của các ketoacid mạch nhánh (BCKA) được thực hiện nhờ phức hợp
a-ketoacid dehydrogenase mạch nhánh (BCKD) (phản ứng 2) [4].
1.1.3. Di truyền phân tử
BCKD là enzyme điều hòa quan trọng nhất trong con đường dị hóa của các
BCAA, nằm trong ty thể, gồm 03 thành phần xúc tác decarboxylase E1,
dihydrolipoyl transacylase E2, dihydrolipoamide dehydrogenase E3 và 02 enzyme
điều hòa (BCKD kinase, BCKD phosphatase) [5]. Các thành phần E1 (02 tiểu đơn vị
α và 02 tiểu đơn vị β), E2 và E3 được mã hóa lần lượt bởi các gen BCKDHA,
BCKDHB, DBT, DLD đều nằm trong nhân (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Các gen liên quan đến bệnh xirô niệu
Gen Vị trí Số amino acid Số exon
BCKDHA 19q13.2 445 9
BCKDHB 6q14.1 392 11
DBT 1q21.2 482 11
DLD 7q31.1 486 11
Thành phần E1, được tạo nên từ 02 tiểu phần E1α và 02 tiểu phần E1β. Gen
mã hóa cho tiểu đơn vị E1α, BCKDHA, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể 19 tại
- 5
vị trí 19q13.2 (Hình 1.2). Gen BCKDHA gồm 9 exon, mã hóa cho một mRNA 1,6
kb và được dịch mã thành 378 aa với một trình tự dẫn đầu dài 45 aa.
Hình 1.2. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHA
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)
Gen BCKDHB mã hóa cho tiểu đơn vị E1β nằm trên cánh dài của nhiễm sắc
thể số 6 tại vị trí 6q14.1, gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,4 kb và dịch mã
thành 342 aa với một trình tự dẫn đầu dài 50 aa (Hình 1.3).
Hình 1.3. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen BCKDHB
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)
Thành phần E2, là một dihydrolipoyl transacylase (DBT), tồn tại dưới dạng
homo-24mer hình bát giác đối xứng trong phức hợp BCKD, giữ vai trò như là “lõi”
chức năng của phức hợp do sự có mặt của các vùng lipoyl. Thành phần này hoạt
động như cánh tay xoay dài để chuyển giao, tiếp nhận các chất trung gian giữa các
trung tâm hoạt động hoặc tiểu đơn vị khác của phức hợp. Gen mã hóa cho thành
phần E2, DBT, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 1 tại vị trí 1p21.2 (Hình
1.4). Gen DBT gồm 11 exon, mã hóa cho một mRNA 1,46 kb và dịch mã thành 421
amino acid với một trình tự dẫn đầu có kích thước 56 aa.
Hình 1.4. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DBT
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)
- 6
Thành phần E3, tồn tại như một homodimer trong phức hợp BCKD. Gen mã
hóa cho thành phần E3, DLD, nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể số 7 tại vị trí
7q31.1 (Hình 1.5). Gen DLD gồm 11 exon, mã hóa 02 mRNA 2,2 kb và 2,4 kb, dịch
mã thành 509 aa với một trình tự dẫn đầu có chiều dài không xác định. Thành phần
E1 và E2 xuất hiện duy nhất trong phức hợp BCKD, trong khi thành phần E3 có
mặt trong hai enzyme ty thể khác (pyruvate dehydrogenase và phức hợp α-
ketoglutarate dehydrogenase, giữ vai trò quan trọng trong chu trình Krebs). Thành
phần này còn được gọi là protein L của hệ thống phân cắt glycine ty thể.
Hình 1.5. Vị trí trên nhiễm sắc thể và cấu trúc gen DLD
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/tools/gdp)
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán
Dựa vào triệu chứng lâm sàng, MSUD được phân loại thành 05 kiểu, không
có mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và kiểu hình bao gồm kiểu cổ điển, trung
gian, không liên tục, đáp ứng thiamine và thiếu E3.
Bệnh xirô niệu kiểu cổ điển và kiểu thiếu E3 thường khởi phát ngay trong
thời kỳ sơ sinh, trong khi các kiểu còn lại có thể xuất hiện bất cứ giai đoạn nào khi
người bệnh phải đối mặt với các yếu tố stress. Các triệu chứng lâm sàng của MSUD
phụ thuộc vào mức độ hoạt động của phức hợp BCKD. Ở người bệnh kiểu cổ điển,
hoạt tính của BCKD < 2%, mùi xirô xuất hiện trong ráy tai ngay sau khi sinh và
trong nước tiểu ở tuần đầu tiên [4]. Nếu không được điều trị kịp thời, các triệu
chứng ở trẻ sơ sinh có thể tiến triển thành cáu kỉnh, thờ ơ, bú kém, ngưng thở, thậm
chí hôn mê và tử vong sớm do phù não. Ở những người lớn tuổi, tăng leucine gây ra
hiện tượng đau, chán ăn, nôn, mệt mỏi cơ, thay đổi mức độ của ý thức, các triệu
chứng tâm thần, rối loạn vận động và mất điều hòa. Trong thời kỳ dị hóa protein nội
sinh (sốt, nhiễm trùng, vận động quá sức, chấn thương hoặc phẫu thuật), những
người mắc bệnh xirô niệu có thể bị suy thoái thần kinh do nhiễm độc leucine cấp
tính [2] .
Hoạt tính của enzyme BCKD ở những người mắc bệnh xirô niệu kiểu trung
- 7
gian lên tới 30%. Những người này có thể có biểu hiện khỏe mạnh trong thời kỳ sơ
sinh, mặc dù có thể có mùi xirô trong ráy tai. Trong những năm đầu đời, người bệnh
có thể gặp phải các vấn đề về ăn uống, kém tăng trưởng về thể chất, thiểu năng trí
tuệ và dễ mắc các triệu chứng thần kinh tương tự như người mắc MUSD thể cổ
điển. Người mắc bệnh xirô niệu kiểu không liên tục, thường không xuất hiện triệu
chứng. Sự phát triển về thể chất và thần kinh ở người bệnh kiểu này bình thường
ngay cả khi không áp dụng chế độ ăn kiêng. Ở các trạng thái dị hóa, các đặc điểm
lâm sàng và sinh hóa của người bệnh có thể tương tự như người mắc bệnh thể cổ
điển, do đó, người bệnh cần được kiểm soát tương tự như người bệnh ở thể nặng.
Bệnh xirô niệu kiểu đáp ứng với thiamine là một kiểu hình hiếm gặp liên
quan đến các biến thể gây bệnh trên gen DBT mã hóa tiểu đơn vị E2 của phức hợp
BCKD. Người bệnh có các triệu chứng tương tự như bệnh xirô niệu kiểu trung gian,
thường được điều trị bằng cách kết hợp giữa chế độ ăn kiêng BCAA và bổ sung
thiamine. Tuy nhiên, đã từng xuất hiện người bệnh đáp ứng đầy đủ với thiamine
nhưng không cần đến chế độ ăn kiêng.
Hoạt động của protein DBT liên quan đến 03 phức hợp enzyme ty thể bao
gồm phức hợp alpha-ketoacid dehydrogenase (BCKD), α-ketoglutarate
dehydrogenase (αKGDH) và pyruvate dehydrogenase (PDH). Vì vậy, người bệnh
MUSD thiếu E3 có phổ kiểu hình rộng, từ các biểu hiện thần kinh khởi phát sớm
đến bệnh gan khởi phát ở người trưởng thành. Bệnh thường gặp nhất là thể nặng với
các triệu chứng lâm sàng như nhiễm toan chuyển hóa, bệnh não, khó khăn trong
việc ăn uống, suy gan và tử vong sớm. Bên cạnh đó, người mắc bệnh xirô niệu còn
tăng nồng độ lactate, alanine và α-ketoglutarate, là các yếu tố có liên quan đến sự
rối loạn chức năng ty thể [6]. Người bệnh có biểu hiện rối loạn chức năng gan có
thể đi kèm với các dấu hiệu và triệu chứng ở mọi lứa tuổi, các đợt tái phát của bệnh
gan giảm dần theo tuổi, thường bị kích hoạt bởi trạng thái tăng chuyển hóa.
1.1.5. Tình hình nghiên cứu bệnh xirô niệu trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Từ phát hiện đầu tiên của Menkes và cộng sự (1954) đến nay, nhiều nghiên
cứu về bệnh MUSD đã được tiến hành ở các quốc gia trên thế giới. Năm 1960, sự
sai hỏng trong quá trình khử các α-ketoacid mạch nhánh có nguồn gốc từ leucine,
isoleucine, valine được phát hiện là nguyên nhân gây bệnh MUSD. Từ các dòng tế
- 8
bào được chọn ngẫu nhiên của 63 người bệnh MUSD, Nellis và Danner (2001) xác
định được tần suất biến thể ở gen mã hóa cho tiểu đơn vị E1α, E1β, E2 tương ứng là
33%, 38%, 19% [7]. Phân tích tiền sử gia đình và xét nghiệm biến thể p.Y393N trên
gen BCKDHA, nhóm nghiên cứu của Morton (20022) phát hiện được 36/219 người
mắc MUSD trong 11 năm (1990-2001) [8]. Bảy biến thể trong đó 01 biến thể trên
BCKDHA (p.C219W); 04 biến thể trên BCKDHB (p.H156Y, p.V69G, IVS9del3bp,
c.1109ins8bp) và 02 biến thể trên DBT (p.H391R, p.S133X) được tìm thấy ở các
người bệnh MUSD, người Isreal bằng phương pháp phân tích hoạt tính và cấu trúc
của enzyme [9]. Kết quả giải trình tự bộ gen DBT ở 13 gia đình người Philippine
mắc bệnh MUSD sàng lọc được 01 biến thể mất đoạn lớn gây ra bởi sự tái tổ hợp
không tương đồng giữa đoạn lặp L1 ở intron 10 và đoạn lặp Alu ở exon 11, dẫn đến
đoạn mRNA 239 bp được chèn vào phía sau exon 10, tạo đuôi exon mới [10]. Năm
2005, phương pháp khối phổ được sử dụng phát hiện nồng độ BCAA tăng cao trong
máu, cho phép phát hiện bệnh MUSD 24 - 48 giờ sau sinh, trước khi xuất hiện các
triệu chứng của bệnh não. Vì thế, người bệnh có thể được can thiệp kịp thời mà
không cần đến sử dụng đến các chất giải độc tố ngoại sinh, nhờ đó giảm nguy cơ
tổn thương não trong giai đoạn đặc biệt dễ bị tổn thương đồng thời giảm đáng kể chi
phí điều trị. Sàng lọc bằng phương pháp giải trình tự Sanger ở 33 người Tây Ban
Nha, 15 biến thể trên BCKDHA, 14 biến thể trên BCKDHB và 7 biến thể trên DBT
được phát hiện [11]. Bằng phương pháp giải trình tự Sanger, 15 người bệnh MUSD
từ Đức, Áo, Thụy Sỹ được giải trình tự các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT và phát
hiện được 06 biến thể thay thế trên BCKDHA, 10 biến thể trên BCKDHB và 04 biến
thể trên DBT [12]. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng lớp mỏng, 21 người bệnh
người Philippine (10 bé trai, 11 bé gái, từ 2 - 14 ngày tuổi) được chẩn đoán MUSD
trong giai đoạn 1999 - 2004 [13]. Phương pháp so sánh nồng độ leucine trong máu
khô và huyết tương được áp dụng thành công để phân biệt các kiểu MUSD ở 19 trẻ
sơ sinh ở Đức và Áo trong giai đoạn 1999 - 2005 [14]. Phương pháp Sanger được
sử dụng để giải trình tự tất cả exon của các gen BCKDHA, BCKDHB, DBT ở nhóm
32 người mắc MUSD thể cổ điển nặng và nhẹ, người Thổ Nhĩ Kỳ. Kết quả phát
hiện được 27 biến thể, hầu hết ở dạng đồng hợp tử (chiếm 92%), cụ thể 12 biến thể
trên BCKDHA (37% số người bệnh), 10 biến thể trên BCKDHB (chiếm 44% số
người bệnh), 05 biến thể trên DBT (chiếm 19% số người bệnh) [15]. Một biến thể
nguon tai.lieu . vn