Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh MSSV: 40201104 Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AURAMINE O VÀ RHODAMINE B TRONG MỘT SỐ MẪU GIA VỊ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI DETECTOR TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN Sinh viên thực hiện: Phan Thị Ngọc Trinh MSSV: 40201104 Giáo viên hướng dẫn: Ths. Huỳnh Thị Nhàn Ths. Nguyễn Thị Tuyết Nhung TP Hồ Chí Minh - Tháng 5/2018
  3. LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Tuyết Nhung và cô Huỳnh Thị Nhàn vì đã giao cho em đề tài nghiên cứu này. Cảm ơn cô vì đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ em trong suốt thời gian nghiên cứu. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Hưng, thầy Nguyễn Thành Lộc, thầy Trần Bữu Đăng, cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, cô Phạm Thị Thảo Uyên và cô Văn Thị Cẩm Duyên đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận. Và em cũng không quên gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Hồng Vân, thầy Huỳnh Lời, thầy Lê Văn Huấn và Trung tâm Khoa học Công nghệ Dược Sài Gòn (Sapharcen) – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được sử dụng trang thiết bị, máy móc cần thiết phục vụ đề tài này và cũng hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em. Cảm ơn gia đình, tất cả bạn bè đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và là chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên cho em trong những lúc khó khăn. Đặc biệt, cảm ơn bạn Nguyễn Thanh Thơi đã đồng hành cùng em trong quá trình thực hiện đề tài. Một lần nữa em xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy em trong bốn năm qua. Cuối cùng xin cảm ơn tất cả mọi người. Kính chúc thầy cô, tất cả bạn bè và gia đình thật nhiều sức khỏe. TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018 Sinh viên Phan Thị Ngọc Trinh
  4. XÁC NHẬN CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... ........................................................................................................................................... Chủ tịch Hội đồng
  5. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3 1.1. Auramine O .........................................................................................................3 1.1.1. Khái quát chung .............................................................................................. 3 1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học ................................................................ 3 1.1.3. Độc tính...........................................................................................................4 1.2. Rhodamine B .......................................................................................................4 1.2.1. Khái quát chung .............................................................................................. 4 1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học ................................................................ 4 1.2.3. Độc tính...........................................................................................................5 1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước ..5 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............8 1.4.1. Định nghĩa.......................................................................................................8 1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký ............................................................... 8 1.4.3. Phân loại sắc ký hấp phụ ................................................................................9 1.4.4. Một số đại lượng đặc trưng của hệ sắc ký ....................................................10 1.4.5. Hệ thống HPLC ............................................................................................ 15 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................................18 2.1. Hóa chất và dụng cụ..........................................................................................18 2.1.1. Hóa chất ........................................................................................................18 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị ..........................................................................................19 2.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................20 2.3. Các bước tiến hành sắc ký ................................................................................20 2.3.1. Chuẩn bị dung môi........................................................................................20
  6. 2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo ...........................................................................................20 2.3.3. Cách vận hành thiết bị ..................................................................................21 2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký ..........................................................22 2.4.1. Khoảng bước sóng của detector....................................................................22 2.4.2. Tối ưu hóa pha động .....................................................................................22 2.5. Thẩm định phương pháp ..................................................................................26 2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn ..............................................26 2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).............27 2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo....................................................................28 2.6. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu.....................................................................................29 2.6.1. Lấy mẫu ........................................................................................................29 2.6.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích ............................................................................30 2.7. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị ................................................................ 30 2.7.1. Khảo sát giai đoạn chiết pha rắn (SPE) ........................................................30 2.7.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết ..................................................................32 2.7.3. Xác định hệ số thu hồi của quy trình ............................................................ 33 2.7.4. Tính chọn lọc của quy trình ..........................................................................33 2.8. Phân tích một số mẫu gia vị ..............................................................................33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 34 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký ................................................................ 34 3.1.1. Chọn khoảng bước sóng cho detector...........................................................34 3.1.2. Tối ưu hóa pha động .....................................................................................34 3.2. Thẩm định phương pháp ..................................................................................46 3.2.1. Xây dựng đường chuẩn .................................................................................46 3.2.3. Xác định LOD, LOQ ....................................................................................48 3.2.4. Xác định độ lặp lại của phương pháp ...........................................................50
  7. 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị ................................................................ 50 3.3.1. Khảo sát giai đoạn SPE.................................................................................50 3.3.2. Khảo sát thể tích dung dịch chiết ..................................................................53 3.3.3. Tính chọn lọc của quy trình ..........................................................................54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................56 4.1. Kết luận ..............................................................................................................56 4.2. Đề xuất................................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................58 PHỤ LỤC .....................................................................................................................60
  8. DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB ...................................................... 5 Bảng 2.1. Danh mục dung môi ..................................................................................... 18 Bảng 2.2. Danh mục hóa chất ....................................................................................... 18 Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu .......................... 19 Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB .. 27 Bảng 2.5. Thông tin về các mẫu gia vị phân tích .......................................................... 29 Bảng 3.1. Kết quả bước sóng hấp thụ cực đại, độ hấp thụ quang của AO và RB trong MeOH và ACN .............................................................................................................. 34 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của CH3COOH đến sự phân tách AO, RB ................................ 37 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HCOOH đến sự phân tách AO, RB .................................... 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của H3PO4 đến sự phân tách AO, RB ........................................ 39 Bảng 3.5. Chương trình gradient pha động khảo sát tốc độ dòng................................. 40 Bảng 3.6. Khảo sát tỷ lệ dung môi ban đầu .................................................................. 41 Bảng 3.7. Các chương trình sắc ký với đệm acetate (pH = 4,2) ................................... 42 Bảng 3.8. So sánh kết quả khảo sát giữa dung môi MeOH với dung môi ACN .......... 43 Bảng 3.9. Chương trình pha động tối ưu ...................................................................... 45 Bảng 3.10. Giá trị nồng độ và diện tích của peak AO, RB thu được khi tiến hành phân tích HPLC ...................................................................................................................... 46 Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD ................................................................................ 48 Bảng 3.12. Kết quả xác định LOQ ................................................................................ 49 Bảng 3.13. Kết quả độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak ............................... 50 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát của giai đoạn SPE ........................................................... 51 Bảng 3.15. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN khảo sát ...................................................... 52 Bảng 3.16. Tỷ lệ phần trăm thể tích ACN và hệ số thu hồi của giai đoạn SPE ............ 52 Bảng 3.17. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 1 ................................................................................................................ 53 Bảng 3.18. Hệ số thu hồi của bước khảo sát thể tích dung dịch chiết đối với mẫu ngũ vị hương lần 2 ................................................................................................................ 54 Bảng 4.1. Thành phần pha động ................................................................................... 56 Bảng 4.2. Phương trình đường chuẩn của AO và RB ................................................... 56
  9. DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của AO .............................................................................. 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của RB .............................................................................. 4 Hình 1.3. Sơ đồ sự tương tác trong cột sắc ký ................................................................ 9 Hình 1.4. Thời gian lưu trong HPLC [6] ...................................................................... 10 Hình 1.5. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] ............................................. 14 Hình 1.6. Các thiết bị trong hệ thống HPLC ............................................................... 15 Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) ................ 23 Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) .................. 24 Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 ................ 25 Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 ....................... 25 Hình 2.5. Cách xác định S/N [4] ................................................................................... 27 Hình 2.6. Sơ đồ các giai đoạn chiết pha rắn ................................................................. 30 Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chiết mẫu gia vị ................................................................... 32 Hình 3.1. Sắc đồ của chương trình 5 ............................................................................ 35 Hình 3.2. Sắc đồ của chương trình 6 ............................................................................ 35 Hình 3.3. Sắc đồ của chương trình 7 ............................................................................ 36 Hình 3.4. Sắc đồ của chương trình 8 ............................................................................ 36 Hình 3.5. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acetic acid (pH = 3,0) ............................ 37 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số không đối xứng T theo pH ........... 38 Hình 3.7. Sắc đồ khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid formic (pH = 3,0) ................ 38 Hình 3.8. Khảo sát sự tách AO, RB sử dụng acid phosphoric 0,03% .......................... 39 Hình 3.9. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,6 mL/phút ......................... 40 Hình 3.10. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,7 mL/phút ....................... 40 Hình 3.11. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 0,85 mL/phút ..................... 40 Hình 3.12. Sắc đồ chuẩn AO và RB ứng với tốc độ dòng 1,0 mL/phút ....................... 41 Hình 3.13. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn AO .................. 47 Hình 3.14. Quan hệ tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn RB................... 47 Hình 3.15. Sắc đồ xác định LOD của AO và RB ......................................................... 48 Hình 3.16. Sắc đồ xác định LOQ của AO và RB ......................................................... 49 Hình 3.17. Độ tinh khiết của peak AO, RB xác định bằng phần mềm ......................... 55
  10. Hình 3.18. Sắc đồ chuẩn AO 0,03 ppm và RB 0,02 ppm trong nền mẫu ngũ vị hương ....................................................................................................................................... 55 Hình 4.1. Sơ đồ giai đoạn SPE tối ưu ........................................................................... 57
  11. KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt (Tiếng Anh) ACN Acetonitrile AO Auramine O AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association Official Analytical Chemists) C Nồng độ (Concentration) CPT Chất phân tích EtOH Ethanol H Chiều cao peak sắc ký HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) IARC Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới (International Agency for Research on Cancer) LC Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) LC50 Nồng độ hóa chất cho các thí nghiệm hít phải trong không khí có thể tiêu diệt 50% các động vật thử nghiệm trong một thời gian nhất định (Lethal Concentration, 50%) LD50 Lượng chất độc hoặc phóng xạ cần thiết để tiêu diệt 50% số lượng sinh vật thử nghiệm sau một khoảng thời gian nhất định (Lethal Dose, 50%) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol MP Pha động (Mobile Phase) MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) PAD, DAD Detector mảng diot quang (Photo Array Diode Detector) PDA Mảng diot quang (Photo Diode Array) ppm Một phần triệu (Parts Per Milion) RB Rhodamine B
  12. RP Pha đảo (Reversed Phase) Speak Diện tích peak sắc ký SP Pha tĩnh (Stationary Phase) SPE Chiết pha rắn (Solid Phase Extraction) STT Số thứ tự tR Thời gian lưu (Retention Time) v:v Tỷ lệ về thể tích UV/Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible)
  13. MỞ ĐẦU Nhằm đáp ứng nhu cầu đời sống ngày càng cao của con người thì công nghiệp thực phẩm ngày càng phát triển nhanh. Trong những năm gần đây, vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Việc sử dụng các chất phụ gia trong sản xuất và bảo quản gia vị đang ngày càng được coi trọng. Để tạo màu sắc đẹp và bắt mắt cho gia vị thì trong quá trình sản xuất, một số cơ sở sản xuất sử dụng thêm các phẩm màu công nghiệp cho vào gia vị. Điều này khiến người tiêu dùng đang bị đánh lừa bởi vẻ ngoài của các sản phẩm gia vị đang được bày bán trên thị trường. Trong số các phẩm màu công nghiệp này, phải kể đến Auramine O (AO) và Rhodamine B (RB), hai phẩm màu công nghiệp bị cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị và được xếp vào nhóm chất có khả năng gây ung thư. Hiện nay, AO và RB chỉ còn sản xuất ở các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ,…). Trong một vài năm trở lại đây, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam nổi cộm với vấn đề bột gia vị, thực phẩm nhiễm phẩm màu độc hại. Cụ thể, AO từng bị phát hiện trong một số loại thực phẩm như thịt gà, măng chua, dưa cải chua; RB cũng bị phát hiện trong hạt dưa, ớt bột,… Mặc dù, AO và RB là hai chất cấm sử dụng trong thực phẩm, gia vị nhưng vẫn được thêm vào, điều này thật đáng lo ngại. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các phòng kiểm nghiệm đã được trang bị các kỹ thuật hiện đại để phân tích và xác định hàm lượng của các phẩm màu công nghiệp đã sử dụng trái phép trong sản xuất, nhằm kiểm soát chất lượng thực phẩm. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong số những phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay. HPLC có nhiều ưu điểm như: phân tích nhanh chóng, xác định đồng thời được nhiều chất, ít tốn mẫu, thao tác đơn giản… Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, đã có những công trình nghiên cứu xác định RB trong thực phẩm, gia vị bằng phương pháp HPLC [1],[8]; xác định AO trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp HPLC [5]. Qua đó, chúng tôi thấy rằng chưa có những nghiên cứu về quy trình xác định đồng thời AO và RB trong bột gia vị. 1
  14. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời Auramine O và Rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến” với mong muốn đề xuất quy trình phân tích hiệu quả, phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm với hai mục tiêu: - Xây dựng được quy trình xác định đồng thời AO và RB bằng phương pháp HPLC kết nối detector tử ngoại khả kiến. - Áp dụng quy trình này để xác định đồng thời AO và RB trong mẫu gia vị. 2
  15. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Auramine O 1.1.1. Khái quát chung Auramine O (dạng muối hydrochloride) thuộc nhóm thuốc nhuộm diphenylmethane [22]. AO được sử dụng làm chất nhuộm màu cho giấy và mực, ở mức độ thấp hơn đối với hàng dệt và da. AO đã được phát hiện trong các mẫu thực phẩm từ Ấn Độ, bao gồm cả đậu Hà Lan tươi và các sản phẩm đậu ở Trung Quốc. Việc sản xuất AO bị cấm ở Châu Âu và Hoa Kỳ, hiện nay chủ yếu sản xuất ở Ấn Độ và Trung Quốc [19]. Bên cạnh đó, AO không có trong danh sách phụ gia thực phẩm trong quy chuẩn Việt Nam. AO thường chứa dextrin hoặc các chất pha loãng khác được thêm vào để chuẩn hóa hàm lượng thuốc nhuộm. AO được sử dụng như là nguyên liệu tạo màu vàng, kết hợp với các thuốc nhuộm khác, nó tạo ra hoặc tăng cường màu xanh hoặc đỏ. Năng suất lượng tử của thuốc nhuộm huỳnh quang này phụ thuộc vào độ nhớt của dung môi; trong ethanol 95% hoặc saccarose 60% thì cao gấp 87 và 10 lần so với trong nước. Ngoài ra AO còn được dùng làm chất nhuộm màu huỳnh quang, khi kết hợp với thuốc nhuộm RB làm cho các vi sinh vật kháng acid phát huỳnh quang [23]. 1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học NH.HCl N N Hình 1.1. Công thức cấu tạo của AO - Công thức phân tử: C17H21N3 HCl. Khối lượng mol phân tử: 303,834 g/mol - Danh pháp: 4,4'-Carbonimidoylbis [N, N-dimethylbenzenamine] hydrochlorid - Tên gọi khác: Auramine O, Basic Yellow 2, Vàng ô - AO dạng tinh khiết là chất bột màu vàng. Tan trong nước và EtOH, tan rất ít trong xylene [22] (10 mg/mL trong nước; 20 mg/mL trong EtOH; 60 mg/mL trong ethylene glycol methyl ether [19]). AO nóng chảy ở trên 250 °C. Bước sóng hấp thụ cực đại là 370 nm, 432 nm. Bước sóng phát xạ cực đại là 550 nm. pKa: 9,8 ; 10,7 [22] 3
  16. 1.1.3. Độc tính Một nghiên cứu ở Anh đã báo cáo ca lâm sàng ung thư bàng quang ở công nhân làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất AO [19]. Các nhà khoa học cũng đã tiến hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của AO trên động vật. Kết quả cho thấy, AO làm tổn thương ADN trên gan, thận, tuỷ xương của chuột nhắt và chuột cống với liều LD50 là 135 mg/kg, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối u lympho trên chuột. Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp AO vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người [19]. 1.2. Rhodamine B 1.2.1. Khái quát chung Rhodamine B thuộc nhóm thuốc nhuộm xanthene. RB được sử dụng làm thuốc nhuộm cho giấy, len, lụa và mỹ phẩm [24]. Ngoài ra RB còn được sử dụng trong sinh học như là chất nhuộm phát huỳnh quang, thường được kết hợp với AO trong phép nhuộm Auramine - Rhodamine để phát hiện trực khuẩn lao, Mycobacterium tuberculosis (MTB) [13]. 1.2.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học Hình 1.2. Công thức cấu tạo của RB - Công thức phân tử: C28H31ClN2O3. Khối lượng mol phân tử: 479,02 g/mol - Danh pháp: 9-(2-carboxyphenyl)-6-(diethylamino)-N,N-diethyl-3H-xanthen-3-iminium - Tên gọi khác: Rhodamine B; Brilliant Pink B; Basic Violet 10; Tetraethylrhodamine - RB là tinh thể màu tối có ánh xanh, ở dạng bột màu nâu đỏ. Tan tốt trong MeOH, EtOH, nước (khoảng 50 g/L). Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 199°C đến 201°C. Bước sóng hấp thụ cực đại:  = 542 – 554 nm [3]. pKa: 3,1; 3,25 [4] 4
  17. 1.2.3. Độc tính RB gây độc tính cấp theo đường miệng, số liệu thống kê cho biết LD50 ở chuột là lớn hơn 2000 mg/kg. Kích thích và gây tổn thương mắt nghiêm trọng khi thử nghiệm với thỏ. Khi RB kết hợp với hemoglobin trong máu hình thành methemoglobin sẽ gây các triệu chứng như: đau đầu, loạn nhịp tim, giảm huyết áp, khó thở và co thắt. Nếu tích tụ trong thời gian dài còn gây hại cho thủy sinh vật. Chẳng hạn, LC50 thử nghiệm với Gambusia affinis (cá muỗi) là 10 – 100 mg/L trong 96 giờ [2]. 1.3. Tình hình nghiên cứu Auramine O và Rhodamine B trong và ngoài nước Bảng 1.1. Một số phương pháp xác định AO và RB CPT, nền Đánh giá Xử lý mẫu Phương pháp mẫu phương pháp Trong nước AO trong - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS - Khoảng tuyến thức ăn chăn MeOH - Cột Agilent C18 (1,8 µm x 2,1 tính: 0,5 – 50 nuôi [5] - Giai đoạn SPE: mm x 50 mm) và tiền cột tương ng/mL cột C18 ứng - LOD: 8 µg/kg  Rửa tạp bằng - Pha động: gradient hai kênh, - LOQ: 20 µg/kg dung môi MeOH : ACN (A) và HCOOH 0,1% (B) - Hệ số thu hồi: H2O (20:80, v:v) 82,4 – 109,2%  Rửa giải bằng dung môi MeOH AO trong - Dung môi chiết: LC – MS/MS - LOD: 3,0 µg/kg mẫu thịt và ACN - Cột sắc ký pha đảo C18 (1,8 µm (mẫu thịt); 5,0 các mẫu thực x 2,1 mm x 100 mm) µg/kg (mẫu thực phẩm khác - Pha động: gradient hai kênh, phẩm khác) [10] dung dịch ammonium acetate 0,005 M (A) và MeOH (B) 5
  18. RB trong bột - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - LOD: 0,2 ppm gia vị [1] hỗn hợp ACN : - Cột sắc ký: Symmetry C18 (5 - LOQ: 0,6 ppm acetone (90:10, v:v) m x 4,6 mm x 150 mm) - Hệ số thu hồi: - Pha động: ACN : ammonium 84,8 – 87,2 % acetate (60:40, v:v) RB trong gia - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis hoặc HPLC – _ vị và hạt dưa MeOH DAD [12] - Cột phân tích HPLC C18 (5 µm x 4,6 mm x 250 mm) - Pha động: đẳng dòng, ACN: H2O (75:25, v:v) RB trong hạt - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis Theo phương dưa, bánh xu hỗn hợp MeOH : - Pha tĩnh: RP – C8 (5 m x 4,6 pháp phân tích xê, sirô dâu, H2O (40:60, v:v) mm x 150 mm) trực tiếp: nước ngọt - Pha động: đẳng dòng, 85% - LOD: 1,00 ppb hương dâu [8] ACN – 15% đệm (HCOOH – - LOQ: 3,33 ppb 0,007 mM sodium 1 – Theo phương heptansunfonate), pH = 3,0 pháp đường chuẩn: - LOD: 15,0 ppb - LOQ: 50,2 ppb Ngoài nước RB trong bột - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - Khoảng tuyến ớt [18] hỗn hợp ACN : - Cột: Waters Novapark ODS (4 tính: 0,2 – 50 ppm acetone (90:10, v:v) μm x 3,9 mm x 150 mm) với cột - Hệ số thu hồi: 84 bảo vệ – 92% - Pha động: gradient hai kênh, 10 mM ammonium acetate, pH = 3,6 (A) và ACN (B) Auramine và - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - Khoảng tuyến RB trong 10 mL 5% amonia - Côt: µ-Bondapak C18 (3,9 mm tính: 0,2 – 25 ppm bánh quy, kẹo trong 75% MeOH x 300 mm) với tiền cột 90 mm (Auramine); 0,2 – ngọt [15] - Giai đoạn SPE: 50 ppm (RB) cột Polyamide 6
  19.  Rửa tạp: H2O - Pha động: ACN – sodium  Rửa giải: 3% acetate (20 mM, pH = 4,0; 80:20, - LOD: acetic acid - v:v) 0,107 – 0,754 MeOH (1:1, v:v) mg/L - LOQ: 0,371 – 2,27 mg/L - Hệ số thu hồi: 75 – 96,5% AO và RB - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS - LOD: 0,05 μg/kg trong bột ớt, hỗn hợp ACN : H2O - Cột XTerra C18 RP (5 µm x 2,1 - LOQ: 0,3 μg/kg tương ớt, xúc (90:10, v:v) mm x 150 mm) xích [16] - Pha động: gradient hai kênh, 5 mM ammonium acetate, pH = 3,0 (A), MeOH (B) AO và RB - Dung môi chiết: HPLC – MS/MS - LOD: 0,03 – trong các sản ACN - Cột: Waters XTerra C18 (5 µm 0,75 ppm phẩm từ đậu - Giai đoạn SPE: x 2,1 mm × 150 mm) - LOQ: 0,1 – 2,0 và thịt [17]  Pha loãng dịch - Pha động: gradient hai, 5 mM ppm chiết bằng nước ammonium acetate, pH = 3,0 (A) - Hệ số thu hồi: đến còn không và MeOH (B) 71,2 – 116,9% quá 5% ACN  Rửa giải: MeOH  Cô dịch chiết bằng khí nitơ. Phần còn lại tái tạo với ACN AO, RB trong - Dung môi chiết: HPLC – UV/Vis - Hệ số thu hồi: gia vị và thực hỗn hợp ACN : - Cột Waters C18 (5 µm x 4,6 mm 73,1 – 103,3% phẩm [21] acetone (90:10, v:v) x 250 mm) (AO) - Pha động: gradient hai kênh, 10 mM ammonium acetate, pH = 3,0 (A) và ACN, pH = 3,0 (B) 7
  20. 1.4. Cơ sở lý thuyết về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography). Phương pháp này ra đời năm 1967 – 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích cũng là phương pháp được ứng dụng trong nhiều ngành kiểm nghiệm [7]. 1.4.1. Định nghĩa Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử CPT lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu CPT gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử CPT có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4]. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách và phân tích các chất với pha động là chất lỏng, làm việc với áp suất từ 150 – 250 bar. Trong đó, pha tĩnh có thể là chất lỏng (nó được giữ trong cột tách như một lớp màng nhờ một chất mang trơ) hoặc là chất rắn. Cùng với pha tĩnh, trong kỹ thuật HPLC, pha động có thể chỉ là một dung môi nước hay dung môi hữu cơ; hỗn hợp của dung môi hữu cơ và nước… hoặc cũng có thể là dung môi có thêm các chất đệm, chất dẫn điện, chất tạo phức, …[6] Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký cột lỏng hiệu năng cao [6]. Trong kỹ thuật phân tích HPLC, tùy theo cơ chế của quá trình sắc ký trong cột tách mà người ta chia thành: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký rây phân tử [6]. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… 1.4.2. Nguyên tắc của các quá trình sắc ký Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố 8