Xem mẫu

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM KHOA HÓA HỌC – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ ------ VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) CBHD : TS. BÙI XUÂN HÀO TS. ĐẶNG HOÀNG PHÚ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 04/2019
  2. TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM KHOA HÓA HỌC – BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ ------ VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) CBHD : TS. BÙI XUÂN HÀO TS. ĐẶNG HOÀNG PHÚ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 04/2019
  3. NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... Xác nhận của Giảng Viên
  4. LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện và hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ với sự hướng dẫn của thầy Bùi Xuân Hào và thầy Đặng Hoàng Phú. Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Đặng Hoàng Phú và thầy Bùi Xuân Hào đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chia sẻ những kinh nghiệm, truyền đạt kiến thức chỉ dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện để hoàn thành tốt đề tài này. Cảm ơn các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ đã chia sẻ, giúp đỡ và hỗ trợ rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn.
  5. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU 1. TỔNG QUAN ......................................................................................................................1 1.1. Giới thiệu chung về cây Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis) ...........................1 1.1.1. Tên gọi ..............................................................................................................1 1.1.2. Nguồn gốc .........................................................................................................1 1.1.3. Mô tả thực vật ...................................................................................................2 1.1.4. Phân bố .............................................................................................................2 1.1.5. Trồng trọt, thu hái .............................................................................................3 1.2. Thành phần hóa học .......................................................................................................3 1.3. Hoạt tính sinh học ..........................................................................................................8 2. THỰC NGHIỆM ..................................................................................................................9 Điều kiện thực nghiệm ....................................................................................................9 Giới thiệu chung............................................................................................................10 Tiến hành thực nghiệm .................................................................................................10 Sơ đồ quá trình cô lập các hợp chất ..............................................................................11 Quá trình cô lập phân đoạn P3.1 ...................................................................................12 3. KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN ...................................................................................................13 KẾT LUẬN PHỤ LỤC i
  6. DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên .................................................................2 Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển tại Tibet ..........................................................................................................................................3 Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS .............................................................................................13 ii
  7. DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất CS so sánh với hợp chất 22-hydroxyisohopane trong dung môi chloroform-d. ................................................................................................14 Sơ đồ 2.1: Quá trình cô lập các hợp chất ..............................................................................11 iii
  8. DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT PE Petroleum ether D Doublet (Mũi đôi) Dd Doublet of doublets (Mũi đôi - đôi) S Singlet (Mũi đơn) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKC Sắc ký cột NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Hz, MHz Hertz, Megahertz ppm Part per million J Hằng số ghép 𝛿 Độ dịch chuyển hóa học 1 H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton 1H) 13 C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon 13C) iv
  9. DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1.1: Phổ 1H NMR của hợp chất CS trong dung môi chloroform-d Phụ lục 1.2: Phổ 13C NMR của hợp chất CS trong dung môi chloroform-d v
  10. LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống con người ngày càng được nâng cao nhất là nhu cầu về sức khỏe. Việc tìm kiếm và sử dụng các loại dược liệu quý với nguồn gốc từ thiên nhiên đang được quan tâm và rất phổ biến. Đông trùng hạ thảo là một trong số các dược liệu quý đó, đã được sử dụng lâu đời trong lịch sử Đông y. Đông trùng hạ thảo là một dạng kí sinh giữa loài nấm túi Cordyceps với ấu trùng của một số loài côn trùng. Ngoài ra, Đông trùng hạ thảo còn được biết đến với các ứng dụng trong y học như: điều trị ho, điều trị bệnh ở thận, suy nhược, tăng cương chức năng hệ miễn dịch,… Do vậy, việc nuôi trồng và phân tích các thành phần hoạt tính sinh học từ Đông trùng hạ thảo để thu được các hợp chất có tính ứng dụng trong các lĩnh vực đã và đang được các nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, việc nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo còn gặp nhiều khó khăn về cơ sở vật chất và kiến thức. Vì vậy, đề tài này nhằm nghiên cứu cấu trúc, khảo sát thành phần hóa học của cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis). vi
  11. PHẦN 1: TỔNG QUAN vii
  12. 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về cây Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis) 1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo (Chinese caterpillar fungus), còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay đông trùng hạ thảo, là một loại đông dược quý có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Cordyceps sinensis (thuộc nhóm Ascomycetes) trên cơ thể sâu Hepialus fabricius [1]. C. sinensis còn được gọi là “nấm sâu bướm” vì thực chất nó kí sinh trên ấu trùng (sâu non) của các loài bướm thuộc bộ Cánh vẩy [2]. Vào cuối mùa thu, các chất trên biểu bì của sâu non ngày đêm tương tác với các bào tử nấm và hình thành các sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát triển mạnh và gây chết vật chủ, sau đó hình thành quả thể, phát triển và chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu vật chủ [3]. Do đó có nó tên là Đông trùng hạ thảo vì mùa đông nấm sống trên cơ thể côn trùng, mùa hè lại phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ [4]. Nấm C. sinensis được phân loại như sau: [5] Giới: Fungi Phân giới: Dikarya Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps sinensis 1.1.2. Nguồn gốc Đông trùng hạ thảo là hiện tượng loài sâu thuộc chi Hepialus trong tổng Họ Lepidoptera (Cánh bướm) bị kí sinh bởi một loài nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis (Berk) thuộc tổng Họ Ascomycetes (Nang Khuẩn). Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus Fabricius hoặc Hepialus Armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh [1,6]. 1
  13. 1.1.3. Mô tả thực vật Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae. Hiện nay người ta đã tìm thấy hơn 680 loài trong chi Cordyceps, nhưng thuật ngữ Cordyceps thường được đề cập chính xác loài C. sinensis [7]. Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm [8]. Phần lá có hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0.3 – 0.8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn [1]. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [1]. Hình 1.1: Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 1.1.4. Phân bố Cordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo ) là một loại nấm dược liệu quý hiếm, nổi tiếng ở Trung Quốc và được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Hoa hàng ngàn thế kỷ qua. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo hay các loài thuộc chi Cordyceps phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng của môi trường. Nó phân bố rộng rãi khắp Trung Quốc, 2
  14. cao nguyên Tây Tạng, Bhutan, Nepal và vùng đông bắc Ấn Độ, ở độ cao 3500 – 5000m so với mực nước biển [4]. Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển tại Tibet Và theo một số nghiên cứu cho thấy, các loài của chi nấm Cordyceps còn được tìm thấy ở Thái Lan, Nhật Bản và Việt Nam [8]. Như vậy, có thể thấy thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài có phạm vi phân bố rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng. 1.1.5. Trồng trọt, thu hái C. sinensis được Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm hoa Kỳ xem như một loại thực phẩm chức năng [9], vì vậy nhu cầu mua bán loài nấm này trên thị trường rất phổ biến và ngày càng tăng ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên, với mức độ phổ biến của C. sinensis đã dẫn đến việc khai thác quá mức và hậu quả là sự cạn kiệt nguồn tài nguyên này trong tự nhiên [10]. Do đó, các nhà nghiên cứu đã nỗ lực tìm cách nuôi trồng C. sinesis trong môi trường nhân tạo nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất với quy mô lớn [10]. Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp nuôi cấy lên men hiện đại như công nghệ nuôi cấy trong lò phản ứng sinh học (bioreactor) [9], người ta đã có thể dễ dàng cô lập được các chủng nhân tạo từ nấm thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu của con người và góp phần bảo tồn nguồn tài nguyên thiên niên [11]. 1.2. Thành phần hóa học Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của Đông trùng hạ thảo có 17 đến 19 loại acid amin khác nhau: lipid và nhiều nguyên tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg, 3
  15. Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe... trong đó cao nhất là P [12]. Đông trùng hạ thảo còn chứa nhiều loại vitamin (trong 100 g đông trùng hạ thảo có 0.12 g vitamin B12; 19 mg vitamin A; 116.03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K...), ngoài ra còn có khoảng 25 - 30 % protein, 8% chất béo và đường mannitol [1]. Bằng các phương pháp sắc ký, phổ nghiệm, các thành phần hóa học của Cordyceps tự nhiên được phân lập bao gồm: polysaccharide, cordycepin acid, glutamic acid, acid amin, polyamines, saccharide và các dẫn xuất đường, steroid, nucleotide và nucleoside, 28 acid béo bão hòa và không bão hòa,....[1].  Polysaccharide Công trình của Xiao JH. năm 2008 về cấu trúc hóa học của polysaccharide trong nấm Cordyceps [13]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Guan đã đề ra phương pháp “Saccharide mapping” để phân tích định tính các polysaccharide trong C. sinensis [14]. J. Guan và các cộng sự cho rằng các monomer tạo thành polysaccharide trong nấm chủ yếu thông qua các liên kết (1→4)-𝛽, (1→4)-𝛼, (1→6)- 𝛼-glucosidic và (1→4)- 𝛽-D-mannosidic [15]. Một loạt các phương pháp như methyl hóa, giảm cấp Smith, aceto-giải, thủy giải trong môi trường acid và phổ NMR đã được thực hiện để xác định các đặc trưng về cấu trúc của D-glucan tìm thấy trong C. sinensis với khung sườn bao gồm các đơn vị (1→4)-D-glucosyl liên kết với nhau và một đơn vị (1→6)-D-glucosyl phân nhánh [16]. Cấu trúc của một mannoglucan trung hòa (tỉ lệ mol của các đơn vị Man và Glc là 1:9) cũng được xác định bằng các phương pháp phân tích hóa học và phổ nghiệm cho thấy nó bao gồm khung sườn 𝛼-D-glucan với các liên kết (1→4) và (1→3) và mạch nhánh là các (1→6)- 𝛼-D-mannopyranosyl liên kết với mạch chính thông qua O-6 của các đơn vị (1→3)- 𝛼-D-glucopyranosyl [17]. Từ quả thể C. sinensis, bằng cách chiết với nước nóng và phân đoạn với ethanol, người ta thu được galactomanan với cấu trúc bao gồm mạch chính mannan chứa các đơn vị (1→2)- 𝛼-D-mannopyranosyl và mạch nhánh galactosyl chứa các đơn vị (1→3), (1→5), (1→6)-D-galactofuranosyl [18]. Ngoài ra, bằng phương pháp sắc ký ghép nối đầu dò khối phổ GC-MS, thành phần các carbohydrate được chiết tách từ cả C. sinensis tự nhiên và nhân tạo đều được xác định, bao gồm 10 monosaccharide (rhamnose, ribose, arabinose, xylose, mannose, glucose, galactose, mannitol, fructose và sorbose) [18]. 4
  16. Xylose Rhamnose Arabinose Mannose Ribose Fructose Sorbose Galactose D-mannosidic  Nucleosides Nucleosides là một trong những thành phần chính trong Cordyceps. Năm 1964, 3-deoxyadenosine, cụ thể là cordycepin, được phân lập từ Cordyceps militaris [11], một loài liên quan thường được sử dụng thay thế C. sinensis. Kể từ đó, hơn 10 nucleoside và các hợp chất liên quan của nó đã được phân lập từ Đông trùng hạ thảo bao gồm: adenine, adenosine, uracil, uridine, guanine, guanosine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine, deoxyuridin [1]. R=NH2: adenine R=H: uracil guanine R=OH: hypoxanthine R=CH3: thymine 5
  17. R=NH2: adenosine R=OH: inosine cordycepin R=NHCH2CH2OH: N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine Guanosine myriocine uridine  Amio acids Tổng hàm lượng acid amin trong sợi nấm lên men được xác định là 9.23%, thấp hơn so với Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên (18.10%). Ba acid amin chính trong quả thể nấm là acid glutamic, acid aspartic, arginine, và hàm lượng của chúng lần lượt là 2.64–2.66%, 1.70–1.84% và 1.53–1.60% [1,20].  Steroid Ergosterol, một trong những thành phần hóa học từ tế bào của sợi nấm, là steroid chiếm phần lớn và được tìm thấy trong hầu hết các loại nấm [20]. Hàm lượng ergosterol trong chất nền của C. sinensis được tìm thấy là khoảng 0.92 g /L và cao hơn khoảng ba lần so với hàm lượng trong sinh khối [1]. Ergosterol 6 ergosterol peroxide
  18. Ergosteryl-3-O- 𝛽-D-glucopyranoside cereisterol 𝛽-sitosterol campesterol Stigmasterol daucosterol Cholesterol cholesteryl palmitate 7
  19.  Peptides Theo nghiên cứu, hơn 20% axit amin có thể được tìm thấy trong Cordyceps. Trong đó, một số hợp chất tiêu biểu như: Cyclodipeptides, Cordymin,...[1]. 1.3. Hoạt tính sinh học Nhiều hoạt chất trong Đông trùng hạ thảo có hoạt tính sinh học cao. Dưới đây là một số hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu:  Polysaccharides: là thành phần chủ yếu tạo nên hầu hết các hoạt tính sinh học của C. sinensis như: tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, hạ huyết áp, tăng lipid trong máu, chống ung thư và chống oxy hóa,... [21,22].  Adenosine: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể. Giúp cải thiện tuần hoàn tim mạch, giảm sinh trưởng các tế bào thoái hóa và tăng lượng oxy trong máu,... [21].  Cordycepin: có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn ngừa ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch,...[21].  Mannitol: với công dụng làm giảm mỡ, đường máu và cholesterol và phòng chống bệnh tim mạch,...[23].  Cordymin: Các peptide cordymin từ C. sinensis , có tác dụng bảo vệ thần kinh trong não thiếu máu do ức chế viêm và tăng hoạt động chống oxy hóa liên quan đến bệnh sinh bệnh, có thể được sử dụng như một tác nhân phòng ngừa tiềm năng chống lại chấn thương do thiếu máu cục bộ não [5].  Cordysinin: Năm cordysinin, A-E, từ sợi nấm của C. sinensis đã được xác định và đã được chứng minh là có hoạt tính kháng viêm và 1-(5-hydroxymethyl-2-furyl) β- carboline được chứng minh là ức chế đáng kể nhất anion superoxide thế hệ và elastase [7]. 8
  20. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM